Введение

Оспа обезьян (mpox) — особо опасное зоонозное природно-очаговое вирусное заболевание. У человека характеризуется тяжелым течением, сопровождающимся лихорадкой, общей интоксикацией, папуло-везикулярными высыпаниями на коже и слизистых оболочках, уровень смертности достигает 10% [1]. Возбудителем заболевания является вирус оспы обезьян (MPXV) рода Orthopoxvirus, генетически близкий к вирусу натуральной оспы [2].

Первый случай заражения MPXV человека был зафиксирован в 1970 г. в Заире, далее вспышки регистрировались в основном среди населения эндемичных регионов Центральной и Западной Африки. Различают две клады MPXV — клада I распространена в Центральной Африке, в бассейне Конго, клада II распространена преимущественно в Западной Африке. Известно, что с MPXV клады I связан более высокий уровень летальности (1—10%) по сравнению с вирусом клады II (1,4—3%) [3].

В 2022 г. mpox начала стремительно распространяться по Европе, Северной и Южной Америке, другим регионам, в связи с чем ВОЗ была объявлена чрезвычайная ситуация международного значения на период с июля 2022 г. до мая 2023 г. Данная вспышка была вызвана MPXV генетической клады II и, по данным Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC), начиная с 2022 г. в мире было зарегистрировано в общей сложности более 102 000 случаев оспы, вызванной этим вирусом, более 220 человек скончались. С момента достижения пика заболеваемости в 2022 г. число случаев снижалось, и в 2024 г. зарегистрировано только 9000 случаев mpox клады II [4].

Однако в 2024 г. новая вспышка mpox, связанная с MPXV клады Ib, началась в Демократической Республике Конго (ДРК) и распространилась на близлежащие страны, включая Бурунди, Центральноафриканскую Республику, Республику Конго, Руанду, Уганду, Кению и Нигерию. В результате данной вспышки на африканском континенте в 2024 г. зафиксировано более 31 000 случаев и около 1000 летальных исходов. Только малая часть всех предполагаемых случаев (9% в 2023 г., 40% в 2024 г.) были протестированы и подтверждены лабораторно [5]. В Камеруне были одновременно зарегистрированы случаи mpox, вызванные вирусами клады I и клады II [6].

С августа 2024 г. ВОЗ объявила вспышку mpox чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение, отметив, что необходимы скоординированные международные меры реагирования, чтобы остановить распространение mpox.

Как уже упоминалось, клада I MPXV распространена в Центральной и Восточной Африке и включает в себя субкладу Ia и недавно идентифицированную субкладу Ib. Пациенты заражались вирусом клады Ia через прямые контакты с инфицированными животными, потребление мяса или при бытовых контактах; большая часть случаев в 1980—1985 гг. зарегистрирована среди детей младше 15 лет [7]. Вирусы субклады Ib были выявлены в восточной части ДРК и распространялись преимущественно половым путем, в основном в группе мужчин, имеющих секс с мужчинами. На сегодняшний день завозные случаи mpox, вызванной кладой I MPXV, также выявлены в Индии, Швеции, Таиланде и Пакистане [8].

Вирусы клады II также подразделяют на две субклады — IIa, включающую исторический штамм hMpxV/Liberia/CDC-184/1970, выделенный из человека в 1970 г. (Либерия, Западная Африка), и IIb, распространившуюся с 2022 г. по разным континентам и вызвавшую глобальную эпидемию оспы обезьян.

В России первый случай заражения mpox выявили у человека, вернувшегося из поездки по странам европейского континента, 12 июля 2022 г. На 9 октября 2024 г. общее число зарегистрированных лабораторно подтвержденных случаев mpox в России составляет три человека. Летальных случаев в России не было зарегистрировано, ситуация продолжает оставаться стабильной, однако не исключается потенциальная опасность завоза mpox на территорию нашей страны по мере развития туризма, особенно в направлении эндемичных стран [4].

