Введение
Старение является результатом взаимодействия изменений, происходящих во всех 5 анатомических слоях лица: скелете, связках, мышцах, жировой ткани и коже. Для достижения естественного и гармоничного омоложения лица требуется многослойное комбинированное вмешательство для разглаживания умеренно выраженных и глубоких лицевых морщин и складок, восполнения утраченных объемов, увлажнения кожи, восстановления ее упругости и свежести.
Ни одна технология, ни один филлер или нейромодулятор, применяемые по отдельности, не могут обеспечить всех желаемых результатов при коррекции возрастных изменений стареющего лица. Вопрос в том, когда и как безопасно и эффективно сочетать различные эстетические вмешательства на лице, руках, шее и декольте.
Препараты Белотеро Вольюм и Радиес применяются для лечения липоатрофии лица, обусловленной либо ВИЧ, либо возрастом, либо потерей объема мягких тканей лица [1—5]. Дермальные филлеры Белотеро Вольюм и Радиес одобрены Министерством здравоохранения РФ и FDA к применению для восстановления молодого контура лица и придания пропорциям лица сбалансированной формы в зонах, где объем потерян из-за увядания кожи или экстремальной потери массы тела [6, 7]. Оба препарата имеют разное назначение и воздействуют на разные области лица.
С момента их появления собрано большое количество клинических данных. Белотеро Вольюм протестирован как в исследованиях эстетической коррекции лица, так и в исследованиях при лечении атрофических рубцов, результаты которых продемонстрировали эффективность и благоприятный и хорошо охарактеризованный профиль безопасности препарата [1, 2, 8].
Препарат Радиес — единственный в настоящее время биоразлагаемый филлер, обладающий свойством быстрого восстановления утраченного объема и одновременным эффектом стимуляции выработки естественного коллагена кожи, что позволяет достичь долгосрочных результатов при его применении [9]. Он является универсальным инъекционным имплантатом и эффективным средством для достижения краткосрочных и долгосрочных результатов при проведении косметических и реконструктивных процедур. Этот инъекционный препарат часто применяют вместе с ботулиническим нейропротеином, другими инъекционными препаратами, стимуляторами выработки коллагена и аппаратными методиками, проводимыми с целью лифтинга кожи. Его эффективность и безопасность также продемонстрированы в ряде исследований [10—12].
Комбинированные эстетические процедуры широко используют в клинической практике, но с учетом сложности изучения данной области результаты их применения редко сообщаются на научных конференциях и в медицинской литературе. Эксперты поддерживают комбинированный подход с применением нескольких методик в определенной последовательности для безопасного и эффективного омоложения лица [13, 14].
Цель исследования — анализ гистоморфологических изменений после введения комбинации препаратов Белотеро Вольюм и Радиес, выполненного поэтапно или одновременно, а также оценка совместимости их комбинации.
Материал и методы
Дизайн исследования
Открытое проспективное пилотное рандомизированное сравнительное клиническое исследование с иммуногистохимическим (ИГХ) анализом кожных биоптатов проведено с участием здоровых добровольцев женского пола. Каждый участник подписал форму информированного согласия на участие в исследовании. Исследование одобрено этическим комитетом и проводилось в соответствии с этическими принципами Хельсинской декларации и ICH-GCP в период с декабря 2019 по июль 2020 г.
Участники исследования
Всего в исследовании приняли участие 8 женщин в возрасте от 35 до 45 лет с индексом массы тела менее 21 кг/м2 и наличием показаний для лифтинга нижней трети лица, шеи и зоны декольте. Все участники завершили участие в исследовании в соответствии с протоколом.
Во время исследования в покровные ткани периаурикулярной области всем участницам выполнены подкожная инъекция Белотеро Вольюм и последующая или одновременная подкожная инъекция Радиес в ту же область.
Восемь участниц исследования соответствовали критериям включения/исключения и были случайным образом распределены в экспериментальную или контрольную группу в соотношении 1:1 согласно компьютерной схеме рандомизации: 1-я группа (Белотеро Вольюм и последующая инъекция препарата Радиес через 1 мес) — 4 участницы и 2-й группа (Белотеро Вольюм и одновременная инъекция препарата Радиес) — 4 участницы. Участниц исследования наблюдали в течение 5 мес.
Данные вносили в индивидуальные регистрационные карты, информация включала сведения о поле, возрасте, дате и частоте проведения процедур, области инъекции препаратов, обозначении зоны биопсии, переносимости процедур и любых нежелательных эффектах.
Исследуемые препараты
В ходе исследования было запланировано 3 визита.
На первом этапе (D01) добровольцам 1-й группы в мягкие ткани околоушной области подкожно вводили препарат Белотеро Вольюм. Препарат вводили с помощью 19-миллиметровой иглы 27 G под углом 35—40°. Стандартный препарат Радиес вводили подкожно в ту же область на втором этапе исследования через 1 мес (М01) с помощью 19-миллиметровой иглы 27 G под углом 35—40°.
