Введение

Атопический дерматит (АД) — мультифакториальное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением, возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения. Основными факторами развития АД считаются генетическая предрасположенность, особенности иммунологического реагирования, дисфункция кожного барьера и нарушение микробиома кожи. Дефекты кожного барьера, которые могут быть генетически обусловлены и усиливаются в процессе течения заболевания, являются безусловными факторами риска формирования и тяжести течения АД у детей [1].

Барьерная функция кожи обеспечивается разными слоями кожи и их взаимодействием. Врожденные дефекты гена, кодирующего компоненты корнеодесмосом, нарушают герметичность межклеточного пространства [2].

Дефекты гена филагрина приводят к нарушению процессов кератинизации эпидермиса и образования эластичного, прочного защитного рогового слоя. Нарушается поддержание pH кожи, усиливается потеря жидкости, что способствует колонизации микробными антигенами, повышается риск сенсибилизацци и воздействия токсичных веществ. Неповрежденный липидный барьер обеспечивает нормальное соотношение протеазной и антипротеазной активности рогового слоя кожи [3].

Одной из основных причин формирования и персистирующего течения АД у детей является нарушение микробиома кожи, который тесно связан с микробиомом кишечника. Микробиом кожного покрова — это сложная динамическая система, которая играет важную роль в поддержании сохранности кожного барьера [4].

Ассоциированная с кожей лимфоидная ткань (SALT) является частью мукозальной иммунной системы. Взаимодействие компонентов микробиома кожи с иммунокомпетентными клетками SALT прямо или опосредованно приводит к активации местного и системного иммунного ответа [5].

Исследования микробиологических культур показали, что дисбиоз кожи является одной из важных особенностей кожи детей с АД [6].

В обзоре D.H. Park и соавт. (2021) обсуждены и обобщены многочисленные исследования, посвященные вопросам взаимодействия микробиома кишечника и кожи (ось «кожа — кишечник») и влияния этой связи на формирование, течение и возможности терапии АД у детей [7].

Высокое разнообразие кишечного микробиома увеличивает количество регуляторных Т-клеток (Treg), короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) и способствует формированию иммунной толерантности [8].

Дисбаланс микробиома кишечника, снижение микробного разнообразия, преобладание токсичных микроорганизмов наряду с нарушением иммунного ответа на аллергены и с дефектами кожного барьера повышают риск сенсибилизации к экзогенным неинфекционным аллергенам и развития аллергических заболеваний, в том числе АД. Механизм влияния микробиоты кишечника и кожи на развитие АД во многом сходен: индукция иммунного ответа и воспаления, выработка метаболитов, которые участвуют в повреждении кожного барьера [9].

Воспалительные изменения кожи при АД приводят к нарушению кожного барьера, способствуют изменению микробного сообщества как на пораженных, так и на интактных участках кожи ребенка. Существует порочный круг, при котором, в частности, дефицит филагрина приводит к усиленной колонизации Staphylococcus aureus, что за счет экспрессии факторов вирулентности может вызывать и усиливать воспаление, способствовать дальнейшему нарушению кожного барьера, формированию и поддержанию несбалансированного микробного сообщества кожи в целом [10].

Золотистый стафилококк у пациентов с АД за счет образования биопленки способствует обструкции экзокринных потовых желез [3]. Этот патоген колонизирует и неповрежденные участки кожи детей с АД. Более того, факторы вирулентности Staphylococcus aureus (фенолрастворимые модулины, PSM и энтеротоксины), полученные с кожи больных АД, обладают специфическим свойством вызывать воспаление в коже у организма, не имеющего генетической предрасположенности к развитию АД [11].

Снижение уровня колонизации Staphylococcus aureus с использованием топической противовоспалительной терапии, смягчающих и увлажняющих средств приводит к увеличению разнообразия микробиоты кожи и снижению частоты и тяжести обострений АД [12].

Эти многочисленные факторы, влияющие на состояние кожного барьера, повышают возможность транскутанной сенсибилизации. В отличие от пероральной сенсибилизации при транскутанной сенсибилизации происходит праймирование иммунных клеток, что в последующем повышает риск развития пищевой аллергии и АД [1].

Цель работы — на основании динамического анализа клинической картины, микробиома кожи и кишечника оценить эффективность лечения АД у детей при включении в состав наружной терапии пребиотического и пробиотического компонента.

