Введение

Сифилис — хроническая инфекция, вызываемая бледной трепонемой (T. pallidum), которая обладает высокой нейротропностью и может вызывать поражение центральной нервной системы (ЦНС) практически на любой стадии инфекции. В первую очередь в процесс вовлекаются мозговые оболочки, сосуды головного и спинного мозга, при этом нервная ткань вовлекается в процесс вторично (нейросифилис — НС, мезенхимный). Выделяют ранний НС, при котором поражение нервной системы происходит в течение первых 5 лет с момента инфицирования, и поздний НС, характеризуемый развитием патологического процесса в ЦНС спустя 5 лет и более после инфицирования. При данной форме заболевания поражается в основном нервная ткань на различных ее уровнях (паренхиматозный НС), что может привести к развитию спинной сухотки и прогрессивного паралича.

В последние годы с ростом распространенности сифилиса во многих странах мира также заметно увеличивается заболеваемость НС, особенно среди пациентов с серорезистентностью [1]. Многие авторы называют учащение поражения нервной системы одним из основных признаков современного течения сифилиса [2–5].

В Российской Федерации в последние десятилетия, по официальным статистическим данным, на фоне снижения общей заболеваемости сифилисом отмечено увеличение удельного веса НС (рис. 1).

Рис. 1. Динамика заболеваемости нейросифилисом в Российской Федерации (2002—2021 гг., количество случаев).

При этом особенно значимый подъем заболеваемости НС наблюдался с 2010 по 2012 г. и был обусловлен в основном поздними формами НС, в то время как уровень раннего НС оставался практически неизменным. Интересно, что пик заболеваемости НС наблюдался через 15 лет после хорошо всем известного пика эпидемии заболеваемости сифилисом в СССР в 1997 г., что соответствует описанным срокам развития данной патологии [6] и может рассматриваться как последствие наблюдавшейся в 1990-х годах эпидемии. С 2013 г. уровень заболеваемости поздним НС существенно снизился, что не в последнюю очередь было обусловлено активизацией борьбы с распространением данной формы инфекции и изданием соответствующих приказов и инструкций на федеральном и местном уровне, особенно приказа и инструкции Департамента здравоохранения г. Москвы, касавшихся непосредственно больных НС [7–9]. Вместе с тем после 2013 г. и вплоть до 2019 г. уровень заболеваемости поздним НС и всеми формами НС (ранним и поздним) был значительно (в 1,5–3,7 раза) выше, чем в 2002–2010 гг., что позволяет говорить о значимости данной формы инфекции и актуальности ее своевременного выявления.

Трудность постановки диагноза НС, подразделяемого на НС с симптомами, асимптомный и неуточненный, заключается в том, что симптомы НС зачастую неспецифичны, а «золотой стандарт» — методология, с помощью которой можно однозначно верифицировать клинический диагноз НС, отсутствует.

Отличием диагностики НС от других форм и стадий сифилиса является необходимость наряду с исследованиями сыворотки крови анализировать состояние цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), называемой также спинномозговой жидкостью или ликвором.

Прямые методы исследования в диагностике нейросифилиса

Целесообразность применения для диагностики НС прямых методов исследования ЦСЖ, направленных на выявление возбудителя сифилиса либо его генетического материала, до сих пор спорная. Низкая концентрация возбудителя T. pallidum в ЦСЖ не обеспечивает достаточную эффективность темнопольной микроскопии [10, 11], это касается и полимеразной цепной реакции (ПЦР) — метода, на который возлагались большие надежды.

Первое сообщение о применении ПЦР для выявления специфических последовательностей ДНК патогенных трепонем в ЦСЖ относится к 1990 г. [12]. Однако до настоящего времени вопрос о целесообразности использования данного метода для диагностики НС остается спорным. Так, по данным P. García и соавт. [13], C. Vanhaecke и соавт. [14], чувствительность теста у больных НС при 100% специфичности составляет всего 42–50%. В качестве мишени в исследовании использовался ген tpp47.

По данным R. Castro и соавт. [15], применявших в своих исследованиях в качестве мишени как ген tpp47, так и ген polA, ПЦР может быть использована для диагностики НС; при этом 47-ПЦР демонстрирует более высокую чувствительность, а polA-ПЦР — более высокую специфичность.

