Способ создания варикозного расширения вен конечностей в хроническом эксперименте

Роль флебопатии как начального этапа развития варикозной болезни (ВБ) вен нижних конечностей зачастую бывает недооценена. Именно на начальные стадии ВБ — С0 (от 15% до 51,1%) и С1 (от 20% до 60%) по классификации CEAP приходится основная группа первичной обращаемости за медицинской помощью к врачу поликлинического звена [1, 2]. При этом с возрастом заболеваемость неуклонно растет [3].

Развитие этого заболевания обусловлено совокупностью множества факторов: анатомические предпосылки — прямохождение, изменение образа жизни современного человека (гиподинамия и гипердинамия) [4], беременность и прием пероральных контрацептивов у женщин [5], генетические детерминанты [6], профессиональная деятельность [7], дисфункция соединительной ткани [8] и др.

Патофизиологически ВБ характеризуется рефлюксом крови, нарушением работы клапанного аппарата венозной стенки, венозной гипертензией, лейкоцитарной инфильтрацией тканей [9—11]. Указанные изменения запускают неблагоприятные изменения в венозной стенке, приводящие к чрезмерной дилатации и извитости сосудов. Имеющиеся клинические исследования предоставляют материал о развившейся ВБ, тогда как вопросы этапности изменений в стенке вены, патофизиологических предпосылок начала варикозного процесса и факторов, способствующих прогрессированию заболевания, дискутабельны.

Таким образом, представляется актуальным разработать способ создания модели ВБ вен нижних конечностей у собак для изучения ее патофизиологии на всех этапах развития, осложнений, оценки эффективности различных видов терапии.

Цель исследования — разработка способа создания варикозного расширения вен конечностей у собак в хроническом эксперименте.

Эксперимент выполняли на 15 половозрелых беспородных некастрированных кобелях массой 15 000—17 000 г, разделенных на 3 группы (по 5 собак в каждой). Набор животных выполняли на базе факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Омского государственного аграрного университета им. П.А. Столыпина из числа содержавшихся в виварии беспородных животных. Условия содержания животных и порядок работы с ними строго соответствовали законодательству Российской Федерации, положениям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», требованиям и рекомендациям «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» [12, 13]. На проведение данного исследования получено положительное заключение этического комитета ФГБОУ ВО «ОмГМУ» Минздрава России (№14 от 26.10.2022).

В 1-й группе (контрольной) вводили гонадотропин хорионический 200 ед/кг массы тела и 1% прогестерон 0,1 мл/кг внутримышечно, во 2-й группе — гексэстрол в дозе 0,09 мг/кг и 1% прогестерон 0,1 мл/кг внутримышечно, в 3-й группе вводили исключительно 1% прогестерон 0,1 мл/кг внутримышечно. Расчет дозы выполняли на массу тела собаки в исследовании от рекомендуемой суточной максимальной дозы на 1 человека массой тела 70 кг согласно актуальной официальной инструкции к препаратам с применением соответствующих коэффициентов [14].

Введение препаратов начинали за 1 день до оперативного вмешательства. Все манипуляции осуществляли с соблюдением правил асептики и антисептики. В день операции животное фиксировали в положении на левому боку так, чтобы для операционного доступа была открыта внутренняя поверхность левой нижней конечности. Сбривали шерсть на данном участке с помощью триммера. При УЗИ находили бедренную вену (БВ) ниже места впадения медиальной подкожной вены (МПВ) и маркировали ее проекцию на кожу. После обработки операционного поля спиртовым раствором хлоргексидина трижды под комбинированным обезболиванием (ксилазина гидрохлорид в дозе 0,2 мл/кг внутривенно и местная инфильтративная анестезия 4 мл 1% раствора лидокаина) выполняли рассечение кожи длиной 2 см. Выделяли бедренную артерию и БВ (рис. 1).

Рис. 1. Выделение бедренной артерии и вены. Интраоперационная фотография.

Под последней с помощью иглы Дешана проводили монофиламентную полипропиленовую нить-держалку 1—0 (рис. 2).

Рис. 2. Заведение иглы Дешана под бедренную вену. Интраоперационная фотография.