Разведенный 0,9% физиологическим раствором препарат Радиес вводили подкожно с использованием векторной техники на глубину дермо-гиподермального соединения. Соотношение лекарственного препарата и физиологического раствора 1:1 — 3 мл препарата на 3 мл физиологического раствора соответственно. На втором этапе (M01) препарат вводили в область средней и нижней трети лица, а также в околоушную область. Подкожные инъекции выполняли линейным ретроградным методом по линиям натяжения кожи (линиям Лангера). Канюлю 22 G × 50 мм вводили в кожу на всю длину под наименьшим углом к поверхности кожи.
Добровольцам 2-й группы также вводили препарат Белотеро Вольюм в покровные ткани периаурикулярной области (подкожная инъекция). Затем в ту же область вводили стандартный препарат Радиес (подкожная инъекция). Обе инъекции выполнены на первом этапе (D01) с помощью 19-миллиметровой иглы 27 G под углом 35—40°.
На всех визитах выполняли панч-биопсию обработанных мягких тканей околоушной области (рис. 1).
Рис. 1. Схематичное изображение зон панч-биопсии.
Конечные точки исследования
Эффективность
В качестве конечной точки оценивали результаты гистоморфологических данных, основанные на исследовании коллагена I и III типов и эластиновых волокон с помощью ИГХ-анализа. Оценку выполняли на втором (M01) и третьем (M06) этапах по сравнению с исходными данными.
Для ИГХ-анализа биоптаты, полученные у пациентов, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали парафином по стандартной методике. Изготовлены серии парафиновых срезов по 4 мкм каждый, с окрашиванием гематоксилином и эозином и окрашиванием эластиновых волокон по Вейгерту—Ван Гизону. ИГХ-реакцию проводили по стандартному протоколу путем демаскировки антигена в ретривере. Для анализа применяли моноклональные антитела к коллагену I типа (мышиные моноклональные антитела производства Santa Cruz (sc-293182), клон 3G3, разведение 1:100), коллагену III типа (мышиные моноклональные антитела производства Santa Cruz (sc-166316), клон B-4, разведение 1:100), VEGF (кроличьи поликлональные антитела производства Abcam (ab-183100), разведение 1:100). Реакции проводили с положительным и отрицательным контролями в отсутствие первичных антител.
Сравнительный анализ содержания коллагена I и III типов, эластина и других гистоморфологических показателей (наличие воспалительной реакции, ангиогенез) проводили в 3 слоях биоптата (субэпителиальный, поверхностный и глубокий слои дермы). При проведении гистологического и ИГХ-анализа интенсивность окрашивания образцов оценивали полуколичественным методом. Слабое окрашивание соответствовало экспрессии маркера, оцениваемой в 2 балла, умеренное — в 4 балла, интенсивное — в 6 баллов.
Безопасность
Переносимость процедур оценивали по 4-балльной шкале оценки безопасности: 0 — нет реакции, 1 — легкая, 2 — умеренная, 3 — тяжелая (боль, отек, эритема, кровоподтеки). Нежелательные явления оценивали и регистрировали на каждом визите.
Статистический анализ
Исследование планировалось как пилотное, без определения размера выборки. По каждому изучаемому показателю приведены описательные статистические данные. Для анализа различий между группами по конечным точкам эффективности применяли критерий Манна—Уитни. Внутри группы конечные точки эффективности сравнивали с использованием критерия Уилкоксона.
Статистический анализ выполнен с применением специализированного программного обеспечения Stata («StataCorp», США), версия 14.
Результаты
Исследуемая популяция
Восемь прошедших скрининг здоровых добровольцев женского пола соответствовали критериям включения/исключения и были рандомизированы в 2 группы в соотношении 1:1. Все участники полностью прошли исследование без существенных отклонений от протокола. Популяция для оценки безопасности включает всех пациентов, получивших как минимум одну дозу любого из исследуемых препаратов (рис. 2).
Рис. 2. Распределение пациентов.
Включенные участники разделены на две группы:
— 1-я группа — 4 пациентки, получившие инъекцию Белотеро Вольюм и через 1 мес инъекцию препарата Радиес;
— 2-я группа — 4 пациентки, получившие одновременно инъекцию препарата Белотеро Вольюм и инъекцию препарата Радиес.
Доступные демографические и клинические данные указывают на исходное отсутствие различий между двумя группами по оцененным показателям.
Гистоморфологическая оценка эффективности
Сравнительная оценка гистологических и гистохимических изменений
Проведен сравнительный анализ гистоморфологических показателей биоптата кожи до и затем через 1 и 5 мес после комбинированного введения препаратов Белотеро Вольюм и Радиес (стандартного), а также исследование 8 кожных образцов, полученных методом панч-биопсии из позадиушной области у всех участниц исследования.
