Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Сметанина М.А.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия

Шадрина А.С.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия;
Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Золотухин И.А.

ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия

Селиверстов Е.И.

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия

Филипенко М.Л.

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, Новосибирск, Россия;
ФГБОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Дифференциальная экспрессия генов при варикозной болезни нижних конечностей: современное состояние проблемы, анализ опубликованных данных

Авторы:

Сметанина М.А., Шадрина А.С., Золотухин И.А., Селиверстов Е.И., Филипенко М.Л.

Подробнее об авторах

Журнал: Флебология. 2017;11(4): 190‑204

Просмотров: 2439

Загрузок: 39

Как цитировать:

Сметанина М.А., Шадрина А.С., Золотухин И.А., Селиверстов Е.И., Филипенко М.Л. Дифференциальная экспрессия генов при варикозной болезни нижних конечностей: современное состояние проблемы, анализ опубликованных данных. Флебология. 2017;11(4):190‑204.
Smetanina MA, Shadrina AS, Zolotukhin IA, Seliverstov EI, Filipenko ML. Differentially Expressed Genes in Varicose Veins Disease: Current State of the Problem, Analysis of the Published Data. Flebologiya. 2017;11(4):190‑204. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/flebo2017114190-202

?>

1. Патогенез ВБНК и проблемы его изучения

Варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) — широко распространенная патология сосудов, встречающаяся в среднем у 25—50% женщин и 10—30% мужчин [1—3]. Оценки распространенности заболевания варьируют от исследования к исследованию, что, по всей видимости, связано с особенностями изучаемых выборок, в первую очередь с разным влиянием факторов риска, главными из которых являются женский пол, возраст, семейный анамнез заболевания, беременность, а также ожирение и длительные статические нагрузки в вертикальном положении.

Изучению патогенеза ВБНК посвящено множество исследований, и к настоящему времени накоплен внушительный массив знаний о событиях, сопровождающих варикозную трансформацию на разных уровнях, начиная с генного и молекулярного [2, 4]. К факторам, оказывающим влияние на этот процесс, относятся изменения гемодинамики: снижение ламинарной скорости потока крови и появление турбулентного кровотока, повышение венозного давления и связанное с ним растяжение стенок вен, гипоксия, оксидативный стресс, активация эндотелия и воспаление [2, 4—8]. Эти факторы взаимосвязаны с множеством молекулярных и клеточных событий, таких как: изменение экспрессии генов, в том числе генов ферментов, осуществляющих ремоделинг внеклеточного матрикса, и генов самих компонентов матрикса; аккумуляция цитокинов и ростовых факторов; изменение фенотипа гладкомышечных клеток и их пролиферация; инфильтрация иммунных клеток. В конечном счете все эти процессы опосредуют структурные и морфологические изменения стенки вены, нарушающие ее функцию. Тем не менее накопленная на сегодняшний день информация не позволяет построить полную и непротиворечивую картину развития ВБНК. Прежде всего все еще непонятно, как именно происходит инициация заболевания и в каком порядке возникают патологические изменения в венозной стенке. Например, такой фактор, как амбулаторная венозная гипертензия, которую часто называют причиной заболевания, очевидно, отсутствует на самых ранних стадиях заболевания, когда кровоток еще не нарушен. Ранее предполагалось, что именно этот фактор является ключевым, поскольку первичной патологией считали недостаточность венозных клапанов и рефлюкс, но ультразвуковые и гистологические исследования опровергли эту гипотезу [8, 9]. Возможно, архитектура стенок вен, подверженных варикозной трансформации, изначально иная, и такие вены патологически отвечают на естественные нагрузки и провоцирующие факторы, например перепад давления или длительное положение стоя. Гипертензия в таком случае может быть следствием ослабления стенок вен, и ее роль, возможно, сводится к участию в прогрессии заболевания как просто одного из промежуточных этапов патогенеза. Не до конца ясна роль и ряда других патогенетических факторов, поскольку сделать однозначные выводы мешают противоречия в результатах исследований. Например, остается открытым вопрос о роли воспаления на начальных этапах развития ВБНК. В двух работах, выполненных на материале пациентов, имеющих ранние стадии заболевания (С2 и С3, преимущественно С2), получены противоположные результаты. В первом исследовании показано увеличение уровня маркеров воспаления в крови из варикозных вен по сравнению со здоровыми [10], во втором не продемонстрировано никаких признаков развивающегося воспаления в стенках пораженных вен — ни повышения концентрации медиаторов воспаления, ни присутствия иммунных клеток [11]. Точно так же не до конца понятна роль гипоксии и ее причинно-следственная связь с остальными факторами. Существует много свидетельств в пользу того, что гипоксия связана с варикозной трансформацией, но при этом лишь в одной работе напрямую измерено содержание кислорода в стенках больных и здоровых вен и показано его снижение при варикозном расширении [7]. Таким образом, несмотря на внушительное количество научно-исследовательских работ, точных представлений о патогенезе ВБНК до сих пор нет, как нет и единого мнения о ее причинах, поэтому требуются дальнейшие исследования в этом направлении.