Метода ПЦР, одобренного международным сообществом для выявления T. pallidum, в настоящее время не существует [16], хотя в Российской Федерации есть зарегистрированные тест-системы, разрешенные к медицинскому применению. Вместе с тем ПЦР-исследования для обнаружения T. pallidum в ЦСЖ показали низкую чувствительность и субоптимальную специфичность [14, 17], в связи с чем ПЦР при диагностике НС в Российской Федерации не регламентирована.

По мнению исследователей, недостаточно высокие чувствительность и специфичность ПЦР при диагностике НС связаны:

— с тем, что ДНК T. pallidum может содержаться в ликворе в количествах, недостаточных для их обнаружения методом ПЦР;

— с наличием неспецифических ингибиторов амплификации;

— с трудностью интерпретации результатов ПЦР после лечения — даже при условии гибели возбудителя его генетический материал сохраняется в ЦСЖ неопределенно долго.

Вместе с тем ряд авторов получили обнадеживающие результаты при использовании для исследования ликвора при НС так называемой гнездной, или вложенной, ПЦР (nPCR). Так, C. Vanhaecke и соавт. [14] получили положительный результат nPCR в ЦСЖ больных НС в 42% случаев, тогда как VDRL показала всего 30% положительных результатов. Эти данные свидетельствуют о том, что nPCR имеет потенциальную ценность для диагностики НС. Показано также, что ПЦР может быть использована для обнаружения ДНК T. pallidum в ЦСЖ больных сифилисом, инфицированных ВИЧ [15, 18].

Традиционно эталонным методом прямого обнаружения T. pallidum считался тест на инфицирование кроликов биологическим материалом, полученным от больного сифилисом (Rabit infectivity test, RIT). Постановка RIT с ЦСЖ давала прямые доказательства инвазии T. pallidum в ЦНС [19]. Однако из-за длительности, дороговизны и трудоемкости данный тест не нашел широкого применения в повседневной клинической практике.

«Золотой стандарт» микробиологической диагностики — культуральный метод для исследования ЦСЖ — не использовали, поскольку до последнего времени считалось невозможным культивировать бледную трепонему на питательных средах. В 2018 г. американские исследователи S. Norris и D. Edmondson [20] предложили систему длительного культивирования T. pallidum в культуре эпителиальных клеток американского кролика Sf1Ep in vitro в среде TpCM-2 при 34 °C в микроаэробной атмосфере, содержащей 1,5% O₂ и 5% CO₂. Полученные авторами результаты открывают перспективу использования данного метода прежде всего для трансформации, селекции и получения новых рекомбинантных антигенов T. pallidum и экспериментального изучения новых антимикробных препаратов для лечения сифилиса. Однако из-за длительности выполнения и трудоемкости данный тест вряд ли может быть применен в рутинной диагностике НС.

Таким образом, на настоящий момент использование прямых способов обнаружения T. pallidum в ЦСЖ ограничено, в связи с чем основой для диагностики НС остаются непрямые иммунологические методы, выявляющие антитела, определяемые в нетрепонемных (НТТ) и трепонемных (ТТ) тестах.

Нетрепонемные тесты

Наиболее часто используемой НТТ для диагностики НС в России является реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой (РМП), в России и за рубежом — тест на быстрые плазменные реагины (Rapid Plasma Reagins RPR), тест Исследовательской лаборатории венерических заболеваний (Venereal Disease Research Laboratory, VDRL), за рубежом, помимо этого, — тест с толуидиновым красным без подогрева сыворотки (Toluidine red unheated serum test, TRUST) и тест с непрогретыми реагинами сыворотки (Unheated Serum Reagins, USR).

Современные НТТ — это тесты на преципитацию, выявляющие антитела-реагины к стандартизованному антигену нетрепонемного происхождения, представляющему собой кардиолипин-холестерол-лецитиновый комплекс [21].