Исходно в обеих группах отмечено отсутствие эластических волокон в субэпителиальном и поверхностном слоях дермы; вместо этого их наблюдали как отдельные волокна в периваскулярных и перигландулярных тканях в глубоких слоях дермы (0 баллов).
Через 1 мес после однократного введения Белотеро Волюм в 1-й группе выявлено ремоделирование эпидермиса за счет накопления эластических волокон и увеличения количества внеклеточного матрикса. В эпидермисе патологических изменений не обнаружено; эпидермис без утолщений, с сохраненной слоистостью. Оценка образцов не выявила признаков гиперкератоза. И сосочковый, и ретикулярный слои дермы без утолщений и сравнительно легко различимы; они образованы разнонаправленными коллагеновыми волокнами, не плотными, с умеренным количеством слегка неравномерно распределенных фибробластов и фиброцитов. В дерме (при окраске гематоксилином и эозином и окраске по Ван Гизону) выявляется накопление внеклеточного матрикса с отложением пучков коллагена.
В дерме обнаружено больше сосудов (мелких вен, венул, капилляров и артериол), чем на первой стадии (p<0,05). Их просвет расширен, и они относительно равномерно распределены в образце. Выявлены эластические волокна (2—4 балла) преимущественно в поверхностных и глубоких слоях дермы, расположенных вокруг сосудов и придатков кожи (p<0,05).
Во 2-й группе наблюдали легкое ремоделирование дермы за счет накопления внеклеточного матрикса, признаков ангиогенеза и накопления эластических волокон. При окрашивании гематоксилином и эозином и окрашивании по Ван Гизону в дерме также обнаружено накопление внеклеточного матрикса с отложением пучков коллагена. Немногочисленные лимфоциты имеют несколько неравномерное распределение в поле зрения и, как правило, располагаются в периваскулярных пространствах в стенках мелких кровеносных сосудов, а также вблизи некоторых волосяных фолликулов, и их количество ограниченно, что не свидетельствует о развитии воспалительной реакции в месте введения филлера. Сосудов (мелких вен, венул, капилляров, артериол) в дерме немного больше, чем на первой стадии (p<0,05). Эти находки также можно считать морфологическими признаками активного ремоделирования соединительной ткани в месте введения дермального филлера (2—4 балла). Эластическая окраска выявила эластические волокна (p<0,05) преимущественно в поверхностных и глубоких слоях дермы, расположенных вокруг сосудов и придатков кожи (2—4 балла).
Более высокую скорость ангиогенеза (p<0,05) наблюдали во 2-й группе через 1 мес после одновременного введения препаратов Белотеро Волюм и Радиесс.
Через 5 мес после комбинированных инъекций препаратов Белотеро Волюм и Радиес сравнительный анализ гистоморфологии кожи показал, что оба они вызывают ремоделирование кожи, в то время как раздельное введение приводит к выраженному ремоделированию кожи, характеризуемому тенденцией к накоплению экстрацеллюлярного матрикса, более выраженному накоплению эластических волокон (p<0,05), усилению ангиогенеза в течение 4 мес после инъекции (p<0,05).
Результаты представлены на рис. 3, 4.
Рис. 3. Сравнительный анализ гистоморфологических показателей биоптата кожи до, через 1 и 6 мес после инъекции препаратов Белотеро Вольюм и Радиес.
Рис. 4. Фотографии микропрепаратов. Гистологические и гистохимические показатели биоптата кожи до терапии (а—в), через 1 мес (г—е) и через 6 мес (ж—и) после комбинированного введения препаратов Белотеро Вольюм и Радиес.
Окраска: гематоксилин и эозин (а, г, ж), орсеин (б, д, з) и пикрофуксин Ван Гизона (в, е, и); ув. 400.
Сравнительные иммуногистохимические изменения
На первом этапе перед инъекцией препаратов коллаген I типа выявлялся в виде тонких переплетающихся волокон, расположенных преимущественно в субэпителиальном и поверхностном слоях дермы. Коллаген III типа имел вид более толстых переплетающихся волокон с аналогичным расположением в дерме, его количество было сопоставимо с количеством коллагена I типа. Соотношение коллагена I/III типов было равно 1,0. VEGF выявлялся как участки окрашенной цитоплазмы в отдельных эндотелиальных клетках сосудов (0—2 балла).
Сравнительный анализ ИГХ-характеристик тканей как после поэтапных, так и после одновременных инъекций препаратов Белотеро Вольюм и Радиес показал, что эти вмешательства оказывали ремоделирующий эффект на дерму, хотя поэтапное введение препаратов Белотеро Вольюм и Радиес, выполненное в 1-й группе, имело относительно больший эффект. Этот вывод подтверждается более интенсивным накоплением коллагена I и III типов (p<0,05) в дерме и сохранением соотношения 1:1, а также интенсивным ангиогенезом (p<0,05), обеспечивающим устойчивое кровоснабжение тканей.