Материал и методы

Выполнено динамическое обследование 19 детей (9 мальчиков и 10 девочек) в возрасте от 2 мес до 5 (2; 0—5) лет с АД легкой и средней степени тяжести, получающих индивидуальную гипоаллергенную диету. Всем пациентам в начале исследования и через 1 мес комплексной терапии с использованием увлажняющих средств ухода за кожей LE SANTI с биотическим комплексом (пребиотики и пробиотики: лизаты лактобактерий + пребиотики инулин и олигосахариды) выполнено клинико-лабораторное и инструментальное обследование. По окончании терапии проанализированы дневники состояния, которые включали в себя выполнение назначений и ежедневную оценку матерью динамики изменений клинических проявлений АД. Проведен расчет индекса SCORAD в 1-й и на 30-й дни исследования.

В качестве терапии выбраны эмоленты серии LE SANTI (крем липидовосстанавливающий интенсивное питание, мусс увлажняющий тройного действия, крем увлажняющий с защитой от потери влаги). Наружная терапия дополнена липидовосстанавливающим очищающим крем-гелем для мягкого очищения кожи. В состав всех средств LE SANTI входит уникальный комплекс пребиотиков и пробиотиков (биотический комплекс), содержащий лизаты лактобактерий. В качестве пребиотиков в рецептуре содержатся инулин и олигосахариды. Лизаты бактерий влияют на активацию естественных защитных механизмов кожи, включая активацию процессов врожденных механизмов иммунной системы (повышение продукции антимикробных пептидов), а также выраженно увлажняют кожные покровы и снижают их чувствительность. Благодаря наличию пребиотиков, которые выступают субстратами для метаболизма комменсальной микрофлоры, нормализуется естественный микробиом кожи. Действие пребиотических и пробиотических компонентов обеспечивает биотическому комплексу синергическое действие, что способствует усилению их физиологического эффекта. Помимо биотического комплекса в состав средств ухода за кожей LE SANTI входят хорошо изученные и зарекомендовавшие себя компоненты, такие как пантенол, масла ши и жожоба, церамиды, сквалан, гиалуроновая кислота, молочная кислота, глицерин и др. Таким образом, составы средств LE SANTI удовлетворяют все потребности атопичной кожи: восполняют ее липидный барьер, способствуют регенерации кожи, создают окклюзию и предотвращают трансэпидермальную потерю воды.

До начала всех процедур исследования законные представители каждого из участников подписали информированное согласие.

В исследование включены 20 детей.

Критерии включения в исследование:

— дети в возрасте до 5 лет с АД легкой и средней степени тяжести в периоде стихания обострения;

— подписанное информированное согласие;

— соблюдение гипоаллергенной диеты;

— ведение дневника состояния пациента.

Критерии невключения в исследование:

— использование топических глюкокортикостероидов, препаратов кальциневрина, антимикотических и антибактериальных препаратов в течение периода исследования;

— использование пребиотиков и пробиотиков per os с целью коррекции возможных дисбиотических изменений в кишечнике;

— пропуск 1 визита за время исследования.

Один пациент исключен из исследования, так как по назначению врача-педиатра начал прием пробиотического препарата per os.

Определение показателей увлажненности, pH проведено на пораженных участках кожи с признаками гиперемии, сухости (область щек, Т-зона, туловище и конечности) с использованием аппарата Multi Skin MC 750 (Германия). Исследованные показатели на пораженных участках кожи сравнивали с нормативными значениями нормальной кожи, ее возрастными особенностями. Выполнена инструментальная оценка параметров кожи в динамике — до начала применения косметических средств и на момент окончания исследования.

Анализ состава микробиома кожи в соскобе с пораженных участков и изучение кишечного микробиома при исследовании фекалий выполнены генно-молекулярными методами (ПЦР, NGS-16S-секвенирование) при включении в исследование и через 1 мес терапии.