Ввиду низкой чувствительности НТТ с ликвором их отрицательный результат не исключает НС. По мнению ряда экспертов, при диагностике НС наиболее специфичным НТТ является VDRL [11, 22, 23], в связи с этим он позиционируется как предпочтительный НТТ для диагностики НС ведущими мировыми клиническими рекомендациями как в России, так и за рубежом [16, 24, 25].

Трепонемные тесты

В ТТ в качестве антигена используются цельноклеточные живые или фиксированные T. pallidum либо созданные с помощью генной инженерии рекомбинантные белки или синтетические пептиды T. pallidum [26, 27].

Основными ТТ, рекомендуемыми в настоящее время для исследования ЦСЖ и верификации НС, являются реакция иммунофлюоресценции (РИФ, Fluorescent Treponemal Antibody, FTA), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА, Treponema pallidum haemagglutination assay, TPHA) и иммуноферментный анализ (ИФА, или Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA).

Исследование ЦСЖ в РИФ может осуществляться как в варианте РИФ_абс (включает этап адсорбции перекрестно реагирующих антител путем использования непатогенных трепонем штамма Рейтера), так и с цельным ликвором, без его предварительного разведения (РИФ_ц) [26, 27]. Чувствительность РИФ при тестировании ЦСЖ составляет 90,9–100%, а специфичность — 100% [28, 29].

Основным недостатком РИФ является ее субъективность, основанная на визуальной оценке характера свечения объекта и интенсивности флюоресценции.

РИФ_ц уступает методам с автоматическим обеспечением, например ИФА. Существуют автоматизированные системы для учета данной реакции [30], но в России они используются редко. Вместе с тем РИФ_ц обладает высокой чувствительностью при исследовании ликвора, поэтому может быть рекомендована для диагностики НС при всех его формах [31]. Считается, что РИФ менее специфична для НС, чем VDRL, но очень чувствительна, поэтому отрицательные результаты РИФ с ликвором предлагается оценивать как надежное свидетельство отсутствия НС, тогда как РИФ-позитивность лишь означает его вероятность [32, 33].

В настоящее время на роль наиболее доступной и надежной специфической реакции для ликвородиагностики НС претендует РПГА, в которой применяются эритроциты животных с адсорбированными на них антигенами — как правило, рекомбинантными белками бледной трепонемы [11, 34–36].

В РПГА могут быть также использованы искусственные полимеры: частицы латекса, хитина, полиакриламида и др.; в этом случае она называется T. pallidum particle agglutination assay (TPPA), а поскольку на этих полимерах нет собственных антигенов, обусловливающих биоактивность, такие наборы более совершенны. Показана наиболее высокая из числа ТТ чувствительность TPPA при диагностике НС [37]. В России в 1990-х годах была создана тест-система TPPA на основе желатиновых частиц, продемонстрировавшая высокую эффективность при диагностике сифилиса [38].

Недостатки РПГА: оценка результатов проводится в ручном режиме, что требует профессионализма исследователя; субъективизм оценки результатов реакции не позволяет исключить ошибки при ее интерпретации.

Известны российские и зарубежные разработки, позволяющие осуществлять автоматический учет результатов РПГА, например программно-аппаратный комплекс Эксперт-Лаб, разработанный ООО «Синтэко-Комплекс» при участии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН [39], однако широкого применения в рутинной лабораторной диагностике сифилиса, как, например, ИФА, он пока не получил.

Чувствительность РПГА при ликвородиагностике НС составляет 75,6–95%, а специфичность — 85,5–100% [37, 40–43]. Вместе с тем считается, что НС при отрицательном результате РПГА маловероятен [44].

Одним из современных подходов к использованию РПГА, в частности варианта TPPA, в диагностике НС считается определение титра антител к T. pallidum. Так, в Руководстве BASHH¹ [45] диагноз НС рекомендуется устанавливать на основании выявления клинических симптомов, количества клеточных элементов в ликворе более 5 клеток/мкл, белка более 0,45 г/л, позитивных результатов VDRL и титра TPPA более 1:320. Согласно данным C. Marra и соавт. [40], простым и доступным критерием, который может использоваться в диагностике НС в качестве свидетельства наличия интратекальной продукции противотрепонемных антител, является титр РПГА/TPHA/TPPA 1:640 и более, диагностическая специфичность которого составляет 93–94%.

