Введение

Пониманию механизма действия высокомолекулярных соединений в организме служат исследования их реакций с микроокружением этих макромолекул. В таких процессах участвуют разнообразные агенты высокой и низкой молекулярной массы, своим воздействием регулируя функционирование полимерных биологически активных веществ (в частности, изменяя целостность эндотелиального гликокаликса, уровень ферментативной активности биокатализаторов, клеточный рост и миграцию/распространение опухолей). Выявление при этом закономерностей патологического развития поражений способствует обоснованию и определению дизайна эффективных лекарственных средств нового поколения. В настоящее время заметное исследовательское внимание вызывает изучение комплексообразования белков с гликозаминогликанами (ГАГ), цепную структуру которых отличает наличие сотен индивидуальных сахаров, каждый из которых может быть сульфатирован по различным позициям и в разной степени. Установление значения такого разнообразия в ГАГ и родственных им соединениях является важной целью гликобиологии. Заметные успехи в изучении структуры и функций ГАГ достигнуты благодаря применению методов биохимического, структурного и молекулярного моделирования и способствовали выяснению конформационных свойств этих сложных молекул, установлению структурных детерминант их взаимодействия с белками и разработки молекул модельных терапевтических агентов, структурно сходных с ГАГ [1, 2]. Формирование соотношения между структурой ГАГ и природой их взаимодействия с разными белками определяет успешность разработки ГАГ-подобных лекарственных средств. Вместе с тем развитие экспериментальных подходов, отраженное в настоящей работе, стало превращаться из-за мириадного разнообразия взаимодействующих ферментных и сахаридных структур в безмерное накопление исследовательских данных без их внятного доказательного объяснения. Застойный характер ситуации оказался преодолимым благодаря использованию вычислительных методов изучения, последовательно представленных во второй части этого обзорного представления.

Биохимическое исследование взаимодействия гиалуронидазы с гликозаминогликанами

Моделирование ГАГ микроокружения тестикулярной гиалуронидазы (ответственной in vivo за катаболизм гиалуронана) осуществлялось в результате многоточечного ковалентного присоединения к ферменту гликанов после их активации бензохиноном [3]. По своему составу ГАГ предстают гетерополимерами, высокомолекулярная цепь которых состоит из звеньев повторяющихся дисахаридных последовательностей из остатков гексуроновых кислот и гексозамина (рис. 1). Ковалентное конъюгирование гиалуронидазы с ГАГ происходит через поверхностные аминогруппы фермента, меняя их доступность для взаимодействия с титрующим агентом — тринитробензолсульфокислотой — позволяя с его помощью контролировать степень модификации биокатализатора [4]. Вид ГАГ модификаторов гиалуронидазы определял эффекты их воздействия. Дерматансульфат (степень модификации аминогрупп гиалуронидазы 30—33%), гепарин (степень модификации 68—70%) вызывали заметную инактивацию биокатализатора при конъюгировании с такими сополимерными (построенных из альтернативных мономерных звеньев двух и более типов) ГАГ (остаточная ферментативная активность 25—27 и 46—50% от исходной при pH 5,5, соответственно, и 20—22 и 28—30% при pH 7,5, рис. 2). Модификация гиалуронидазы полимерными (построенными из одинаковых звеньев, то есть из мономерных звеньев одного типа) ГАГ (хондроитинсульфат, гиалуронан) способствовала сохранению высокого уровня остаточной ферментативной активности. У конъюгата гиалуронидаза-хондроитинсульфат она оказалась 76—78% от начальной даже при достижении высокой степени модификации фермента 82—88% (см. рис. 1) [3, 5]. Следует отметить, что хондроитинсульфатное микроокружение биокатализатора проявляет наибольший стабилизирующий эффект как в отношении уровня сохраняемой после конъюгирования остаточной эндогликозидазной активности гиалуронидазы, так и в отношении снижения ее ингибируемости гепарином (см. рис. 2). Образование вокруг глобулы гиалуронидазы (при ее конъюгировании с ГАГ) углеводной оболочки способствует развитию взаимодействий, изменяющих стабильность структуры фермента (см. рис. 2).