Для достижения дозированного сужения просвет вены уменьшали до 1/2 путем ее лигирования на металлическом протекторе в виде L-изогнутой спицы, диаметр которой был в 2 раза меньше, чем диаметр вены (рис. 3, 4). Например, при диаметре вены 4 мм диаметр протектора 2 мм; при диаметре вены 2 мм диаметр протектора 1 мм. Протектор извлекали сразу после лигирования. После этого ушивали поверхностную фасцию нитью полипропилен 1—0. Накладывали внутрикожный шов по Холстеду нитью монокрил 3—0 с целью недопущения выгрызания животным шва. Контроль кровотока после операции осуществляли с помощью УЗИ. В день операции и в последующие 6 дней продолжали внутримышечное введение гормональных препаратов в каждой группе (18.07.2024 получен патент на изобретение №2823139 «Способ моделирования варикозной болезни вен нижних конечностей у собак» [15]).

Рис. 3. Лигирование бедренной вены на ½ с помощью металлического протектора в виде L-изогнутой спицы. Интраоперационная фотография.

Рис. 4. Схема лигирования бедренной вены.

1 — металлический протектор в виде L-изогнутой спицы с диаметром в 2 раза меньше, чем диаметр вены; 2 — лигатурная монофиламентная полипропиленовая нить.

Контроль параметров УЗИ осуществляли на 10-е и 30-е сутки после оперативного вмешательства (рис. 5).

Рис. 5. Сонограмма бедренной вены.

Вместе с этим за 1 день до операции, а также на 10-е и 30-е сутки после операции осуществляли забор крови из подкожной вены оперированной левой нижней конечности для определения уровня лейкоцитов, С-реактивного белка (СРБ) и интерлейкина-6 (ИЛ-6).

Для статистической обработки полученных данных использовали компьютерную программу StatSoft Statistica 12 согласно рекомендациям О.Ю. Ребровой (2002). В исследовании применяли 95% доверительный интервал. Проверку нормальности распределения количественных признаков не проводили, так как все полученные данные рассматривали как непараметрические. С целью оценки распределения непрерывных величин в несвязанных группах использовали H-критерий Краскела—Уоллиса для 3 групп, U-критерий Манна—Уитни для 2 групп, в связанных группах — критерий Уилкоксона.

Медиана возраста собак в контрольной и основных группах составила 3 года, 3 года и 4 года соответственно (p=1,0; H-критерий). Животные в группах были сопоставимы по массе тела (p=0,284; H-критерий), росту (p=0,352; H-критерий), индексу кондиции тела (p=0,779; H-критерий), диаметру МПВ (p=0,817; H-критерий), уровню лейкоцитов в крови до операции (p=0,820; H-критерий). Стоит отметить, что во всех исследуемых группах отсутствовали дополнительные притоки и рефлюкс по МПВ, а диаметр правой и левой голени на уровне верхней трети в группах статистически значимо не различался (p=1,0; U-критерий).

10-е сутки после операции. Во всех исследуемых группах отмечено статистически значимое увеличение диаметра голени оперируемой нижней конечности (p=0,043; критерий Уилкоксона). При этом наибольшее увеличение (+5,2%) наблюдалось во 2-й группе. Кроме того, 10-е сутки послеоперационного периода характеризовались статистически значимым увеличением слоя дермы во 2-й и 3-й группах (на 0,4 мм, +14,8% и 0,5 мм, +19,2% соответственно (p=0,04; критерий Уилкоксона), хотя значимой разницы между группами не наблюдали (p=0,126; H-критерий).

Диаметр БВ на 10-е сутки статистически значимо различался между группами (p=0,004; H-критерий). Наибольшее увеличение наблюдалось во 2-й группе — на 1,5 мм (+39,4%; p=0,043; критерий Уилкоксона). При этом стоит отметить, что статистически значимого увеличения диаметра внутри контрольной группы не было (p=0,067; критерий Уилкоксона).