Традиционные методы диагностики MPXV

Прямая визуальная идентификация вирусных частиц в отделяемом материале пораженных участков кожи с помощью электронной микроскопии являлась важным компонентом лабораторной диагностики ортопоксвирусов до разработки высокочувствительных методов амплификации нуклеиновых кислот. Данный метод микроскопии с негативным окрашиванием широко применялся до полной ликвидации натуральной оспы в 1980 г. [9].

Для изоляции и культивирования MPXV используют различные линии клеток (HeLa, Vero, BSC-1 и RK-13), восприимчивые к ортопоксвирусам. При культивировании MPXV в клетках Vero пораженные клетки становятся заметны примерно в течение 24 ч, вирусные частицы при этом можно идентифицировать с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания со специфическими антителами [10].

В настоящее время традиционные методы устарели или не используются для рутинного выявления MPXV, они применяются только в научной деятельности.

Иммунологические методы исследования

Иммунологические методы диагностики MPXV являются косвенными, поскольку они направлены на выявление специфических антител IgM/IgG или антигенов MPXV, а не на обнаружение вирусной ДНК.

Достаточно широкое распространение для диагностики осповирусной инфекции на местах получили тесты, основанные на иммунохроматографическом выявлении вирусных антигенов. Данные тесты не требуют лабораторного оснащения и зачастую могут быть выполнены в формате «у постели больного». Примерами таких тестов, имеющих статус CE-IVDD, являются Monkeypox Virus Antigen Rapid Test (Китай), RADI Monkeypox Ag Rapid Test (Корея), Monkeypox Ag Rapid Test (Польша), Monkeypox Virus Antigen Rapid Test Kit (США) и многие другие. На платформе Foundation for Innovative New Diagnostics [11] на сегодняшний день представлены данные о 71 иммунотесте для выявления антигенов MPXV. Производители зачастую не указывают аналитические характеристики данных тестов, однако известно, что, несмотря на преимущества быстрого получения результата, чувствительность метода невысока. Так, тест Orthopox BioThreat Alert позволяет выявлять ортопоксовирусы только в концентрациях выше 10^6—10⁷ БОЕ/мл [12]. Более высокую чувствительность показал тест ABICAP, основанный на иммуно-фильтрационном методе в колонке, позволяющий выявить ортопоксовирусы при содержании до 10⁴ БОЕ/мл [13].

Экспресс-тест для выявления патогенных ортопоксвирусов (натуральной оспы, оспы обезьян, коров и др.) в клиническом материале и пробах окружающей среды был разработан также ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (РФ), заявленная чувствительность составила 10³—10⁴ БОЕ/мл [14]. Однако данный тест не зарегистрирован как медицинское изделие, поэтому может применяться для диагностики только производителем (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) согласно ФЗ №128-ФЗ от 30.04.2021.

Серологическое тестирование для определения уровня антител может применяться как для диагностики MPXV, так и для мониторинга защитного титра антител. По литературным данным, IgM могут быть обнаружены в крови пациента через 5 дней после заражения, а IgG — через 8 дней [15]. В настоящий момент производятся лабораторные ИФА-тесты для выявления как IgM, так и IgG (Mpox Virus E8L Protein Human IgG ELISA Kit, Human Monkeypox Virus IgM ELISA Kit и др.) [11].

Более активно для определения уровня антител используют иммунохроматографические тесты, так как они позволяют осуществить диагностику вне лаборатории. Известно достаточное количество тестов разных производителей, имеющих статусы CE/IVDD, например Monkeypox IgG/IgM Rapid Test Cassette, Monkeypox IgG/IgM Rapid Test Kit Colloidal gold Assay, Monkeypox Virus IgM/IgG Antibody Rapid Test Kit, Monkeypox IgG/IgM Rapid Test Cassette и др. [11]. При интерпретации результатов серологических тестов необходимо учитывать возможность перекрестных реакций с антителами против других ортопоксвирусов, вызванных в том числе и предшествующей вакцинацией против натуральной оспы [15].