Рис. 1. Дисахаридные звенья гликозаминогликанов и структурные формулы дисахаридов.

а — гиалуроновая кислота (гиалуронан) и целлобиоза; б — хондроитинсульфат и лактоза, в — гепарин, гепарансульфат и мальтоза. В круглых скобках указаны возможные центры сульфатирования (2-SO₃^–), (2, 3, 6-SO₃^—) составных компонентов дисахаридных звеньев гликозаминогликанов. а, б, в (слева) — гликозаминогликаны и галактозаминогликаны; справа — структурные аналоги полимерных звеньев гликозаминогликанов и галактозаминогликанов.

Рис. 2. Степени модификации аминогрупп гиалуронидазы (%) в нативном виде и при получении ее конъюгатов с хондроитинсульфатом, гепарином и дерматансульфатом (а — последовательно слева направо) и величина остаточной эндогликозидазной активности нативного фермента и его конъюгатов с гликозаминогликанами (последовательно указанными выше) после получасовой инкубации ферментных производных без гепарина и с гепарином (соотношение весовых концентраций фермент:гепарин=1:100 и 1:1000) при комнатной температуре при pH 5,5 (финальный уровень показан прямой линией) и pH 7,5 (финальный уровень обозначен волнистой линией) (б — последовательно слева направо для сравнения присоединенных друг к другу тройных диаграмм).

Высокомолекулярная природа модифицирующих биокатализатор ГАГ обусловливает создание вокруг фермента олигосахаридных слоев, эффекты которых во многом определяются взаимодействием структурных элементов реактантов по центрам их связывания (центрам присоединения на молекулярной поверхности гиалуронидазы и структурным особенностям/различиям дисахаридных звеньев ГАГ). Надо подчеркнуть заметные сложности в современном установлении последовательностей ГАГ из-за относительно недостаточно развитой гликомики и неполного понимания контроля биосинтеза ГАГ в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи [6]. Различие структурных звеньев полимерных и сополимерных ГАГ (см. рис. 1) позволяет связать больший эффект инактивации фермента (см. рис. 2) с присутствием в составе ГАГ остатков идуроновой кислоты (IdoA, гепарин, дерматансульфат L-IdoA-α(1-3)-D-GalNAc(4,6-SO₃^–β(1-4)), α(1-4) (гепарин) и α(1-3) (дерматансульфат) гликозидных связей [3]. В составе структурных звеньев рассматриваемых нами ГАГ (см. рис. 1) имеются остатки IdoA и GlcA. IdoA может быть представлена, по меньшей мере, в трех конформациях ⁴C₁, ¹C₄ и ²S₀, тогда как GlcA имеет только стабильную ⁴C₁ конформацию. Такое положение предполагает структурные отличия ГАГ, обусловленные особенностями отмеченных С-5 эпимеров L-IdoA и D-GlcA [7]. Следует заметить, что проницаемость эндотелиального гликокаликса определяется его ГАГ гиалуронаном (-4(GlcA-β(1-3)-GlcNAc-β1-)_n, а величина объема регулируется протеогликанами [8, 9]. Доминирующие в пространстве последних ГАГ демонстрируют зависимость своих размеров от состава звеньев ГАГ цепей и не зависят от изменения последовательностей [10]. Звенья IdoA увеличивают объем и жесткость ГАГ, а звенья GlcA снижают их пластичность. По этим причинам, возможно, гепарансульфат содержит микроархитектурные элементы для мультивалентного связывания с факторами роста и коллагеном [10], а остатки IdoA (в сравнении с остатками GlcA) отличаются большим деформирующим воздействием на структуру гиалуронидазы, обусловливая сравнительно сниженный уровень остаточной активности фермента при его модификации гепарином или дерматансульфатом по сравнению с присоединением к хондроитинсульфату (см. рис. 2).