Увеличение диаметра МПВ также характеризовалось статистически значимыми различиями между группами (p=0,005; H-критерий). При этом увеличение диаметра МПВ во 2-й группе (на 1,7 мм, +154,5%) отличалось от такового в контрольной и 3-й группах (p=0,008; H-критерий), в то время как различий между контрольной и 3-й группами не было (p=0,179; H-критерий) (рис. 6). Вместе с этим на 10-е сутки при УЗИ стали визуализироваться притоки МПВ (в количестве 2, 3 и 2 соответственно для каждой группы), которые отсутствовали до операции (p=0,043; критерий Уилкоксона). Большее количество притоков на 10-е сутки отмечено во 2-й группе (p=0,009; H-критерий) (рис. 7).

Рис. 6. Медиана диаметра МПВ в группах до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции.

Рис. 7. Количество притоков МПВ до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции.

Изменение венозной гемодинамики характеризовалось появлением рефлюкса по МПВ во всех группах (p=0,043; критерий Уилкоксона), при этом наибольшую скорость — 16,4 см/с наблюдали в контрольной группе, а наименьшую — 0,3 см/с — в 3-й группе (p=0,001; H-критерий) (рис. 8). Продолжительность рефлюкса (p=0,004; H-критерий) и его протяженность до верхней трети бедра (p=0,0009; H-критерий) в 1-й и 2-й группах статистически значимо отличались от таковых в 3-й группе, в которой указанные изменения отсутствовали. При этом различий между 1-й и 2-й группами (Me 1,0 см/с и 1,1 см/с соответственно) не было (p=0,229; H-критерий).

Рис. 8. Медиана скорости рефлюксной волны по МПВ до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции.

При анализе лабораторных данных (табл. 1—3) на 10-й день послеоперационного периода отмечалось статистически значимое увеличение числа лейкоцитов (рис. 9) во всех группах (p=0,043; критерий Уилкоксона). При этом наибольшей воспалительной реакцией характеризовалась 3-я группа (p=0,002; H-критерий). Концентрация СРБ в контрольной группе продолжала оставаться на исходном уровне, в 3-й группе уменьшилась в 2 раза (–50%), а во 2-й группе снизилась до 0 (p=0,043; критерий Уилкоксона). Уровень ИЛ-6 как провоспалительного цитокина характеризовался статистически значимым увеличением в контрольной и 3-й группах (p=0,043; критерий Уилкоксона), тогда как его увеличение во 2-й группе статистически значимо не отличалось от исходного уровня (p=0,079; критерий Уилкоксона) (рис. 10).

Таблица 1. Показатели анализа крови до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции в контрольной группе

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3 данные представлены в виде медианы с указанием верхнего и нижнего квартилей. * — разница до операции и на 30-е сутки после операции; ** — критерий Уилкоксона.

Таблица 2. Показатели анализа крови до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции во 2-й группе

Таблица 3. Показатели анализа крови до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции в 3-й группе

Рис. 9. Медиана количества лейкоцитов крови до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции.

Рис. 10. Медиана уровня ИЛ-6 до операции и на 10-е сутки после операции.

На 30-е сутки после оперативного вмешательства во всех исследуемых группах отмечалось уменьшение диаметра оперируемой голени на уровне верхней трети. При этом во 2-й группе изменение диаметра по сравнению с изначальным (+2,3%) продолжало оставаться статистически значимым (p=0,043; критерий Уилкоксона). Толщина дермы по сравнению с исходной в контрольной и 2-й группах уменьшилась на 16,7% и 25,9% соответственно (p=0,043; критерий Уилкоксона), а в 3-й группе продолжала увеличиваться и выросла на 42,3% (p=0,043; критерий Уилкоксона) со статистически значимой разницей между группами (p=0,001; H-критерий) (рис. 11).

Рис. 11. Медиана толщины дермы до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции.

Диаметр БВ (рис. 12) к 30-м суткам во всех исследуемых группах продолжал увеличиваться (p=0,043; критерий Уилкоксона), в то время как поперечный размер МПВ, наоборот, уменьшился. Однако, несмотря на это уменьшение, разница между первоначальным значением и конечным значением продолжала оставаться значимой (p=0,043; критерий Уилкоксона).

Рис. 12. Медиана диаметра бедренной вены (БВ) до операции, на 10-е и 30-е сутки после операции.

В ходе УЗИ на 30-е сутки количество дополнительных притоков МПВ в 1-й и 2-й группах осталось на прежнем уровне, тогда как в 3-й группе их количество увеличилось вдвое (p=0,043; критерий Уилкоксона).

