В настоящее время увеличивается потребность в применении клеточной терапии для ускорения репаративных процессов и восстановления поврежденных тканей у пациентов после некоторых заболеваний, хирургических операций и травм. С открытием иммуномодуляторных свойств мультипотентных стромальных клеток (МСК) клеточная терапия стала рассматриваться как возможное средство коррекции иммунных нарушений [1]. Введение МСК — перспективный метод лечения очень многих аутоиммунных и воспалительных заболеваний [2—4]. При этом снижается активность не только иммунной воспалительной реакции [3, 5, 6], но и острого воспалительного процесса [7—10]. Необходимо обратить внимание на то, что МСК и их экзосомы не только обладают иммуномодуляторным эффектом, но часто проявляют и иммуносупрессивное действие [1, 11, 12].

В связи с очевидным изменением воспалительного процесса в месте хирургического вмешательства и расположения медленно лизируемой лигатуры после применения аутологичных мезенхимальных МСК (ММСК) костномозгового происхождения в целях коррекции острого локального нарушения венозного оттока в эксперименте [13, 14] была поставлена цель — исследовать морфологическими методами особенности воспалительной реакции в тканях крыс после введения ММСК на фоне лигирования магистральной вены.

В качестве модели были использованы 6-месячные самцы крыс линии Wag массой тела 180—200 г. Все исследования проводили с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных, все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом.

ММСК получали и культивировали по методике, представленной нами ранее [13—16]. Для моделирования острой локальной венозной непроходимости осуществляли хирургический доступ к v. femoralis, перевязывали ее нитью из поливолоконного плетеного шовного материала Викрил 3/0 с атравматической иглой и ушивали кожную рану этим же материалом. Через сутки, продезинфицировав кожу спиртом, инсулиновым шприцем однократно вводили 100 мкл суспензии ММСК в культуральной среде (в 1 мл содержалось 1·10⁶ клеток с жизнеспособностью не менее 92%) в область лигированной вены: иглу вводили подкожно, примерно на 1 см дистальнее разреза, продвигали в проксимальном направлении до лигатуры (которая хорошо пальпировалась через кожу даже после операции), наложенной на вену. Животных выводили из эксперимента через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после инъекции ММСК. В качестве контроля использовали интактных крыс, животных с перевязанной веной без использования ММСК и ложнооперированных (с разрезом кожи без лигирования вены с последующим введением ММСК). В каждой группе было 11—12 животных.

V. femoralis с окружающими тканями фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе Axioimager M1 при увеличении до 1200 раз.

Для исследования активности воспалительной реакции оценивали абсолютное число всех лейкоцитов и отдельно нейтрофилов на площади среза тканей 10⁵ мкм² в области хирургического вмешательства и расположения лигатуры. Проводили измерения изображений, полученных при помощи цифровой видеокамеры микроскопа, на экране компьютера с использованием программного обеспечения морфологического модуля Axiovision («Zeiss», Германия). У каждого животного проводили от 3 до 5 измерений различных случайных срезов, ориентируясь на получение максимальной площади. При использовании объектива с увеличением 10 конечная площадь тестового прямоугольника была равна 1 400 000 мкм² (стороны 1400×1000 мкм), при объективе ×40 — 87 500 мкм² (стороны 350×250 мкм).

Статистическую обработку результатов проводили в прикладной статистической программе MS Excel 7.0 («Microsoft», США), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Значимость различий сравниваемых средних величин определяли на основании t-критерия Стьюдента. Значимым считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше. При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному.

Изменения тканей, связанные с лигированием магистральной вены, а также процессы восстановления кровотока без применения ММСК и на фоне использования клеточных технологий изложены в наших предыдущих работах [13, 14]. Поэтому в данном случае мы остановимся только на изменениях, характеризующих воспалительный процесс в поврежденных при хирургическом вмешательстве тканях.

У интактных крыс в клетчатке из жировой и рыхлой волокнистой соединительной ткани вокруг сосудисто-нервного пучка бедра были расположены только единичные лимфоциты и макрофаги, крайне редко встречались нейтрофилы (рис. 1, а,

Через 4 сут после операции в тканях в месте хирургического вмешательства у животных всех групп возросло число всех лейкоцитов и особенно нейтрофилов. В области разреза и ушивания кожи появились лейкоцитарные инфильтраты, но большое содержание в них нейтрофильных лейкоцитов было найдено у некоторых животных после лигирования вены без применения ММСК. Минимальный уровень лейкоцитарной инфильтрации был отмечен у ложнооперированных крыс после введения ММСК без предварительного лигирования вены.

