Введение

Кровь играет ключевую роль в регенеративных механизмах и иммунологической защите организма. Компоненты крови, такие как обогащенная тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma, PRP), обогащенная лейкоцитами и тромбоцитами плазма (leukocyte-rich PRP, L-PRP), обогащенный тромбоцитами фибрин (platelet-rich fibrin, PRF) бесклеточная плазма, аутологичная (Orthokine) или аллагенная сыворотка, нашли широкое применение в современной восстановительной медицины. Эти компоненты используются в лечении суставной патологии [1,2,3,4,5,6], болей разного генеза [7,8], дегенеративных кожных заболеваний [9], травматических и возрастных заболеваний органов зрения [10,11], челюстной патологии [12,13], а также длительно незаживающих раз различного происхождения [14,15]. Важно то, что компоненты крови обладают не только регенеративной, но и противоинфекционной активностью [16,17], наличие которой во многих случаях определяет течение заболевания. Очевидным недостатком компонентов крови с медицинской точки является отсутствие исходных критериев оценки их иммунобиологических свойств. Показания для их применения часто размыты, а результаты их использования вариабельны [12]. Ниже описан технически легко выполнимый тест, характеризующий иммунобиологическую реактивность крови, который может использован перед получением ее компонентов. Кроме того, этот тест дает возможность получать компоненты крови с заданными (оптимизированными) иммунобиологическими свойствами для того, чтобы использовать их более адресно и эффективно.

Материалы и методы

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» (протокол №9, 2024).

Тест на иммунореактивность цельной крови

Забор венозной крови у здоровых доноров (мужчины 25—45 лет) осуществляли в предварительно охлажденные вакуумные пробирки с гепарином (зеленая крышка) или без гепарина (красная крышка). Пробирки с кровью сразу помещали на лед. Далее кровь из каждой пробирки делили на 4 равные части (по 2 мл) и добавляли по 50 мкл в одну часть физиологический раствор, в другую — липополисахарида (ЛПС Salmonella typhi, Пирогенал, конечная концентрация в образце — 1 мкг/мл), в третью — Кон А (Sigma, конечная концентрация 10 мкг/мл) и в четвертую — ЛПС и Кон А. Все образцы инкубировали при 37.5 °C в течение 18 ч. Для получения плазмы или сыворотки пробирки центрифугировали при 2000 g в течение 20 мин, после чего надосадочные (бесклеточные) жидкости размещали по 0.5 мл в микропробирки и в замороженном виде хранили их до последующего анализа.

Определение содержания цитокинов в плазме и сыворотке

Содержание TNF-α, IFN-гамма, VEGF, IL-2, IL-6, IL-10 в образцах определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем производства Вектор-Бест (Новосибирск), согласно инструкциям производителя этих тест-систем.

Статистический анализ

Достоверность различий между образцами, полученными от одной и той же выборки доноров оценивали с использованием парного критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при p<0,05.

Результаты

Для стимуляции клеток крови были использованы 2 активатора: ЛПС и Кон А. ЛПС является термостабильным компонент наружной части клеточной мембраны всех грамотрицательных микроорганизмов. Он связывает комплекс рецепторов CD14/TLR4/MD2, расположенных преимущественно на фагоцитарных клетка и B-лимфоцитах, и является мощным активатором врожденного иммунитета (https://en.wikipedia.org/wiki/Lipopolysaccharide). КонА –растительный лектин, способный связываться со структурами, содержащими остатки α-D-маннозила и α-D-глюкозила. Он активирует лимфоциты, преимущественно Т-клетки (https://en.wikipedia.org/wiki/Concanavalin_A).

Рис. 1 показывает влияние митогенов на секрецию клетками крови TNF-α. Содержание TNF-α в нестимулированных образцах крови не превышало 1000 пк/мл. ЛПС индуцировал выраженный прирост клеточной секреции этого цитокина (p< 0,01), тогда как присутствие Кон А в крови не оказывало существенного влияния на этот процесс. Содержание TNF-α в пробах с ЛПС было существенно выше содержания в пробах с Кон А (p<0,01). Сходные данные были получены как в плазменных пробах с гепарином, так и в сывороточных пробах без гепарина.

Рис.1. Содержание TNF-α в митоген-стимулированных образцах крови.

Показано содержание TNF-α в пробах без гепарина (синие столбцы) и в пробах с гепарином (оранжевые столбцы). Представлены результаты (M+m, среднее+ошибка среднего) 7 однотипных опытов.

Содержание IL-6 в нестимулированных образцах крови не превышало 400 пг/мл. Как и в случае с TNF-α, ЛПС, но не Кон А, существенно стимулировал секрецию IL-6 клетками крови (p<0,05). Содержание IL-6 в пробах с ЛПС было существенно выше содержания в пробах с Кон А (p< 0,03). Совместный эффект ЛПС и Кон А на кровь не превышал эффекта, индуцированного одним ЛПС (рис. 2).

Рис. 2. Содержание IL-6 в митоген-стимулированных образцах крови.

Показано содержание цитокина в пробах без гепарина (синие столбцы) и в пробах с гепарином (оранжевые столбцы). Представлены результаты (M+m) 7 однотипных опытов.