Одним из распространенных ТТ, используемых при ликвородиагностике НС, является ИФА. В Российской Федерации в соответствии с приказом Минздрава №87 и современными российскими клиническими рекомендациями ИФА внедрен в ликвородиагностику сифилиса с 2001 г. [24, 46]. Чувствительность реакции при исследовании ликвора у больных НС составляет, по данным разных авторов [37, 43], 53,8–98%, специфичность — 96,8–100%. Вместе с тем следует отметить, что при тестировании ЦСЖ, как правило, используются тест-системы на суммарные (IgM/IgG) антитела или IgG-антитела к рекомбинантным белкам T. pallidum (таким как TpN15, TpN17 и TpN47). Поскольку антитрепонемные IgG-антитела могут преодолевать гематоэнцефалический барьер и пассивно попадать в ЦСЖ, их показатели при диагностике НС являются спорными [42].

Тесты, направленные на отдельное определение IgM в ЦСЖ, российскими специалистами практически не используются, хотя, по данным ряда зарубежных исследований, выявление антитрепонемных IgM в ликворе признается убедительным доказательством локального синтеза антител в ЦНС и, следовательно, НС [11, 47–49]. Работы, посвященные роли IgM в диагностике НС, крайне немногочисленны и содержат противоречивые данные, и если в одних указывается на важную роль оценки иммуноглобулинов этого класса у всех пациентов [50], то в других приводятся данные, демонстрирующие ложноотрицательные результаты, особенно при асимптомном НС [51, 52]. Некоторые авторы отмечают, что при синтезе антител в ЦСЖ концентрация IgM в ЦСЖ в 3–75 раз выше, чем в крови [53]. Другие авторы указывают на то, что локальный синтез IgM обнаруживается у 28–29% больных НС, а наличие IgM в ликворе больного НС всегда свидетельствует о манифестном НС [54].

Одной из разновидностей ИФА является метод иммуноблоттинга (ИБ) — линейный вариант ИФА. Показана возможность использования ИБ при диагностике НС. Разработан реверсивный алгоритм его применения (рис. 2), который вошел в действующие в РФ клинические рекомендации по сифилису [55, 56].

Рис. 2. Алгоритм исследования ЦСЖ современными иммунологическими тестами для диагностики нейросифилиса.

Алгоритм включает последовательное применение современных методов ИФА/ИБ, НТТ и РПГА. Тестирование начинается с исследования ликвора пациента методами ИФА или ИБ. При отрицательном результате с высокой степенью вероятности может быть сделан вывод об отсутствии у пациента НС. При положительном результате ИФА/ИБ проводится исследование с помощью одного из НТТ. Если ИФА/ИБ и НТТ дают положительный результат, больному ставят диагноз НС и дальнейшее тестирование прекращают. Если НТТ дает отрицательный результат, проводится тестирование ликвора с помощью второго высокочувствительного и специфичного ТТ — РПГА. При положительном результате РПГА делается вывод о наличии у больного НС, при отрицательном — об отсутствии у пациента НС и ложноположительном результате первого ТТ.

Однако следует отметить, что, обладая высокими чувствительностью и специфичностью, метод ИБ не позволяет проводить большое количество исследований на одном иммуносорбенте, отличается субъективностью интерпретации результатов, что несколько ограничивает его применение.

Самой первой из предложенных трепонемных реакций явилась реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ, РИТ, TPI — Treponema pallidum immobilization test). При диагностике НС РИТ высокоспецифична, но наименее чувствительна из числа других ТТ. Ее положительный результат в ЦСЖ подтверждает, а отрицательный — не опровергает наличие НС, в связи с чем данная реакция не может быть использована в ликвородиагностике НС как единственный тест, но может применяться одновременно с другими ТТ [57]. Ввиду сложности и трудоемкости постановки эта реакция в настоящее время не применяется для диагностики сифилиса и НС во многих странах мира, но оставлена в клинических рекомендациях РФ для диагностики скрытых, поздних форм сифилиса, в том числе НС.