2. Анализ дифференциальной экспрессии генов как один из аспектов исследования патогенеза ВБНК

Ген-кандидатные исследования

Одним из способов изучения молекулярных основ развития заболевания является исследование дифференциальной экспрессии генов. Идентификация генов, меняющих свою активность при патологии, помогает понять, какие функциональные системы задействованы в развитии патологического процесса. В перспективе этот подход создает научный базис для разработки новых лекарственных препаратов. Работы по анализу дифференциальной экспрессии генов при ВБНК проводятся с начала 2000-х годов и продолжаются в настоящее время. Большинство работ выполнено в формате ген-кандидатных исследований (табл. 1).

Таблица 1.Исследования дифференциальной экспрессии генов при варикозной болезни нижних конечностей, в которых реализован ген-кандидатный подход (приведены в хронологическом порядке). В скобках указаны альтернативные названия генов Примечание. Здесь и в табл. 2: ↑ — экспрессия увеличена, ↓ — экспрессия снижена; * — анализировали культуры гладкомышечных клеток, полученных из образцов вен; ** — группа контроля — образцы здоровых вен от тех же пациентов с ВБНК.
При таком подходе гены выбирают, исходя из предположений о потенциальных участниках процесса. Классические методы, используемые для такого типа исследований, — это обратная транскрипция суммарной мРНК, выделенной из биологических образцов, наработка целевого фрагмента ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), визуализация продукта тем или иным способом и сравнительный анализ полученных данных. Для нормировки на количество материала в образце содержание искомого транскрипта измеряется относительно количества мРНК референсного гена, колебания экспрессии которого в клетках ткани считаются незначительными. В начале века для визуализации продуктов ПЦР использовали в основном электрофоретическое разделение с последующим окрашиванием (например, бромистым этидием). Этот метод позволял сделать только приблизительные оценки относительно уровня экспрессии и не претендовал на абсолютную количественную точность. По мере развития методов молекулярной биологии все более доступной становилась ПЦР в режиме реального времени, позволяющая проводить точную количественную оценку, и сейчас для анализа экспрессии одного или нескольких генов используют преимущественно именно этот метод. Существуют и другие не основанные на ПЦР методы. Они менее распространены, и из 23 ген-кандидатных исследований экспрессии генов при ВБНК лишь в одной работе применена методика, основанная на гибридизации РНК со специфической меченой пробой, защищающей целевую мРНК от действия рибонуклеаз [12] (см. табл. 1).
Таблица 1.Исследования дифференциальной экспрессии генов при варикозной болезни нижних конечностей, в которых реализован ген-кандидатный подход (приведены в хронологическом порядке). В скобках указаны альтернативные названия генов Примечание. Здесь и в табл. 2: ↑ — экспрессия увеличена, ↓ — экспрессия снижена; * — анализировали культуры гладкомышечных клеток, полученных из образцов вен; ** — группа контроля — образцы здоровых вен от тех же пациентов с ВБНК.
Таблица 1.Исследования дифференциальной экспрессии генов при варикозной болезни нижних конечностей, в которых реализован ген-кандидатный подход (приведены в хронологическом порядке). В скобках указаны альтернативные названия генов (окончание) Примечание. Здесь и в табл. 2: ↑ — экспрессия увеличена, ↓ — экспрессия снижена; * — анализировали культуры гладкомышечных клеток, полученных из образцов вен; ** — группа контроля — образцы здоровых вен от тех же пациентов с ВБНК.