Приведенное выше объяснение различия величины остаточной активности гиалуронидазы при конъюгировании с разными ГАГ не выглядит полным из-за отсутствия рассмотрения уже упоминавшихся эффектов гликозидных связей. Их характеристическими параметрами, влияющими на конфигурацию полимерных цепей сахаридных производных, выступают величины торсионных углов (рис. 3), взаимодействия с заместителями в кольцевых элементах олигосахаридных структур (в результате их сульфатирования, ацетилирования и других модификаций по разным позициям), форма соединения гликозидных связей с аксиальным (а) или экваториальным (е) расположением структурных компонентов. Модели структур полисахаридов показывают, что основной вклад в конформационную гибкость их цепей вносят гликозидные связи, характеризуемые величиной степени закручивания — торсионными углами (см. рис. 3) [11]. Именно сохранение степеней свободы изменения торсионных углов определяет гибкость полисахаридных цепей. Отмечено, что сульфатирование по шестой позиции углерода (C-6 сульфатирование) в GalNAc хондроитина существенно не влияет на гибкость его цепи, тогда как C-4 сульфатирование имеет значительный эффект (см. рис. 1, б). Такие результаты объясняются близостью расположения сульфатной группы при C-4 сульфатировании к β(1-3) гликозидной связи. Стерические затруднения, вызванные взаимодействием сульфогруппы с кольцевым кислородом (O) остатка GlcA, снижают гибкость цепи хондроитин-4-сульфата. Напротив, сульфатная группа в хондроитин-6-сульфате имеет дистальную/периферическую локализацию по отношению к β(1-3) и β(1-4) гликозидной связи, что обусловливает ее слабое влияние на гибкость хондроитин-6-сульфатной цепи [11]. Важно, что C-4 сульфатирование GalNAc в хондроитин-4-сульфате демонстрирует высокую плотность отрицательного заряда по гликановой цепи благодаря аксиальному (а) расположению сульфогруппы по отношению к полимерной основе [11]. Такая локализация предупреждает самоассоциацию хондроитин-4-сульфата, укрепляя структуру конъюгированного фермента, не препятствуя продуктивному взаимодействию хондроитин-4-сульфата с гиалуронидазой и придавая ей резистентность к гепариновому ингибированию благодаря сбалансированным эффектам C-4 и C-6 сульфатирования хондроитина (см. рис. 2) [3]. Конфигурация гиалуронана (субстрата гиалуронидазы) отличается одной и той же схемой соединения гликозидных связей этого полимерного ГАГ: 1е-4е и 1е-3е с экваториальной (е) ориентацией гидроксильных групп. Эту же схему соединения гликозидных связей имеет хондроитинсульфат. Отмеченное структурное сходство, возможно, связано с образованием внутригликановых водородных связей экваториальными гидроксильными группами остатка GlcA с соседними группами, что не может выполняться аксиальными (а) ОН-группами остатка IdoA с ¹C₄ конформацией в дерматансульфате.

Рис. 3. Схематическое представление торсионных углов β(1—4) гликозидной связи в полисахаридной цепи, доминирующих в проявлении аномерных и стерических эффектов.

Многоточечное ковалентное присоединение к гиалуронидазе полимерных и сополимерных ГАГ (см. рис. 1) вызывает различные структурные изменения как фермента, так и ГАГ [3]. Они сопровождаются достижением разного уровня остаточной активности биокатализатора и изменением степени его ингибирования гепарином (см. рис. 2). Указанные выше причины обнаруженного варьирования свойств полученных фермент-ГАГ конъюгатов многообразны (различие остатков гексуроновых кислот в ГАГ цепи, изменение их степени закручивания, влияние заместителей (по разным позициям) в гексозных структурах на конформацию последних, тип расположения (а или е) структурных компонентов в цепи углеводных производных), но они не выделяют лимитирующую форму взаимодействий или группу таких взаимодействий, способствующих проявлению наблюдаемых эффектов. Возможно, выявлению причин этих эффектов будет способствовать уменьшение молекулярных размеров ГАГ, когда для упрощения рассмотрения исследуются взаимодействия фермента не с высокомолекулярной формой ГАГ, а с их фрагментами.