Клинические и биохимические методы исследования ЦСЖ

Определение количества лейкоцитов и общего белка в ЦСЖ является традиционным лабораторным подходом к диагностике НС, хотя и неспецифично для НС: чем больше лейкоцитов и чем выше уровень общего белка в ЦСЖ пациентов с НС, тем хуже прогноз [58]. Большинство клеток в ЦСЖ относится к лимфоидному ряду, а резко выраженный лимфоцитоз отмечен при НС и вирусных заболеваниях. Нормальными показателями являются: плеоцитоз не более 5 клеток/мм³, протеинархия не более 0,4 г/л [59]. Среди лиц с ВИЧ-инфекцией количество лейкоцитов в ЦСЖ может быть повышено (>5 в 1 мм³). Использование для диагностики НС более высокого порогового значения (>20 лейкоцитов в 1 мм³) может улучшить специфичность диагностики НС среди этой популяции [60].

Следует отметить, что данные, свидетельствующие об одновременном обнаружении гиперпротеинархии, плеоцитоза и положительных результатов НТТ у пациентов с установленным клиническим диагнозом НС (так называемая триада Merritt, 1946), встречаются весьма редко [61, 62]. Сообщается о низкой специфичности рутинных клеточно-белковых показателей ЦСЖ, сочетающихся с недостаточной чувствительностью, не превышающей 20–60% [63]. Более того, существует мнение, что количество клеток и концентрация белка в ЦСЖ как при раннем, так и при позднем НС, могут быть в норме [61, 64].

Заключение

Как показывают приведенные данные, на настоящий момент использование прямых способов обнаружения T. pallidum в ЦСЖ ограничено. Абсолютным приоритетом при диагностике НС путем исследования ЦСЖ «классическими» методами продолжают оставаться такие показатели, как цитоз, белок и результаты иммунологических тестов.

При положительном результате НТТ в ЦСЖ диагноз НС считается подтвержденным, независимо от наличия клинической симптоматики. Отрицательный результат НТТ не исключает диагноз НС ввиду их низкой чувствительности с ликвором. При отрицательном результате НТТ в ЦСЖ, независимо от наличия клинической симптоматики, диагноз НС подтверждается сочетанием положительных результатов ТТ с повышенным содержанием белка и/или плеоцитозом, которые не могут быть обусловлены другими заболеваниями.

ТТ в ЦСЖ играют важную роль в диагностике НС и характеризуются высокой чувствительностью, но относительно низкой специфичностью. При постановке диагноза НС положительные результаты ТТ необходимо оценивать вместе с клиническими проявлениями, а также с результатами НТТ (в частности, VDRL), количеством лейкоцитов и белка в ЦСЖ. В случаях отсутствия плеоцитоза и гиперпротеинархии положительные результаты ТТ в ЦСЖ не позволяют подтвердить диагноз НС, а лишь отражают факт инфицированности организма; отрицательный результат ТТ с ликвором исключает диагноз НС.

Специфичность ТТ РПГА в диагностике НС может быть повышена за счет применения варианта реакции с использованием искусственных полимеров в качестве носителя антигена (TPPA) и при оценке титра реакции выше 1:320 и даже 1:640. Показана возможность применения при тестировании ЦСЖ метода иммуноблоттинга и основанного на его использовании реверсивного алгоритма. Отмечено, что целесообразность применения для диагностики НС тестов на наличие в ЦСЖ трепонемоспецифических IgM окончательно не установлена, что определяет возможное направление научных исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Н.Н. Потекаев, Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго

Поиск источников литературы — Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго, Т.С. Махновская, А.В. Жданович

Написание текста — Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго, Н.В. Китаева, Т.С. Махновская

Редактирование — Н.В. Фриго, О.В. Доля

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — N.N. Potekaev, G.A. Dmitriev, N.V. Frigo

Literature search — G.A. Dmitriev, N.V. Frigo, T.S. Mahnovskaya, A.V. Zhdanovich

Drafting the manuscript — G.A. Dmitriev, N.V. Frigo, N.V. Kitaeva, T.S. Mahnovskaya

Revising the manuscript — N.V. Frigo, O.V. Dolya

¹¹ BASHH — Британская ассоциация сексуального здоровья и ВИЧ (British Association for Sexual Health and HIV).