В качестве материала для анализа в основном использовали образцы вен, удаленных в ходе хирургического лечения ВБНК. Контрольная группа образцов чаще всего состояла из сегментов вен, использованных для аутовенозного шунтирования (аортокоронарного и др.), у пациентов без венозной патологии. В редких случаях контрольными образцами служили вены, полученные при ампутациях [12] и от мультиорганных доноров [13]. В одном исследовании в качестве контроля были взяты здоровые участки вен тех же пациентов, у которых брали опытные образцы [14]. Наконец, в 2 исследованиях, задачей которых было измерить экспрессию именно в гладкомышечных клетках, были предварительно получены клеточные культуры, из которых в дальнейшем выделяли мРНК [15, 16]. Стоит отметить, что в большей части ген-кандидатных исследованиях измерение экспрессии генов на уровне мРНК было лишь одним из этапов работы. Роль генов и закодированных в них белков оценивали комплексно: помимо анализа количества транскрипта, определяли содержание в образцах собственно белкового продукта методами иммуногистихимического окрашивания, вестерн-блоттинга и др. (см. табл. 1).

В ряде работ [15—19] внимание было сфокусировано на генах, кодирующих компоненты внеклеточного матрикса (эластин (ELN), фибулин 5 (FBLN5) и ферменты, ответственные за его биогенез и ремоделинг — триптазу II (TPSB2), лизил-оксидазу (LOXL1), различные матриксные металлопротеиназы (MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, MMP13) и их тканевые ингибиторы (TIMP1 и TIMP2). Не во всех работах [18, 19] гипотезы подтвердились экспериментально. В целом система внеклеточного матрикса при ВБНК гораздо лучше изучена в ген-кандидатных исследованиях на уровне белков, чем на уровне мРНК, и, несмотря на некоторые противоречия в результатах, данные о нарушении баланса в этой системе весьма убедительны [8].

Много исследований посвящено анализу экспрессии генов различных ростовых факторов и их рецепторов. Показано увеличение активности гена кислого фактора роста фибробластов (FGF1) — проангиогенной молекулы, важного регулятора клеточной пролиферации, миграции и дифференцировки, задействованного также в регуляции экспрессии и активности матриксных металлопротеиназ [14]. В 4 работах продемонстрирована повышенная экспрессия гена другого ангиогенного фактора — роста эндотелия сосудов (VEGF) [20—23] и его рецепторов KDR (VEGFR2) и FLT1 (VEGFR1) [20]. Как и FGF-1, VEGF, помимо своего митогенного эффекта в отношении эндотелиальных клеток, регулирует активность матриксных металлопротеиназ, а также увеличивает проницаемость сосудов и стимулирует экспрессию адгезионных молекул на поверхности эндотелия. Еще один плейотропный фактор роста, активируемый при ВБНК, — это трансформирующий фактор роста TGF-β1 [24]. Повышенная экспрессия обнаружена также для гена его рецептора TGF-β RII (TGFBR2) [25]. Этот цитокин также вовлечен в ремоделинг сосудов и регулирует пролиферацию, дифференцировку и миграцию гладкомышечных клеток и фибробластов. Возможно, нарушением баланса факторов роста объясняется аномальная пролиферация гладкомышечных клеток в гипертрофированных сегментах варикозных вен и изменение их фенотипа с сократительного на секреторный.

Функционирование ростовых факторов TGF-β1 и VEGF взаимосвязано с индуцируемым гипоксией транскрипционным фактором 1 (HIF-1), состоящим из субъединицы HIF-1α и ядерного транслокатора ARNT (HIF-1β). Экспрессия VEGF находитcя под контролем HIF-1. TGF-β1 и HIF-1α взаимно активируют друг друга и регулируют частично перекрывающийся спектр генов, в том числе VEGF. В двух работах была изучена активность гена белковой субъединицы HIF-1α (HIF1A) [22, 23] и других генов этой системы: HIF2A, генов-мишеней HIF-1α — GLUT1 (регулирует обмен глюкозы), CA9 (регулирует pH) и BNIP3 (проапоптотический белок), а также генов ингибиторов HIF-1α — гидроксилаз PHD1,2,3 и FIH1 [23]. Результаты работ подтвердили гипотезу об активации ответа на гипоксию при ВБНК.