Модификация гиалуронидазы низкомолекулярными ди- и моносахаридами

В роли таких фрагментов можно использовать дисахариды, повторяющиеся аналоги звеньев которых составляют цепи ГАГ. В качестве строительного блока (полимерного звена) хондроитинсульфата (как и кератансульфата) можно модельно представить лактозу (Lac, Gal[β1-4]Glc), гиалуронана — целлобиозу (Cel, Glc[β1-4]Glc), гепарансульфата — мальтозу (Mal, Glc[α1-4]Glc) (см. рис. 1) [12, 13]. Для определения соотношения структура—функция гиалуронидазы исследовано гликирование фермента (в нативном виде и в форме ковалентного конъюгата с хондроитинсульфатом) названными ранее дисахаридами [5] и моносахаридами (глюкозой/Glc/ и галактозой /Gal/) [14]. Инкубация нативной гиалуронидазы в течение восьми суток (37 °C при pH 5,5 или pH 7,5) вызывает инактивацию фермента с монотонным снижением количества титруемых аминогрупп и заметным ингибированием гепарином (рис. 4, а, б). Добавление к раствору субстрата гепарина приводит к резкому падению ферментативной активности уже в начальный момент времени при ее определении (на 62—64%) с дальнейшим снижением на 22—30% (см. рис. 4, б). Воздействие дисахаридов изменяет величину остаточной эндогликозидазной активности биокатализатора и еще в большей мере снижает количество его титруемых аминогрупп. Наиболее заметны указанные эффекты при инкубации нативного фермента с Lac или смесью дисахаридов (Mal, Cel и Lac). В последнем случае достигается наибольшая величина инактивации гиалуронидазы (до уровня остаточной активности фермента 55—60% при pH 5,5 и 54—58% при pH 7,5) и происходят значимые конформационные перестройки молекулы фермента, когда количество его титруемых аминогрупп снижается за сутки инкубации (до 55% при pH 5,5 и 70% при pH 7,5) с последующим его увеличением (до 98% при pH 5,5 и 110% при pH 7,5, см. рис. 4) [5]. В ряду использованных дисахаридов указанные эффекты деформирующей инактивации биокатализатора могут ассоциироваться со структурными различиями этих гликирующих агентов, а именно, с присутствием галактозного остатка в Lac (Gal[β1-4]Glc, см. рис. 1), что подчеркивает сравнительно мягкий характер гликирования Cel (Glc[β1-4]Glc, см. рис. 4). Кроме того, взаимодействие нативной гиалуронидазы с моносахаридами (Glc и Gal) обнаруживает больший инактивирующий эффект Gal (уровень остаточной активности биокатализатора 65% при pH 5,5) и смеси моносахаридов (Glc и Gal, остаточная активность фермента 61% при pH 5,5 и 66% при pH 7,5) с быстрым и существенным уменьшением степени экспонирования аминогрупп белка [14]. Гликирование гиалуронидазы сахаридами демонстрирует заметное инактивирующее воздействие на ее структуру остатков Gal с указанием важности для проявления таких изменений C-4 эпимеризации Glc и Gal и сравнительно высокой эффективности гликирования биокатализатора смесью сахаридов.

Рис. 4. Изменение финальной степени модификации аминогрупп нативной гиалуронидазы (%) после ее инкубирования в течение восьми суток без и в присутствии мальтозы, целлобиозы, лактозы и их смеси при pH 5,5 и 7,5 (а) и величины остаточной эндогликозидазной активности фермента до инкубации с гепарином (прямая линия) и после восьми суток инкубации с гепарином, дисахаридами и их смесью (б).