Через 1 нед в тканях региона операции визуально сократилась степень лейкоцитарной инфильтрации, уменьшилось содержание нейтрофилов, диффузно расположенных как в клетчатке, так и в инфильтратах. Но в тканях находились фрагменты еще не лизированного шовного материала с небольшими гранулемами инородных тел вокруг.

На 2-й и 3-й неделях происходило дальнейшее постепенное уменьшение выраженности лейкоцитарной инфильтрации, которая сохранялась только рядом с лигатурой вокруг бедренной вены и в области швов, наложенных на кожу. Рядом с шовным материалом, кроме лейкоцитарной инфильтрации, можно отметить присутствие многочисленных мелких сосудов, скорее всего грануляций, свежих и старых (с сидерофагами) геморрагий, большого количества расположенных поодиночке макрофагов и лимфоцитов, а также формирование гранулем с многоядерными макрофагами со слившейся цитоплазмой (см. рис. 1, в—з).

Следует отметить, что в этот промежуток времени большинство животных избавлялось от шовного материала в регионе разреза кожи, что способствовало резкому снижению активности воспалительного процесса у крыс с лигированной веной и практически полному его затуханию у ложнооперированных особей (с инъекцией ММСК без венозной блокады) (см. рис. 1, в—з).

В последующие сроки (4-я и 5-я недели) видимых отличий между оперированными крысами и животными из группы интактного контроля не обнаруживалось, за исключением так и не абсорбированной окончательно лигатуры из лизируемого материала, наложенной на магистральную вену.

Даже спустя 5 нед после операции в тканях присутствовали достаточно объемные остатки шовного материала, использованного для перевязки бедренной вены. Фрагменты полифиламентной нити были инкапсулированы, более мелкие волокна окружены соединительной тканью с большим числом макрофагов, в том числе многоядерных форм со слившейся цитоплазмой. Фагоциты вместе с фибробластами окутывали отдельные филаменты нити, отдаляя их друг от друга, таким образом разволокняя нить (рис. 2, а—з).

Результаты объективного изучения численности всех лейкоцитов в тканях в месте операции по моделированию острой локальной блокады магистральной вены представлены в табл. 1.

При лигировании вены без введения ММСК численная плотность всех лейкоцитов на площади среза тканей 10⁵ мкм² на 4-е сутки, через 1, 2, 3 и 4 нед была выше в 32,1, 23,8, 16,8, 7,5 и 2,9 раза соответственно, чем у интактных крыс. На 4-е сутки всех лейкоцитов было больше на 34,6 и 90,6%, в 4,3, 11,1 и 20,9 раза соответственно, чем через 1, 2, 3, 4 и 5 нед. Величина данного показателя через 1 нед была больше на 41,6%, в 3,2, 8,2 и 15,5 раза соответственно по сравнению со сроками 2, 3, 4 и 5 нед. Через 2 нед лейкоцитов было больше в 2,2, 5,8 и 11 раз соответственно, чем через 3, 4 и 5 нед. К 3-й неделе число лейкоцитов оставалось больше в 2,6 и 4,9 раза соответственно, чем на 4-й и 5-й неделях. На 4-й неделе количество лейкоцитов было больше на 88,3% по сравнению с 5-й неделей.

У ложнооперированных крыс после введения ММСК без изменения венозного кровотока количество лейкоцитов на единицу площади среза на 4-й день, 1, 2 и 3-й неделях было больше в 17,9, 9,2, 4,4 и 2,2 раза соответственно, чем у интактных крыс. Спустя 4 сут лейкоцитов было больше на 94,9%, в 4,1, 8,3, 11,5 и 13 раз соответственно, чем на 1, 2, 3, 4 и 5-й неделях. Данный показатель на 1-й неделе был больше в 2,1, 4,3, 5,9 и 6,7 раза соответственно, чем на 2, 3, 4 и 5-й неделях. Через 2 нед лейкоцитов было больше в 2, 2,8 и 3,2 раза соответственно, чем через 3, 4 и 5 нед. К 3-й неделе число лейкоцитов оставалось больше на 56,9%, чем на 5-й неделе.