Результаты представлены на рис. 5, 6.
Рис. 5. Сравнительный анализ иммуногистохимических показателей биоптата кожи до, через 1 и 6 мес после комбинированного введения препаратов Белотеро Вольюм и Радиес.
Рис. 6. Фотографии микропрепаратов. Иммуногистохимические показатели биоптата кожи до терапии (а—в), через 1 мес (г—е) и 6 мес (ж—и) после комбинированного введения препаратов Белотеро Вольюм и Радиес.
Иммунопероксидазные реакции в отношении VEGF (а, г, ж), коллагена I типа (б, д, з) и коллагена III типа (в, е, и); ув. 400.
Результаты оценки безопасности
В ходе исследования не зарегистрировано ни одного нежелательного явления.
Обсуждение
Результаты проведенного исследования показали, что применение инъекционной комбинации препаратов Белотеро Вольюм и Радиес ведет к гистоморфологическому улучшению состояния кожи.
Сравнительный анализ гистоморфологических изменений в тканях выявил, что препараты вызывают ремоделирование кожи, при этом совместное применение препаратов Белотеро Вольюм и Радиес оказывает значительное влияние на возрастное ремоделирование кожи с тенденцией к накоплению экстрацеллюлярного матрикса и эластических волокон (p<0,05).
В предыдущих исследованиях сообщалось об увеличении количества коллагена III типа с постепенным выравниванием по отношению к коллагену I типа [11, 15]. Наше исследование показало увеличение количества как коллагена типа I, так и коллагена типа III с одинаковым соотношением.
Согласно нашим результатам, поэтапные инъекции препаратов Белотеро Вольюм и Радиес оказали относительно больший ремоделирующий эффект на кожу по сравнению с одновременными инъекциями препаратов Белотеро Вольюм и Радиес. Это подтверждается более интенсивным накоплением коллагена I и III типов (p<0,05) в дерме и сохранением соотношения 1:1, а также интенсивным ангиогенезом (p<0,05), обеспечивающим устойчивое кровоснабжение кожи.
Заключение
Данные рандомизированного открытого проспективного экспериментального клинического исследования соответствуют цели, которая позволяет исследователям выполнить поставленные задачи: продемонстрировать эффективность с точки зрения гистоморфологической оценки поэтапных и одновременных инъекций препаратов Белотеро Вольюм и Радиес.
Сравнительный анализ гистологии и иммуногистохимии образцов после комбинированного введения препаратов Белотеро Вольюм и Радиес показал, что поэтапное введение оказывает более выраженный ожидаемый ремоделирующий эффект на кожу по сравнению с одновременным введением. Это подтверждается интенсивным образованием эластических волокон (p<0,05), накоплением коллагена I и III типов в дерме (p<0,05) с сохранением соотношения 1:1 и интенсивным ангиогенезом (p<0,05), что обеспечивает постоянное кровоснабжение тканей. Получены также данные о безопасности одновременного введения препаратов Белотеро Вольюм и Радиес, подтверждающие отсутствие гистологических и ИГХ-признаков воспаления и нарушения трофики тканей.
Компания «Мерц Фармасьютикалс ГмбХ», Франкфурт-на-Майне, Германия, оказывала финансовую поддержку в подготовке публикации. Ни один из авторов не получил никакой финансовой компенсации за работу над содержанием и написанием текста этой публикации.
Участие авторов:
Юцковская Я.А. — концептуализация, методология, руководство проектом, написание чернового варианта статьи; Коган Е.А., Королева А.Ю. — исследование, изучение и анализ источников; пересмотр и редактирование статьи.
Конфликт интересов: Д-р. Юцковская Я.А. — консультант и исследователь для компании «Мерц Фармасьютикалс». Доктора Коган Е.А., Королева А. Ю. заявляют об отсутствии конфликта интересов в этой работе.
Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt am Main, Germany, provided financial support for the preparation of the publication. None of the authors received any financial compensation for the work on the content and writing of the text of this publication. All the listed authors approved the article before submitting it for publication.
Authors’ contributions:
Statement of the author’s contribution CRediT: Yutskovskaya Ya.A. — conceptualization, methodology, project management, writing a draft version of the article; Kogan E.A., Koroleva A.Yu. — research, study and analysis of sources; revision and editing of the article.
Conflict of interest: Dr. Yutskovskaya Ya.A. — consultant and researcher for the company «Merz Pharmaceuticals». Doctors Kogan E.A., Koroleva A.Y. declare that there is no conflict of interest in this work.