Молекулярные лабораторные методы

Согласно рекомендациям ВОЗ, предпочтительным методом для лабораторной диагностики MPXV является полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) [16]. ПЦР относится к прямым методам исследования и обладает преимуществом перед иммуноферментным анализом (ИФА), поскольку способна выявлять вирусную ДНК на ранних стадиях заболевания. Кроме того, ПЦР имеет преимущество перед иммунохроматографическим анализом благодаря своей высокой чувствительности [17].

Наиболее часто в качестве генов мишеней для детекции ДНК вируса оспы обезьян используют гены F3L, B6R, B7R, G2R, E9L, N3R и ген TNF-рецептора [18, 19, 20]. Последовательности этих генов в достаточной степени различаются у разных видов ортопоксовирусов. Для дифференциации генетических клад I и II MPXV молекулярными методами часто используют рецептор фактора некроза опухоли (TNFR, также известный как J2R) и гены комплементсвязывающих белков (например, ген C3L/D14L, отсутствующий у вирусов клады II) [21, 22].

В настоящий момент на ресурсе https://finddx.shinyapps.io опубликована информация о 110 ПЦР-тестах для лабораторной диагностики оспы обезьян, из них в 45 тестах заявлено использование в качестве мишени гена F3L [11]. В 29 тестах разработчики использовали две амплификационные мишени для увеличения диагностической чувствительности. Однако, на наш взгляд, геном MPXV является достаточно консервативным и не требует применения такого подхода, зачастую снижающего аналитические характеристики за счет конкурирования независимых реакций амплификации.

В основном ПЦР-наборы реагентов для диагностики MPXV подразумевают проведение исследования в условиях стандартно оснащенной ПЦР-лаборатории, однако некоторые из них (около 10%) предусматривают работу исключительно на автоматических анализаторах того же производителя, так называемые «закрытые» системы [11]. В октябре 2024 г. ВОЗ одобрила применение ПЦР-теста Alinity m MPXV Kit, для которого требуется использование полностью автоматизированного анализатора той же фирмы. Все этапы исследования выполняются системой в автоматическом режиме и не требуют каких-либо промежуточных этапов обработки или переноса, выполняемых пользователем. Время исследования занимает не более 115 мин, биологическим материалом для исследования служат мазки с кожных поражений [23].

В табл. 1 приведены тест-системы для определения MPXV методом ПЦР-РВ, рекомендуемые CDC к использованию на Африканском континенте [24]. В некоторых случаях заявлена чрезвычайно высокая чувствительность тестов, достигаемая, вероятно, исследованием проб клинического материала большого объема, так, например, Alinity m MPXV Kit предусматривает использование 0,4 мл пробы. Однако для некоторых из перечисленных в табл. 1 тестов отмечена высокая кросс-реактивность с другими ортопоксвирусами, так, к примеру, для набора Cue Mpox (Monkeypox) Molecular Test кросс-реактивность с вирусом коровьей оспы составила 72—92% [25].

Таблица 1. Рекомендуемые CDC ПЦР-наборы реагентов для диагностики MPXV [25]

Примечание. * — Emergency Use Authorization.

В России до последнего времени отсутствовали коммерчески доступные наборы для рутинной диагностики оспы обезьян. Медицинское изделие «ВЕКТОР-МПЦР-ОСПА» ФСР 2010/09002 02.06.2017 для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной ПЦР имеет сложную комплектацию и предусматривает только устаревший электрофоретический вариант детекции результатов.

В связи с возникновением неблагополучной ситуации в мире в России начиная с 2022 г. были разработаны и выпущены несколько современных тест-систем для выявления ДНК MPXV методом ПЦР (табл. 2).