Содержание лейкоцитов на единицу площади среза тканей после инъекции ММСК в проекции перевязанной вены также на 4-е сутки, 1, 2 и 3-й неделях было выше в 23,8, 9,3, 4,7 и 2,3 раза соответственно, чем у интактных крыс. Спустя 4 сут лейкоцитов было больше в 2,6, 5,1, 10,6, 15,4 и 17,2 раза соответственно, чем на 1, 2, 3, 4 и 5-й неделях. Значение этого показателя на 1-й неделе была выше на 97,6%, в 4,1, 6,0 и 6,7 раза соответственно, чем на 2, 3, 4 и 5-й неделях. Через 2 нед лейкоцитов было больше в 2,1, 3,0 и 3,4 раза соответственно, чем через 3, 4 и 5 нед. К 3-й неделе число лейкоцитов оставалось выше на 45,8 и 62,8% соответственно, чем на 4-й и 5-й неделях.

На 4-й день у ложнооперированных крыс после введения ММСК численная плотность всех лейкоцитов была меньше на 79,4 и 33,3% соответственно, чем у животных с лигированием вены без инъекции ММСК и после применения ММСК на фоне перевязанной вены. При этом значение данного показателя при лигированной вене с применением ММСК было меньше на 34,6%, чем при блокаде вены без последующего введения ММСК.

Через 1 нед после моделирования острой венозной блокады без использования ММСК лейкоцитов на площади среза тканей 10⁵ мкм² было больше в 2,6 раза, чем у ложнооперированных крыс и животных после инъекции ММСК в проекции лигированной вены.

Спустя 2 нед после лигирования вены без применения ММСК численная плотность лейкоцитов была больше в 3,8 и 3,6 раза соответственно, чем у ложнооперированных крыс и животных после инъекции ММСК в проекции лигированной вены.

На 3-й неделе после перевязывания вены без введения ММСК абсолютное количество лейкоцитов было больше в 3,5 и 3,3 раза соответственно, чем у ложнооперированных крыс и животных после инъекции ММСК в проекции лигированной вены.

К 4-й неделе после наложения лигатуры на вену без инъекции ММСК содержание лейкоцитов на единице площади среза тканей было больше на 86 и 87,1% соответственно, чем у ложнооперированнх крыс и животных после инъекции ММСК в проекции лигированной вены (см. табл. 1).

Результаты объективного изучения численности нейтрофилов в тканях в месте операции по моделированию острой локальной блокады магистральной вены представлены в табл. 2.

При лигировании вены без введения ММСК численная плотность нейтрофилов на площади среза тканей 10⁵ мкм² на 4-е сутки и 1-й неделе была выше в 415 и 355 раз соответственно, чем у интактных крыс. На 4-е сутки нейтрофилов было больше в 12,1, 43,8, 183 и 351 раз соответственно, чем через 2, 3, 4 и 5-й неделях. При этом величина данного показателя на 1-й неделе была выше в 10,4, 37,4, 156 и 300 раз соответственно по сравнению со 2, 3, 4 и 5-й неделями.

У ложнооперированных крыс после введения ММСК без изменения венозного кровотока абсолютное число нейтрофилов только на 4-й день и 1-ю неделю было выше в 309 и 71,2 раза соответственно, чем у интактных крыс. Через 4 сут этих лейкоцитов было больше в 4,3; 63,4; 196; 300 и 378 раз соответственно, чем на 1, 2, 3, 4 и 5-й неделях. Данный показатель на 1-й неделе был выше в 14,6; 45,2; 69,1 и 87 раз соответственно по сравнению с в 2, 3, 4 и 5-й неделями.

Число нейтрофилов после инъекции ММСК в проекции перевязанной вены на 4-е сутки и 1-й неделе было выше в 391 и 74,2 раза соответственно, чем у интактных крыс. Спустя 4 сут нейтрофилов было больше в 5,3, 63,9, 211, 243 и 416 раз соответственно, чем на 1, 2, 3, 4 и 5-й неделях. Значение этого показателя на 1-й неделе было выше в 12,1, 40,2, 46,2 и 79 раз соответственно, чем на 2, 3, 4 и 5-й неделях.

Через 1 нед после моделирования острой венозной блокады без использования ММСК абсолютное число нейтрофилов на площади среза тканей 10⁵ мкм² было больше в 5 и 4,8 раза соответственно, чем у ложнооперированных крыс и животных после инъекции ММСК в проекции лигированной вены (см. табл. 2).