Внутри сравниваемых диаграмм волнистой линией обозначен уровень активности фермента в начальный момент времени после добавления гепарина (соотношение весовых концентраций биокатализатор:гепарин составляет 1:100), пунктирной линией показан уровень остаточной активности биокатализатора после восьми суток инкубации с гепарином и дисахаридами (соотношение весовых концентраций фермент:дисахарид 1:100).

Большие эффекты гликирования нативной гиалуронидазы Mal (Glc[α1-4]Glc) в сравнении с Cel (Glc[β1-4]Glc), уровень остаточной активности фермента в начале и после восьми суток инкубации с гепарином в присутствии Mal 43 и 23% при pH 5,5 соответственно, а с Cel 20 и 14%, аналогично падению ферментативной активности в начальный момент времени после добавления гепарина в присутствии Mal 42—48% pH 5,5, а Cel 78—80% (pH 5,5) (см. рис. 4), что подразумевает меньшее стабилизирующее действие β(1-4) гликозидной связи Cel по сравнению с α(1-4) гликозидной связью Mal [5]. Отметим и стабилизирующий эффект Cel, когда термостабильность нативной гиалуронидазы (по величине остаточной активности) выше при pH 5,5 с Cel, чем без нее, а при pH 7,5 сходна друг с другом, сближаясь с эффектами в присутствии Mal (см. рис. 4, б).

Формирование вокруг глобулы гиалуронидазы слоев хондроитинсульфата (при конъюгировании с ним фермента) повышает стабильность белка против термоинактивации, гликирования дисахаридами, ингибирования гепарином (рис. 5) [5]. Экранирование цепями хондроитинсульфата заметного количества центров присоединения на молекулярной поверхности фермента сокращает возможности гликирующего воздействия. В результате его интенсивность специфически возрастает, нацеливая дисахариды на оставшиеся доступными подходящие белковые центры. Такое положение обусловливает сходство с воздействием на гиалуронидазу смеси дисахаридов с изменением вида кривых экспонирования аминогрупп конъюгата гиалуронидаза—хондроитинсульфат при осуществлении гликирования, особенно на поздних сроках инкубации, заметно отличаясь от случая нативного биокатализатора (см. рис. 4, а, рис. 5, а). Причиной этого может, по-видимому, выступать другой тип конформационных изменений ферментного конъюгата (с укреплением жесткости структуры белка при его конъюгировании с хондроитинсульфатом и изменения интенсивности воздействия дисахаридов) по сравнению с нативным биокатализатором. Заметно протективное действие хондроитинсульфатной модификации гиалуронидазы в отношении уменьшения ингибирования эндогликозидазной активности полученного конъюгата гепарином (как по величине его начального действия, так и по глубине последующего снижения ферментативной активности, (см. рис. 5, б) по сравнению с ингибирующими эффектами, достигаемыми с нативным биокатализатором (см. рис. 4, б).

Рис. 5. Изменение степени модификации аминогрупп гиалуронидазы (%) в ее ковалентном конъюгате с хондроитинсульфатом при его инкубации в течение восьми суток без и в присутствии мальтозы, целлобиозы, лактозы и их смеси (соотношение весовых концентраций ферментное производное: дисахарид 1:100) при pH 5,5 и pH 7,5 (а) и величины остаточной эндогликозидазной активности ферментного конъюгата после восьми суток инкубации без гепарина (прямая линия) и с гепарином и дисахаридами при pH 5,5 и pH 7,5 (б).