Таблица 2. Отечественные ПЦР-наборы реагентов для диагностики MPXV и их характеристики, согласно инструкциям по применению

В существующей ситуации распространения MPXV I и II генетических клад, вызывающих заболевания различной степени тяжести и смертности, важно иметь возможность дифференциальной диагностики.

В России подобные тест-системы отсутствуют, однако в настоящий момент ФГБУ «ЦСП» ФМБА России проводит разработку ПЦР-набора реагентов для дифференциации генетических клад MPXV. Были изучены нуклеотидные последовательности MPXV клад Ia, Ib, IIa, IIb из баз данных Gisaid и NCBI, собранные в период с 1970 по 2024 г. в разных регионах. В качестве мишени для амплификации ДНК выбран участок гена F3L (OPG065), имеющий характерный профиль четырех однонуклеотидных различий (рисунок), позволяющий дифференцировать I и II клады MPXV между собой и с последовательностями других ортопоксвирусов.

Фрагмент гена F3L (OPG065, дцРНК-связывающий белок) MPXV I и II клад и других ортопоксовирусов.

Аналитическая чувствительность выявления ДНК вируса, оцененная на модельных образцах клинического материала (мазки с задней стенки ротоглотки, образцы содержимого кожных поражений, плазма крови), контаминированных рекомбинантными бактериофагами, содержащими целевые участки генома MPXV, составила 1∙10³ ГЭ/мл.

По завершении разработки и клинико-лабораторных испытаний набор реагентов ФГБУ «ЦСП» ФМБА России сможет использоваться для рутинной клинической диагностики, чтобы обеспечить эффективную дифференциацию эпидемиологически и клинически различающихся клад MPXV (данные не приводятся).

Молекулярные методы для проведения диагностики в месте оказания медицинской помощи

Учитывая важность проведения диагностических исследований в местах оказания медицинской помощи, активно внедряются тесты, основанные на методах амплификации нуклеиновых кислот, приближенные к формату «у постели больного» (point-of-care или POC). Так, на сегодняшний день разработано 87 подобных тестов [11], некоторые из них представлены в табл. 3.

Таблица 3. Тесты для диагностики MPXV в местах оказания медицинской помощи

Из вышеперечисленных тестов одним из распространенных является Xpert Mpox, он позволяет проводить исследование на портативном устройстве XpertMpox Cepheid в автоматическом режиме за время, не превышающее 30 мин. Как заявлено, тест обладает хорошими аналитическими (LOD 1∙10¹ БОЕ/мл) и диагностическими характеристиками [26].

Однако наибольший интерес представляет внелабораторный тест Pluslife Monkeypox Virus Card, основанный на изотермической амплификации и предполагающий полностью автоматическое тестирование в течение 15 мин, его заявленная чувствительность составляет 500 копий/мл, что является хорошим показателем даже для молекулярных тестов [27].

Высокотехнологичные молекулярные методы

Полногеномное секвенирование (WGS) является наиболее точным методом дифференциации MPXV от других ортопоксвирусов и позволяет генотипировать конкретные штаммы вируса, определяя происхождение вспышек [28]. С помощью WGS можно проследить генетическую эволюцию вируса, определить специфичные гены адаптации к различным хозяевам, идентифицировать генетические маркеры тяжелых проявлений заболевания. Филогенетический анализ последовательностей вирусных геномов различных вспышек позволяет создать модель миграции вируса и играет важную роль в разработке вакцин и программ профилактики и контроля распространения вируса.

Разработаны реагенты для оптимизации технологии WGS при секвенировании ДНК вируса оспы обезьян, например специализированная панель NextGenPCR MPXV Sequencing Library Prep Kit фирмы Molecular Biology Systems.

Однако стоит отметить, что потребность в дорогостоящем оборудовании, реагентах и значительных вычислительных ресурсах ограничивает применение данной технологии.