На всех остальных сроках статистически достоверные различия лейкоцитарной инфильтрации и содержания нейтрофилов между сравниваемыми группами крыс не обнаружены (см. табл. 1 и 2).

В любой ткани всегда содержится некоторое количество лейкоцитов, в первую очередь лимфоцитов, которые принимают участие в элиминации антигенов, как проникающих извне, например при повреждениях эпителиальной выстилки, так и образующихся на месте при естественной гибели и замене клеток и межклеточного матрикса. Кроме того, в процессах функционирования и реорганизации соединительной ткани, к которой также относится и жировая ткань, принимают активное участие макрофаги. Вследствие этого в паравазальной клетчатке магистральной вены интакных животных были найдены единичные лимфоциты и макрофаги.

Диффузная лейкоцитарная инфильтрация с преобладанием лимфоцитов и макрофагов у животных после моделирования острой локальной непроходимости магистральной вены, наиболее вероятно, обусловлена хирургическим вмешательством. Операция приводит к повреждению тканей, внедрению в них инородного тела (шовного материала), образованию тканевого детрита и вследствие всего этого — к асептическому воспалению. В результате воспалительной реакции для лизиса детрита и репарации в тканях вокруг сосудистого пучка повышается численность лейкоцитов, а так как септический компонент отсутствует, возрастает в первую очередь содержание лимфоцитов и макрофагов.

Присутствие обширных лейкоцитарных инфильтратов у животных с лигированием вены как без использования клеточных технологий, так и с применением ММСК скорее всего связано с повреждением большого массива тканей во время поиска и выделения вены и нарушением венозного оттока (венозной гипертензией) после моделирования непроходимости магистрального сосуда [13, 14].

Нельзя исключить и бактериальную контаминацию таких больших областей с детритом и геморрагиями. Это нам кажется наименее вероятным, учитывая соблюдение правил асептики и антисептики при выполнении хирургического вмешательства, а также отсутствие гнойных осложнений (животные с гнойно-воспалительными процессами в области операции из эксперимента выбраковывались, поэтому в некоторых группах исследования на каждую точку исследования приходилось по 11 особей). Но все-таки вероятность попадания микроорганизмов в ткани у животных после операции полностью исключить нельзя вследствие вылизывания раны, агрессивного поведения особей мужского пола при совместном содержании и других причин.

В места с высокой концентрацией антигенов (многие компоненты тканевого и клеточного детрита обладают антигенными свойствами) мигрируют лейкоциты — в первую очередь нейтрофилы. Там образуются лейкоцитарные (нейтрофильные) инфильтраты, где фагоциты лизируют все антигенные вещества, включая микроорганизмы, тканевой и клеточный детрит, внесосудистые эритроциты.

Кроме того, присутствие в тканях медленно абсорбируемого шовного материала, примененного как для лигирования вены, так и для ушивания кожной раны, также поддерживает хроническую асептическую воспалительную реакцию с миграцией макрофагов. Для фагоцитоза и лизиса лигатур цитоплазма макрофагов сливается и формируются гигантские многоядерные формы — гигантские клетки инородных тел. В связи с присутствием в тканях рядом с шовным материалом молодой соединительной ткани, гигантоклеточной трансформации макрофагов с формированием гранулем инородного тела можно заключить, что воспаление является продуктивным (гранулематозным). Следует отметить, что, согласно данным литературы [17, 18], элиминация даже абсорбируемого шовного материала часто проходит через гранулематозный воспалительный процесс с формированием гигантских клеток инородных тел.

Считается, что лизируемые шовные материалы рассасываются по мере заживления раны вследствие процессов гидролиза или протеолиза. Скорость деградации зависит от локализации лигатур, состояния раневого процесса, которое определяется численностью и составом клеточных элементов вокруг нитей. При определенных обстоятельствах возможно значительное увеличение сроков деградации материала. Длительная деградация в свою очередь может способствовать инкапсуляции, а не разрушению нити, с развитием перифокального фиброза [17, 18]. Даже при использовании кетгута только к завершению 1-го месяца у большинства животных закончилась альтеративная фаза воспалительной реакции тканей на инородное тело [17]. Другими исследователями также показана возможность длительного сохранения остатков шовного материала в организме с инкапсуляцией их вместе с гранулемами плотной волокнистой соединительной тканью [17—19].