При проведении NGS-16S-секвенирования тотальную ДНК выделяли из образцов кожи (соскоб кожи) и кала, подвергнутых гомогенизации в лизирующем растворе. Гомогенизацию проводили вместе с шариками с последующей экстракцией ДНК методом сорбентной колонки (Qiagen, Germantown) в соответствии с рекомендациями производителя. Библиотеки для секвенирования 16S ДНК готовили в соответствии с протоколом Illumina по подготовке 16S-метагеномных библиотек для секвенирования (Part #15044223 Rev. B). Для амплификации целевого фрагмента гена 16S рРНК с помощью рекомендованных праймеров для области V3—V4 использовали 5 нг общей ДНК на образец. Проводили 25 циклов ПЦР с использованием смеси KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2×) (Roche Diagnostics, Цуг, Швейцария). Далее для запуска секвенирования на платформе BGI использовали набор для конверсии библиотек Illumina MGIEasy Universal Library Conversion Kit (App-A). Биоинформатическая обработка базы данных 16S ДНК проведена с помощью собственного биоинформатического пайплайна, реализованного на языках программирования R v. 3.6 и Python 3. На первом этапе обработки последовательности праймеров обрезали для парных прочтений, а прочтения, не содержащие последовательности праймеров, удаляли. Затем удаляли прочтения с плохим качеством (Phred quality score не менее 10) и короткие прочтения (не менее 200 п.н.) и обрабатывали полученные данные с помощью конвейера DADA2 для выявления точных вариантов последовательностей.

Проведение NGS-16S-секвенирования в представленных биотопах включало оценку индексов биоразнообразия микробиоты Шеннона (разнообразие видов в сообществе, β-разнообразие, норма для кожи 3,1—4,2) и Пиелу (указывает, насколько относительная численность особей при данном количестве видов распределена в сообществе равномерно, α-разнообразие, норма для кожи более 0,4), а также изучение бактериальных сообществ по филумам, классам, семействам, родам и видам.

Статистический анализ проведен с помощью статистического программного пакета StatTech v. 4.2.6 («Статтех», Россия). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро—Уилка. Количественные показатели с нормальным распределением описывали с помощью среднего арифметического (M) и стандартного отклонения (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывали с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q₁—Q₃). Направление и тесноту корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (при нормальном распределении сопоставляемых показателей). Направление и тесноту корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при распределении показателей, отличном от нормального). При сравнении нормально распределенных количественных показателей, рассчитанных для двух связанных выборок, использовали парный t-критерий Стьюдента. При сравнении количественных показателей, распределение которых отличалось от нормального, в двух связанных группах использовали критерий Уилкоксона.

Результаты и обсуждение

Анализ анамнеза заболевания и жизни показал, что все включенные в исследование пациенты родились доношенными — 40 (39—41) нед, со средней длиной и массой тела — длина тела 50 (50—53) см, масса тела при рождении 3387±415 г. Осложненного течения беременности и родов не отмечено ни у одной матери пациента. В исследуемой популяции установлена высокая частота наследственной отягощенности по аллергическим заболеваниям (у 70%).

Динамика состояния кожных покровов и индекса SCORAD у обследованных пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Динамика клинических проявлений и индекса SCORAD у детей с АД до и после терапии

Примечание. * — различия показателей статистически значимы (p<0,05).

Установлена статистически значимая положительная динамика клинических проявлений заболевания в группе пациентов с АД на фоне соблюдения индивидуальной гипоаллергеннной диеты и ежедневного (2—3 раза в день) использования наружных средств ухода LE SANTI с биотическим комплексом. Отмечено достоверное снижение площади поражения кожных покровов, выраженности эритемы, сухости, зуда, что отразилось в положительной динамике индекса SCORAD (p<0,05).

Анализ динамической оценки влажности кожи у обследованных детей показан в табл. 2.

Таблица 2. Динамическая оценка показателя влажности кожи у детей с АД

Примечание. * — различия показателей статистически значимы (p<0,05).

Динамическая оценка влажности кожи у детей с АД на фоне комплексной терапии с применением средств наружного ухода за кожей LE SANTI с биотическим комплексом показала статистически значимое повышение влажности кожи в области щек (p=0,002) и положительную динамику повышения влажности на других участках кожи (p>0,05). Достоверное повышение влажности кожи в области щек может быть обусловлено тем, что данная зона является открытой и там обеспечивается максимальное взаимодействие препарата с кожей. Сходная динамика отмечена и при определении pH кожи (табл. 3).

Таблица 3. Динамика результатов инструментального анализа pH кожи у детей с АД

Примечание. * — различия показателей статистически значимы (p<0,05).