Интересные результаты получены в работах группы авторов S. Surendran и соавт. [26, 27]. И на уровне мРНК, и на уровне белков была показана активация компонентов сигнального пути FOXC2-Dll4-Notch-Hey2, генерирующего пролиферативный сигнал, для гладкомышечных клеток. Этот сигнальный путь характерен для артерий, и авторами также было продемонстрировано увеличение экспрессии артериального маркера эфрина B2 (EFNB2) в варикозно-измененных венах. Вероятно, патологическая «артериализация» вен является ответом на гемодинамические изменения и растяжение венозных стенок. Помимо этого, обнаружена гиперэкспрессия маркера гладкомышечных клеток и миофибробластов — виментина (VIM), в то время как маркер эндотелиальных клеток CD31 экспрессировался меньше, чем в контрольных образцах. Авторы предположили, что это может быть связано с эндотелиально-мезенхимальной транзицией.

В двух работах были проанализированы гены, ответственные за регуляцию апоптоза, — p21, BAX, TP53, BCL2 [13, 16] и каспазы-3 (CASP3) [16] в ткани здоровых и больных вен и на культурах гладкомышечных клеток. В обеих работах была показана гиперэкспрессия антиапоптотического гена BCL2 в клетках варикозных вен. Экспрессия остальных генов зависела от участка вены и возраста испытуемых. В исследовании, выполненном на клеточных культурах, экспрессия антиапоптотических генов была повышена, а проапоптотических — снижена. Результаты этих и других работ в этой области свидетельствуют, что нарушение баланса индукторов и ингибиторов апоптоза может лежать в основе фенотипических и функциональных изменений, характерных для гладкомышечных клеток в стенках вен при ВБНК, снижать венозный тонус и приводить к возникновению участков гипертрофии и атрофии.

Экспрессия генов, кодирующих хемоаттрактанты для моноцитов/макрофагов и нейтрофилов (MCP1, IL8, CCL5, CXCL10, CCL3, CCL4), была изучена в исследовании L. del Rio Sola и соавт. [12]. Стоит отметить, что пациенты, предоставившие материал, имели в основном ранние стадии заболевания. Транскрипция всех изученных генов в образцах ВБНК была выше, чем в нормальных венах, что согласуется с рядом других исследований [10, 28], обнаруживших индукцию воспалительного ответа при варикозе. Тем не менее, как было упомянуто выше, есть работы и с обратным результатом [11].

В остальных исследованиях было показано увеличение экспрессии генов, участвующих в продукции вазоактивных соединений [29], регуляции клеточной миграции (IQGAP1) [30] и циркадных ритмов (CLOCK) [22], а также снижение экспрессии гена тирозинкиназы Tie-1, играющей важную роль в ангиогенезе [31]. Выявлено подавление экспрессии генов NELIN и SM22-α (TAGLN), что указывает на фенотипическую транзицию гладкомышечных клеток [32]. Наконец, продемонстрирована индукция экспрессии генов рецепторов эстрогена ER-α, ER-β и GPER1, коррелирующая со стадией заболевания [33].

Исследования транскрипционной активности генов-кандидатов, безусловно, добавили много новой информации к знаниям о патогенезе ВБНК. Тем не менее они не лишены недостатков, как и сам подход в целом. Во-первых, опытные и контрольные группы, как правило, имели небольшой размер, что в сочетании с большим количеством тестов в некоторых работах привело к проблеме введения поправки на множественное сравнение. Если разница в экспрессии невелика, а образцов немного, мощности исследования может априори не хватить для достижения высокого уровня статистической значимости. В таком случае критерием достоверности открытия может служить только независимое подтверждение. Однако в большинстве работ результаты анализа транскриптов подтверждены на уровне белков, иногда несколькими методами. Во-вторых, не во всех исследованиях материал был подробно описан, в частности не хватало информации о классе заболевания. Вполне возможно, что уровень экспрессии меняется в зависимости от стадии заболевания, а также от того, какой сегмент вены был подвергнут анализу. Логично предположить, что в зонах гипертрофии и атрофии гены могут вести себя по-разному. В-третьих, почти во всех работах экспрессия была измерена относительно одного референсного гена, и если предположить, что его активность могла колебаться, то существует вероятность ложноположительных или ложноотрицательных результатов. В-четвертых, главный недостаток ген-кандидатного подхода — это зависимость от гипотезы, что автоматически накладывает ограничение на возможности метода, так как не всех участников процесса возможно предсказать.