Внутри сравниваемых диаграмм волнистой линией показан уровень активности фермента в начальный момент времени после добавления гепарина (соотношение весовых концентраций ферментный конъюгат:гепарин 1:100) и величина врезанной диаграммы указывает на значение дальнейшего уменьшения/снижения активности гиалуронидазы в ее конъюгате с хондроитинсульфатом при продолжении его инкубации с гепарином в течение восьми суток (т.е. глубина падения активности конъюгата гиалуронидаза—хондроитинсульфат как разница в величинах ферментативной активности на начальный и конечный момент времени проведения инкубации).

Гликирование нативной гиалуронидазы дисахаридами обнаруживает повышенное инактивирующее действие на фермент смеси дисахаридов (Mal, Cel, Lac) и остатков Gal (как в составе Lac, так и под воздействием самого моносахарида Gal [14] в отсутствие существенного уменьшения остаточной активности биокатализатора (без гепарина) при инкубации с Mal или Cel, см. рис. 4, б). Эффекты сравнительного действия на фермент Mal и Cel демонстрируют их противоречивое проявление (в сопоставлении влияния α(1-4) и β(1-4) гликозидных связей, как и по сравнению с показателями нативного биокатализатора, см. рис. 1, а, б, рис. 4, б). Изменение характера конформационных переходов нативной гиалуронидазы при ее обработке смесью дисахаридов (со степенью модификации биокатализатора, определяемой по титрованию поверхностных аминогрупп фермента тринитробензолсульфокислотой (ТНБС) [4] и вызывающей их начальное снижение и последующее увеличение до исходного уровня и выше) по сравнению с действием отдельных дисахаридов (см. рис. 4, а) подчеркивает значение гликирования биокатализатора многокомпонентным составом модификаторов, укрепляющим эффективное многообразие микроокружения молекулы фермента и реализуемое посредством многоцентрового воздействия на нее. Сходный рост титруемых аминогрупп конъюгата гиалуронидаза—хондроитинсульфат на поздних сроках инкубации отмечен для случая его гликирования дисахаридами (см. рис. 5, а), подкрепляя вероятность изменения типов конформационных переходов этого конъюгата по сравнению с таковыми для нативного биокатализатора с отдельными дисахаридами (см. рис. 4, а). Стабилизация гиалуронидазы конъюгированием с хондроитинсульфатом (см. рис. 5, б) обусловлена укреплением структуры фермента благодаря его многоточечной/многоцентровой модификации цепью этого ГАГ, развитием ее специфических взаимодействий с молекулой биокатализатора и, как можно полагать, созданием продуктивного многообразия микроокружения фермента. В результате фрагменты хондроитинсульфата повышают стабильность структуры гиалуронидазы, но конкретные причины этого пока не ясны. Более того, взаимодействие нативного фермента со структурным аналогом хондроитинсульфата Lac (см. рис. 1, б) заметно снижает его остаточную активность и не препятствует ингибированию гепарином (см. рис. 4, б).

Заключение

Для выявления механизма регуляции эндогликозидазной активности гиалуронидазы необходимы иные исследовательские подходы, позволяющие достаточно детально и последовательно следить за изменениями конформации фермента при его взаимодействии с лигандами гликозаминогликанов и самими гликозаминогликанами. Следует также представлять, что в настоящее время наше понимание механизма связывания лигандов с макромолекулами развивается не только по пути описания индуцированного соответствия (когда начальный этап связывания реактантов подразумевает последующие конформационные изменения для образования рационального комплекса между высокомолекулярным и лигандным компонентами), но и с отбором/выбором лигандом оптимальной конформации целевого партнера, существующего в их множественных равновесных формах [15]. Развиваемые вычислительные методы способствуют согласованию данных упомянутых подходов и определению критериев доминирующего направления связывания лигандов.