Когда в группе ложнооперированных крыс шовный материал самопроизвольно удаляется (прорезание швов через кожу и их элиминация отмечены чаще всего на 2-й неделе), основная причина воспаления в области магистральной вены исчезает и очень быстро затухает воспалительный процесс. Практически сразу нормализуется содержание лейкоцитов в тканях, исчезают (мигрируют или элиминируются вслед за лигатурой) макрофаги, гигантские клетки инородных тел и нейтрофилы.

У животных с моделированием острой локальной блокады магистральной вены лигатура, наложенная на эту вену, сохраняется в тканях в течение всего эксперимента и соответственно служит источником поддержания воспалительной реакции с формированием и присутствием гранулем инородного тела на протяжении всех 5 нед наблюдения. Начиная с 3-й недели в группах животных с лигированием вены все найденные изменения лейкоцитарной инфильтрации, по-видимому, связаны с воспалительной реакцией, поддерживаемой остатками не до конца лизированного шовного материала. Активность воспаления медленно уменьшается по мере макрофагального лизиса и инкапсуляции филаментов шовного материала.

В обеих группах животных с использованием клеточных технологий (ложнооперированные с введением ММСК без изменений кровотока и крысы после инъекции ММСК в проекции лигированной вены) по сравнению с группой с простым моделированием острого локального препятствия венозному кровотоку менее выражена степень возрастания лейкоцитарной, в частности нейтрофильной, инфильтрации и раньше происходит ее нормализация (3 нед против 4 нед соответственно). Это, скорее всего, обусловлено не только иммуномодуляторным (иммуносупрессивным) действием ММСК, но и их способностью снижать активность воспалительных процессов [1, 11, 12]. Следует учитывать возможность привлечения макрофагов к месту концентрации введенных ММСК их детритом [15, 16]. Вместе с дебрисом введенных ММСК макрофаги фагоцитируют и послеоперационный тканевой детрит и оказавшиеся в ране микроорганизмы. Далее макрофаги вместе с фагоцитированным материалом, по-видимому, мигрируют в другие органы для утилизации поглощенных антигенов, в том числе в регионарные и отдаленные лимфатические узлы [15, 16]. Практически отсутствие различий между животными после введения ММСК в условиях неизмененного кровотока (ложнооперированные крысы) и на фоне лигированной магистральной вены указывает на то, что все зарегистрированные изменения обусловлены эффектом клеточных технологий, а не острой локальной блокадой венозного оттока крови.

Вместе с этим существует вероятность, что более быстрому уменьшению выраженности лейкоцитарной инфильтрации и соответственно снижению активности воспалительного процесса рядом с лигированной веной также может способствовать описанное нами ранее ускоренное формирование грануляций и рубца в результате применения клеточных технологий [14].

Необходимо обратить особое внимание на то, что, согласно утверждениям других исследователей, иммуносупрессия в результате применения ММСК может приводить к увеличению периода времени, необходимого для избавления организма от инфекционного агента [20]. Также был найден более значительный ингибирующий эффект ММСК на иммунокомпетентные клетки онкологических пациентов, что теоретически создает благоприятные условия для прогрессии опухоли и уклонения ее клеточных элементов от реакций системы иммунитета [21]. Нельзя исключить вероятность снижения активности лейкоцитарных реакций, особенно нейтрофильной, после применения ММСК и в результате к неограниченному распространению антигенов, в том числе и инфекционного происхождения, в тканях и диссеминации этих антигенов по организму.

Присутствие в тканях после операций на сосудах медленно абсорбируемого шовного материала служит основной причиной развития асептического гранулематозного воспаления. Инъекция ММСК на таком фоне в эксперименте приводит к уменьшению выраженности лейкоцитарной инфильтрации в тканях и более быстрой нормализации численности нейтрофилов. Обнаруженное снижение активности воспалительного процесса в первую очередь обусловлено иммуномодуляторным действием введенных ММСК.

Работа выполнена при финансовой поддержке ПФНИ ГАН на 2017‒2020 гг. (VI.62.2.1, 0309−2016−0006) «Разработка технологий получения материалов для регенеративной медицины и развитие методов восстановления репродуктивного здоровья».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.И., Ш. А., А.В.

Сбор и обработка материала — М.И., Е.А., М.Т., Ф.Н., М.Р., М.В., Ш. А., А.В.

Статистическая обработка — М.И.

Написание текста — М.И., Ш. А., А.В.

Редактирование — М.И., Ш. А., А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: imai@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-8182-5084