Уровень pH кожи является одним из основных факторов бактерицидных свойств кожи. Микробиом кожи, составляющий 18—20% всего микробиома организма, находится в прямой зависимости от pH кожи: щелочная и нейтральная среда pH провоцируют рост и распространение условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, при высоких значениях pH на пораженных участках кожного покрова отмечены более интенсивный зуд и сухость.

С помощью динамической оценки индексов Шеннона и Пиелу проведен анализ микробного α-разнообразия и β-разнообразия кожи у обследованных детей с АД.

Оценка биоразнообразия видов в микробном сообществе на пораженных участках кожи (β-разнообразие) у детей с АД с помощью индекса Шеннона до и после терапии представлена на рис. 1.

Рис. 1. Анализ динамики индекса Шеннона на пораженных участках кожи детей с АД до и после лечения (n=19).

Как видно из рис. 1, при анализе индекса Шеннона у обследованных детей с АД после терапии с включением пребиотиков и пробиотиков в состав наружной терапии (LE SANTI) отмечается увеличение β-биоразнообразия и видов микробиоты кожи в сообществе, что является важным показателем оптимального функционального состояния кожных покровов.

Анализ динамики α-разнообразия и относительной численности бактерий между видами в микробном сообществе при оценке индекса Пиелу на пораженных участках кожи до и после терапии представлен на рис. 2.

Рис. 2. Анализ динамики индекса Пиелу на пораженных участках кожи детей с АД до и после лечения (n=19).

При анализе индекса Пиелу у обследованных детей с АД на фоне терапии с включением пребиотиков и пробиотиков в состав наружной терапии (LE SANTI) отмечается увеличение α-биоразнообразия микробиоты кожи, что также является важным показателем оптимального функционального состояния кожи.

В табл. 4 представлена корреляционная взаимосвязь условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, выделенных с пораженных участков кожи, и индексов биоразнообразия микробиоты кожи у детей с АД до проведенного лечения.

Таблица 4. Роль условно-патогенных микроорганизмов в снижении биоразнообразия микробиоты кожи у детей с АД до лечения (n=19)

Примечание. * — Staphylococcus aureus/capitis/caprae/epidermidis/haemolyticus/saprophyticus/warneri.

Как видно из табл. 4, наблюдается достоверная отрицательная корреляционная связь между процентным содержанием условно-патогенных и патогенных бактерий семейства Staphylococcaceae (в том числе видов Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus и др.), рода Streptococcus, обладающих провоспалительным потенциалом, и индексами биоразнообразия Шеннона и Пиелу. Таким образом, при увеличении содержания данных патогенных микроорганизмов на пораженных участках кожи происходило снижение внутривидового и межвидового биоразнообразия микробиоты.

Таблица 5. Взаимосвязь индекса SCORAD и микробиоты на пораженных участках кожи у детей с АД после лечения (n=19)

Снижение количества золотистого стафилококка как одного из триггеров возникновения и поддержания воспаления на коже при АД можно рассматривать в качестве профилактики данного заболевания [10].

Как было показано в табл. 1, у пациентов на фоне лечения происходило достоверное снижение значений индекса SCORAD. Выявленная взаимосвязь между значениями индекса SCORAD и микробиотой на пораженных участках кожи после использования в наружной терапии линейки увлажняющих средств ухода за кожей LE SANTI с биотическим комплексом представлена в табл. 5.

Как следует из представленных результатов, получена достоверная отрицательная корреляционная связь между индексом SCORAD и филумом Actinobacteriota (представители нормальной микробиоты кожи, обладающие противовоспалительным потенциалом), а также достоверные положительные прямые корреляционные связи между индексом SCORAD и процентным содержанием филума Bacteroidota, класса Bacteroidia, класса Clostridia, семейства Prevotellaceae, семейства Peptostreptococcales, рода Prevotella (к данным таксонам относится ряд условно-патогенных микроорганизмов с провоспалительными свойствами) у детей с АД после проведенной наружной терапии с включением линейки LE SANTI с биотическим комплексом. Продемонстрировано, что при уменьшении площади поражения кожи происходило повышение содержания представителей нормальной микробиоты кожи (Actinobacteriota) и снижение уровня ряда условно-патогенных микроорганизмов, в первую очередь представителей класса Clostridia, семейств Prevotellaceae, Peptostreptococcales и рода Prevotella.

Показано также, что по мере уменьшения процентного содержания рода Streptococcus на пораженных участках кожи после лечения достоверно повышался индекс α-разнообразия микробиоты Пиелу (ρ= –0,9; p=0,037).