Исследования всего спектра мРНК

Альтернативный подход к изучению дифференциальной экспрессии — анализ одновременно всех имеющихся транскриптов и поиск отличий между контрольными и опытными образцами. Одним из первых таких методов стал дифференциальный дисплей мРНК. Он включает несколько этапов: выделение суммарной мРНК, обратную транскрипцию, ПЦР-амплификацию фрагментов всей полученной комплементарной ДНК, разделение ампликонов в полиакриламидном гене и сравнение их профилей. Если отличия между группами обнаружены, целевые фрагменты выделяют из геля, определяют их последовательность и аннотируют. Поскольку для метода характерно большое количество ложноположительных сигналов, результаты затем перепроверяют другими способами, например ОТ-ПЦР [34]. Первый дифференциальный дисплей для ВБНК позволил идентифицировать три кДНК, гомологичных повторам LINE1 и Alu, один из которых лежит в гене тропомиозина TPM4 [35]. В исследовании было проанализировано 4 образца вен от пациентов с ВБНК класса C2 и 3 контрольных образца вен от здоровых пациентов. Подтверждения результатов дополнительными способами в этом исследовании не проводили.

В следующей работе группы имели больший размер, 12 пациентов (класс С2—С4) в выборке «случай» и 9 человек в группе «контроль» [36]. Анализ выявил снижение экспрессии гена десмуслина, также известного как синемин (SYNM), причем результат был подтвержден методом ОТ-ПЦР, гибридизацией РНК по Нозерну и иммуногистохимическим анализом белкового продукта гена в гладкомышечных клетках. Синемин является белком цитоскелета семейства промежуточных филаментов, ответственных за устойчивость к механическим нагрузкам. Вероятно, низкая активность этого гена в гладкой мускулатуре вен является одной из причин ослабления венозной стенки и снижения ее тонуса при варикозе.

В третьей аналогичной работе дисплей мРНК проанализировали для трех образцов – двух опытных и одного контрольного [37]. Из нескольких дифференциально экспрессируемых генов выбрали один, показавший наибольшую разницу в уровне мРНК, а именно POU2F1, кодирующий транскрипционный фактор Oct-1. Гиперэкспрессию гена при ВБНК подтвердили методами ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, включив в выборки дополнительное количество образцов (15 и 4 в группах «случай» и «контроль» соответственно). Oct-1 активен во всех эукариотических клетках и регулирует транскрипцию многих генов, в том числе осуществляющих контроль клеточного цикла. Авторы исследования предположили, что связь Oct-1 с варикозом может быть обусловлена аккумуляцией клеток с нарушенной функцией, избежавших апоптоза, но в связи с плейотропным действием этого фактора механизмов может быть много.

Помимо высокой вероятности ложноположительных результатов, недостатками метода дифференциального дисплея мРНК является малая эффективность анализа сложных наборов мРНК, преимущественное выявление широко представленных транскриптов и высокая зависимость интерпретации результатов от опыта исследователя [34]. Современные высокотехнологичные методы анализа позволяют избежать этих ограничений. К настоящему времени в отношении ВБНК опубликовано три исследования, в которых применили технологии ДНК-микрочипов (микроэрреев) для полномасштабного скрининга дифференциальной экспрессии генов [38—40]. Этот метод основан на гибридизации кДНК с тысячами иммобилизованных олигонуклеотидных проб с известной последовательностью. Результаты работ, в которых использовали этот метод, представлены в табл. 2.