Соблюдение мер биологической безопасности при диагностике MPXV

Согласно руководству по биологической безопасности для лабораторий по обращению с образцами MPXV и их обработке (за исключением культивирования вируса), утвержденной CDC, выполнение диагностических работ с вирусом допускается в лабораторных помещениях второго уровня биологической безопасности (BSL-2) при выполнении дополнительных условий, в том числе: персонал привит от ортопоксвирусов не менее 3 лет назад; в случае процедур, при которых могут образовываться аэрозоли, работы необходимо проводить в боксах микробиологической безопасности второго класса [29]. В РФ такие условия соответствуют лабораториям, выполняющим работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) III–IV группы. В то же время, согласно санитарным правилам и нормам СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», диагностические работы с MPXV проводятся в лабораториях, подведомственных Роспотребнадзору и имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на работу с микроорганизмами более опасной, первой группы патогенности. Сбор материала осуществляют с соблюдением требований биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями I–II групп патогенности. Клиническим материалом для проведения диагностических исследований является содержимое кожных поражений в зависимости от стадии болезни — везикул, пустул, корочки, соскобов со дна пузырьков, макул или папул (при наличии), мазки с задней стенки глотки и миндалин, кровь или секционный материал (при летальном исходе). Материал от больного (подозрительного на заболевание, контактного) отбирается и незамедлительно передается в территориальное ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» для дальнейшей отправки в лабораторию по территориальному распределению [30].

В случае масштабной вспышки mpox в стране могут возникнуть трудности при проведении лабораторных исследований из-за ограниченного числа и недостаточной пропускной способности существующих лабораторий для работы с ПБА I—II группы (BSL-4). Как показал опыт эпидемии COVID-19, при необходимом дооснащении и обучении персонал клинических лабораторий может успешно выполнять серологические и молекулярные диагностические процедуры с материалом, содержащим агент II группы патогенности — вирус SARS-CoV-2. Мы считаем избыточными требования санитарного законодательства, согласно которым диагностику MPXV необходимо проводить в лабораториях, работающих с патогенными биологическими агентами I—II группы (BSL-4). Такие условия стоит оставить для задач, подразумевающих работу с живым вирусом оспы обезьян, изучение его жизненного цикла и разработку вакцин.

Заключение

ПЦР — «золотой стандарт» лабораторной диагностики MPXV, является наиболее распространенным для рутинного обнаружение ДНК MPXV в различном клиническом материале. По опубликованным данным, при обнаружении MPXV в период с 2010 по 2022 г. на долю ПЦР приходилось примерно 49,2% (8889/18060) изученных исследований, причем среди других методов ПЦР показал наилучшую чувствительность [17].

Учитывая динамику распространения вспышек оспы обезьян и роста числа случаев заболевания, крайне важно повышать доступность и эффективность тестирования. Также важной задачей является разработка диагностических тестов, способных идентифицировать генетические клады I и II и различать их. Дифференциация клад имеет огромное значение для понимания клинико-эпидемиологических особенностей течения заболевания, разработки целевых стратегий профилактики и лечения заболевания, а также контроля вспышек.

В настоящее время во всем мире быстрыми темпами развивается направление разработки чувствительных тестов для диагностики MPXV в местах оказания медицинской помощи (point-of-care), что связано с острой необходимостью постановки диагноза в местах, где отсутствуют специализированные лаборатории. В РФ также существует необходимость разработки подобных технологий для тестирования населения в случае осложнения эпидемической обстановки. Кроме того, необходимо наладить производство специализированных наборов WGS. Снизить опасность потенциальных вспышек mpox для населения и лучше к ним подготовиться возможно только при своевременном финансировании соответствующих исследований и разработок в области диагностики этого опасного заболевания.

Также для увеличения числа лабораторий, способных диагностировать вирус, стоит рассмотреть вопрос о внесении изменений в санитарное законодательство в части регулирования деятельности лабораторий, работающих с образцами MPXV, для приведения их в соответствие с международными стандартами.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.