На рис. 3 представлен сравнительный анализ оценки индексов биоразнообразия Шеннона и Пиелу на коже и в кишечнике у детей с АД до проведения лечения.

Рис. 3. Взаимосвязь α-биоразнообразия и β-биоразнообразия микробиоты кожи и кишечника у детей с АД до лечения (n=19).

Перед началом применения наружной терапии АД с биотическим комплексом была выявлена статистически значимая положительная корреляционная связь между индексами Шеннона и Пиелу на пораженных участках кожи и в кишечнике соответственно, то есть при снижении микробного биоразнообразия на коже наблюдалось снижение микробного биоразнообразием в кишечнике, что подтверждает наличие оси «кожа — кишечник». Безусловно, полученные предварительные результаты в небольшой группе пациентов требуют дальнейшего изучения механизмов взаимного влияния данных микробных биотопов друг на друга при АД.

В свою очередь, на фоне проведенной терапии не было получено достоверной положительной корреляционной взаимосвязи по индексам Шеннона (rxy= –0,083; p=0,894) и Пиелу (rxy=0,1; p=0,873) между микробными биотопами «кожа — кишечник», что требует наряду с воздействием наружной пребиотической и пробиотической терапии на микробиоту кожи назначения пробиотической терапии per os для коррекции дисбиоза кишечника.

Заключение

Терапия АД у детей с использованием наружных средств ухода LE SANTI с биотическим комплексом позволила достичь положительных изменений функциональных показателей (влажность, pH) и микробиома кожи, получен отчетливо положительный клинический эффект. Проведенное исследование указывает на целесообразность дополнения наружной пребиотической и пробиотической терапии пероральными пробиотическими препаратами для коррекции сопутствующих и патогенетически связанных дисбиотических изменений в кишечнике.

Изучение микробиома кожи у детей с АД на фоне терапии с применением дерматокосметики LE SANTI с комплексом пребиотиков и пробиотиков показало увеличение биоразнообразия микробиоты как важного показателя оптимального функционального состояния кожных покровов. Таким образом, улучшение функциональных показателей и микробиома кожи способствует уменьшению дефектов барьерной функции кожи, что имеет фундаментальное значение в развитии и прогрессировании тяжести АД.

В последние годы все больше исследований посвящается значимости транскутанной сенсибилизации в формировании и течении пищевой аллергии у детей. Воздействие пищевых аллергенов через кожный барьер обходит механизмы развития оральной толерантности, и, когда кишечник подвергается воздействию пищевых аллергенов, предшествующий опыт сенсибилизации теми же аллергенами кожным путем приводит к более выраженным симптомам АД.

Возможность и интенсивность транскутанной сенсибилизации напрямую зависит от состояния барьерной функции кожи. Обсуждается роль эмолентов в создании защитной пленки при врожденных дефектах кожного барьера и в препятствовании проникновению аллергена, что может снижать риск развития сенсибилизации. Однако результаты исследований, посвященных профилактическому эффекту эмолентов, неоднозначны.

В связи с этим кажется логичным предположить, что использование в комплексном уходе за кожей детей с отягощенной наследственностью по аллергическим заболеваниям дерматокосметики LE SANTI с биотическим комплексом из пребиотических и пробиотических компонентов может способствовать снижению риска транскутанной сенсибилизации, то есть может входить в комплекс известных профилактических мероприятий.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Концепция и дизайн исследования — Н.А. Иванова, А.М. Шабалов, Г.А. Кузьмина

Сбор и обработка материалов — А.В. Ильичева, А.М. Шабалов, В.В. Дудурич

Статистическая обработка — А.М. Шабалов, В.В. Дудурич

Написание текста — Н.А. Иванова, А.В. Ильичева, А.М. Шабалов

Редактирование — Н.А. Иванова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The contribution of the authors. All the authors made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication.

The concept and design of the study — N.A. Ivanova, A.M. Shabalov, G.A. Kuzmina

Collecting and interpreting the data — A.V. Ilicheva, A.M. Shabalov, V.V. Dudurich

Statistical analysis — A.M. Shabalov, V.V. Dudurich

Drafting the manuscript — N.A. Ivanova, A.V. Ilicheva, A.M. Shabalov

Revising the manuscript — N.A. Ivanova