Экспериментальные подходы и методы исследования

Ферментативную активность препаратов гиалуронидазы определяли с помощью вискозиметра Оствальда B-434 (США), измеряя время истечения раствора при 37 °C с конечной концентрацией в вискозиметре — гиалуронана 0,06%, гиалуронидазы 4 мкг/мл в 0,1 М фосфатном буфере pH 5,5 или pH 7,5, содержащем 0,15 М NaCl [3]. Активность фермента выражали в единицах формулярного стандарта/состава (NFU) относительно коммерческого препарата бычьей тестикулярной гиалуронидазы от фирмы Sigma (H 3884), США. Специфическая эндогликозидазная активность предварительно очищенного (сефадекс G-100, Pharmacia, Швеция) препарата нативной бычьей тестикулярной гиалуронидазы (производства ГУП «Иммунопрепарат», Россия) — 950—970 NFU/мг белка. Она принималась за 100%.

Активацию ГАГ бензохиноном вели, растворяя в 6 мл 0,02 М фосфатного буфера, pH 6,0, 10—100 мг ГАГ и прибавляя 100 мг бензохинона (растворенного в 3 мл диметилформамида). Смесь инкубировалась в течение 1,5 ч в темноте при комнатной температуре, а затем ее очищали от избытка бензохинона гель-хроматографически (сефадекс G-25, Pharmacia, Швеция) или диализом против 0,02 М фосфатного буфера, pH 6,0, в течение 8—10 ч при комнатной температуре [3]. Иодометрически определялось количество гидрохиноновых центров присоединения на ГАГ цепи.

Ковалентное конъюгирование гиалуронидазы с активированным ГАГ выполняли добавлением к 10 мл очищенного раствора активированного бензохиноном ГАГ (натриевая соль гепарина (16—18 кДа) бычьего происхождения дерматансульфат из кожи свиньи (20—30 кДа), хондроитинсульфат из трахеи быка (30—50 кДа) 18 мг очищенной нативной гиалуронидазы (по белку), прибавляли 1 М NaOH до значения pH 8,2—8,7 и инкубировали смесь в темноте в течение 18—22 ч. Концентрация фермента в инкубационной смеси 20 мкМ, активированного ГАГ 5—10 мкМ. Гель-хроматографически на колонке сефадекса G-100, уравновешенной 0,025 М фосфатным буфером с 0,075 М NaCl, pH 7,5, выполняли очистку полученного продукта и элюат лиофилизировали. Остаточная эндогликозидазная активность конъюгата гиалуронидаза—хондроитинсульфат составила 76—78% от активности исходного фермента, степень модификации аминогрупп 84—86%, содержание белка в модифицированном производном 3—6% [3, 5].

Гликозилирование гиалуронидазы с дисахаридами (Lac, Mal, Cel) и с моносахаридами (Glc и Gal) осуществляли инкубацией производных биокатализатора в 0,05 М фосфатном буфере pH 5,5 или pH 7,5 (с 0,15 М NaCl) при 37 °C. Концентрация белка в растворе составила 0,02 мг/мл, сахарида — 2 мг/мл. Инкубацию вели в течение восьми суток, отбирая из реакционного раствора пробы по 0,1 мл и определяя их эндогликозидазную активность.

Содержание белка в препаратах нативной и модифицированной гиалуронидазы определяли по методу Бредфорд [16].

Степень модификации гиалуронидазы устанавливали титрованием поверхностных аминогрупп фермента ТНБС [4, 5, 14].

Ингибирование гиалуронидазных производных гепарином определяли по величине их остаточной эндогликозидазной активности в присутствии избытка гепарина. В вискозиметре к реакционной смеси в 0,1 М фосфатном буфере, pH 5,5 или pH 7,5, с 0,15 М NaCl (при одинаковой концентрации по белку 4 мкг/мл) добавляли гепарин (соотношение весовых концентраций биокатализатор/гепарин 1:100 или 1:1000) и после 0,5 часовой инкубации при комнатной температуре вискозиметрически определяли эндогликозидазную активность фермента [3, 5, 14].

Финансирование. Настоящее исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Российского фонда фундаментальных исследований (грант 18-015-00056).

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или с использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.