Содержание IL-2 в нестимулированных образцах крови находилось на неоопределяемых уровнях. Как ЛПС, так и Кон А, заметно усиливали секрецию этого цитокина (рис. 3). Интересно, что особенно выраженный прирост IL-2 имел место в сывороточных пробах, стимулированных одновременно ЛПС и Кон А (p< 0,05 в сравнении с плазменными пробами).

Рис.3. Содержание IL-2 в митоген-стимулированных образцах крови.

Показано содержание цитокина в пробах без гепарина (синие столбцы) и в пробах с гепарином (оранжевые столбцы). Представлены результаты (M+m) 5 однотипных опытов.

Как и в случае с IL-2, содержание IFN-γ в нестимулированных образцах крови находилось близко к нулевым значениям. Оба активатора ЛПС и Кон А демонстрировали значимую способность стимулировать клеточную продукцию этого цитокина (рис. 4) Интересно, что в отличие от проб с другими исследованными цитокинами, наиболее выраженный прирост секреции IFN-γ был вызван одновременным воздействием ЛПС и Кон А. По-видимому, здесь имело место суммирование действий на клетки двух активаторов.

Рис.4. Содержание IFN-γ в митоген-стимулированных образцах крови.

Показано содержание цитокина в пробах без гепарина (синие столбцы) и в пробах с гепарином (оранжевые столбцы). Представлены результаты (M+m) 5 однотипных опытов.

Содержание IL-10 в нестимулированных образцах крови не превышало 20 пг/мл. ЛПС и КОН А примерно в одинаковой степени умеренно стимулировали секрецию клетками крови этого цитокина (рис. 5). Наибольший прирост секреции был отмечен в сывороточных пробах, одновременно стимулированных ЛПС и КонА, тогда как в плазменных пробах содержание этого цитокина находилось на относительно низких уровнях.

Рис. 5. Содержание IL-10 в митоген-стимулированных образцах крови.

Показано содержание цитокина в пробах без гепарина (синие столбцы) и в пробах с гепарином (оранжевые столбцы). Представлены результаты (M+m) 7 однотипных опытов.

Содержание IL-10 в нестимулированных образцах крови не превышало 100 пг/мл. Как в плазменных, так и сывороточных пробах ЛПС более эффективно стимулировал секрецию VEGF, а содержание этого цитокина в сывороточных пробах было заметно выше в сравнении с аналогичными плазменными пробами (рис. 6). По-видимому, свертывание крови само по себе оказывало существенной стимулирующее влияние на секрецию VEGF активированными клетками крови.

Рис. 6. Содержание VEGF в митоген-стимулированных образцах крови.

Показано содержание цитокина в пробах без гепарина (синие столбцы) и в пробах с гепарином (оранжевые столбцы). Представлены результаты (M+m) 7 однотипных опытов.

Обсуждение

Иммунореактивность крови определяет течение воспалительных реакций в организме, а также их конечную нацеленность: в норме — это защита от патогенов, при патологии — это развитие болезни. Важно, что наша экспериментальная модель максимально приближена к естественным условиям — в исследуемых пробах не было никаких синтетических культуральных добавок, лишь гепарин добавлялся в кровь с целью ингибирования процесса ее свертывания. В этой модели было изучено влияние природных активаторов иммуногенеза на секрецию про-воспалительных (TNF–alfa, ИЛ-6, IFN-gamma) и антивоспалительных цитокинов (IL-10 и VEGF). Известно, что дисбаланс продукции этих цитокинов в организме приводит к развитию патологических состояний [18]. Особняком в ряду цитокинов стоит ИЛ-2. В зависимости от условий он может проявлять как про-, так и антивоспалительную активность. IL-2 является ключевым ростовым фактором лимфоцитов и играет основополагающую роль в формировании иммунной памяти (https://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_2). Как и следовало ожидать, в нашей экспериментальной модели ЛПС преимущественно усиливал секрецию цитокинов (TNF–alfa, IL-6, IL-10 и VEGF), основными продуцентами которых являются клетки врожденного иммунитета, тогда как Кон A преимущественно стимулировал лимфоидную секрецию IL-2 и IFN-гамма — цитокинов, вовлеченных в развитие адаптивных иммунных реакций. На наш взгляд, экспериментальная модель, где имеет место одновременное воздействие ЛПС и Кон А на клетки крови на фоне свертывания крови наиболее приближена к реальным событиям, происходящим в организме. В действительности, проникновение инфекционного патогена в организм, часто сопровождается нарушением сосудистого русла, а активация врожденного иммунитета создает необходимые предпосылки для развития адаптивных иммунных реакций. С нашей точки зрение оценка базовой иммунореактивности крови могла бы быть чрезвычайно полезна при получении и лечебном использовании компонентов крови. В частности, разрабатываемая нами технология позволяет посредством относительно кратковременного (до 18 ч) воздействия на кровь фармакологическими иммуномодуляторами существенно влиять на иммунореактивность крови и, таким образом, усиливать лечебную активность ее клеточных и жидких компонентов. Есть основания также надеяться, что оценка иммунореактивности цельной крови может иметь прогностическое значение у больных с острыми и хроническими иммунологическими расстройствами, а также характеризовать эффективность воздействия на организм различных иммунотропных воздействий. Конечно, все эти предположения требуют дальнейших экспериментальных и клинических подтверждений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.