При изучении венозной гемодинамики на 30-е сутки в контрольной группе зафиксировано продолжение увеличения скорости распространения рефлюксной волны (p=0,043; критерий Уилкоксона), в то время как 2-я и 3-я группы характеризовались стойким сохранением скоростных характеристик с наименьшими в 3-й группе (0,5 см/с). Продолжительность и протяженность рефлюкса в группах оставались такими же, как и на 10-е сутки послеоперационного периода.

При анализе лабораторных данных на 30-й день послеоперационного периода отмечалось статистически значимое уменьшение уровня лейкоцитов во всех группах по сравнению с таковым на 10-е сутки (p=0,043; критерий Уилкоксона). При этом в контрольной и 2-й группах уровень лейкоцитов стал ниже исходного. Наибольшая воспалительная реакция продолжала наблюдаться в 3-й группе (p=0,008; H-критерий). Значимых изменений по уровню СРБ в группах не было.

О большой роли прогестерона и эстрогенов как факторов, способствующих развитию варикозной болезни, свидетельствуют нежелательная реакция применения комбинированных пероральных контрацептивов в виде развивающейся флебопатии, рядом авторов называемой гормониндуцированной [16]. В связи с этим выбор фармакологического сопровождения в эксперименте гормональными препаратами в качестве индуктора повреждения стенок вены аргументирован тем, что прогестерон вызывает деградацию эластиновых и коллагеновых волокон, снижает тонус венозной стенки, приводит к вазодилатации. Гонадотропин как стимулятор выработки эстрогена приводит к гипертрофии интимы и медии в стенке вены, к отслаиванию эндотелиальной выстилки (дисфункция эндотелия) за счет отложения иммунных комплексов и к высвобождению оксида азота с последующей вазодилатацией [17, 18].

В качестве прототипа был взят способ моделирования варикозного расширения вен конечностей, заключающийся в наложении жгута в проксимальной части нижней конечности подкожно при одновременном парентеральном введении гонадотропина и раствора прогестерона [19]. Однако данный способ приводит к стойкому болевому синдрому в конечности из-за длительной компрессии сосудисто-нервного пучка (перевязан an block) на уровне бедра. Оценка степени сужения вен и гемодинамики трудоемка в связи с необходимостью применения специальной аппаратуры. В этом случае не описывается развитие стойкой венозной гипертензии на длительный срок (исследование ограничивается продолжительностью 7 сут). Кроме того, высокая рыночная стоимость препарата хорионического гонадотропина побуждает к поиску более экономичных альтернативных препаратов для воспроизведения модели флебопатии.

В ходе эксперимента установлено, что сужение БВ на 1/2 с одновременным применением только прогестерона приводит к появлению стойкой варикозной трансформации вен, однако сопровождающейся выраженным провоспалительным эффектом. Применение комбинации гонадотропина (как стимулятора выработки эстрогена) в сочетании с прогестероном также приводит к дилатации подкожных вен. Однако данная комбинация характеризуется нестойкими количественными характеристиками диаметра МПВ и скорости рефлюксной волны в сочетании с умеренным воспалительным эффектом, что требует дальнейшего наблюдения и изучения.

В отличие от указанных способов применение комбинации препаратов прогестерона и эстрогена приводит к более плавному — этапному хроническому развитию варикозной болезни со стойкими проявлениями. В отличие от контрольной и 3-й групп применение этой комбинации в меньшей степени ассоциировано с воспалительной реакцией организма, что характеризует ее как самую эффективную и предпочтительную.

Таким образом, нами разработан и апробирован способ моделирования длительного варикоза вен конечностей у собак в хроническом эксперименте.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Евсюков Д.А., Цуканов Ю.Т., Дорофеева В.П., Аликберов М.Х., Цуканов А.Ю.

Сбор и обработка материала — Евсюков Д.А., Цуканов Ю.Т., Дорофеева В.П., Снитко И.О., Аликберов М.Х., Цуканов А.Ю.

Написание текста — Евсюков Д.А., Цуканов А.Ю.

Редактирование — Евсюков Д.А., Цуканов Ю.Т., Дорофеева В.П., Аликберов М.Х., Цуканов А.Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.