Таблица 2. Исследования дифференциальной экспрессии генов при варикозной болезни нижних конечностей с помощью технологии ДНК-микрочипов. Названия генов могут отличаться от опубликованных в статьях в связи номенклатурными изменениями, а также пересмотром некоторых данных в базе GenBank
В первых двух исследованиях ДНК-микрочипы содержали, по современным меркам, небольшое число проб — 2000—3000. В работе C. Cario-Toumaniantz и соавт. [39] микрочиповый метод совместили с супрессивной вычитательной гибридизацией [34], с помощью которой были получены библиотеки кДНК, обогащенные дифференциально экспрессирующимися генами. Эти библиотеки затем использовали для приготовления микроэррея. Клоны, соответствующие последовательностям на чипе с наибольшей разницей в экспрессии по итогам экспериментов, секвенировали и соотносили с известными генами. В третьем, самом крупном исследовании экспрессия генов при ВБНК была проанализирована уже на уровне полного генома (около 38 500 генов) [40].

Мы сравнили результаты, полученные в микрочиповых исследованиях, с данными ген-кандидатных работ, дифференциальных дисплеев мРНК и между собой с учетом того, что многие гены имеют альтернативные названия. Главный вывод, который можно сделать из этого сравнения, — это удивительно низкая воспроизводимость результатов. В трех работах, применивших технологию микроэрреев, только один ген был выявлен более чем в одном исследовании — это ген селенопротеина SEPP1, кодирующий гепарин-связывающий внеклеточный белок. Пересечение с результатами ген-кандидатных работ было обнаружено только для гена тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ TIMP1 [16, 39]. Для гена актин-связывающего белка SMC22-α (трансгелина, TAGLN), который является ранним маркером дифференцировки гладкомышечных клеток, результаты оказались противоположными: в ген-кандидатном исследовании его экспрессия была снижена при ВБНК [32], в микрочиповом — увеличена [38]. Еще одно примечательное наблюдение — это выявление дифференциальной экспрессии генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы GAPDH [38] и β-актина ACTB [39], которые использовались в большинстве ген-кандидатных работ как референсные (для всех типов анализа). Если их уровень их экспрессии нестабилен, то это могло привести к искажению результатов. Дополнительно мы сравнили экспрессионные данные с результатами недавнего протеомного исследования, в котором внимание было сфокусировано на компонентах внеклеточного матрикса [41]. Совпадения были обнаружены для коллагена типа I, альфа 1 (COL1A1) [38], гельзолина (GSN) [39] и TGF-β-индуцируемого белка (TGFBI) [38] — их продукция была увеличена. Для четырех генов эффекты отличались: на уровне мРНК экспрессия кластерина (CLU) [39], коллагена типа III, альфа 1 (COL3A1) [39], дерматопонтина (DPT) [39] и люмикана (LUM) [38] была повышена, на уровне белков — снижена [41].

Все эти противоречия наглядно иллюстрируют проблемы, характерные для этой области исследований. Сложно ожидать, что все без исключения варикозно-измененные вены будут одинаковы по уровню генной активности, поэтому чем больше информации представлено о классе ВБНК, возрасте и поле пациентов, локализации изучаемых сегментов, тем проще сопоставить результаты разных работ и понять причины отличий. Вторая проблема — это экстраполяция данных по транскриптому на уровень белков. Различия в количестве транскриптов в клетке совсем не обязательно сохраняются на уровне конечных продуктов генов, и, наоборот, разная представленность белков не всегда означает разную транскрипционную активность, поскольку, кроме транскрипционного уровня регуляции генной экспрессии, существует еще и трансляционный и посттрансляционный [42]. В упомянутом выше протеомном исследовании наблюдали такой эффект [41]. Для ряда белков, по-разному представленных в варикозных и нормальных венах, измерили содержание мРНК в образцах, и разницу подтвердили только для двух генов — мимекана и аггрекана. В частности, не обнаружили отличий в экспрессии для COL1A1, COL3A1, DPT и LUM. Тем не менее информация о генной экспрессии, безусловно, является важной, поскольку дает общее представление о системах, активируемых или подавляемых в клетках и тканях при заболевании. Такие знания можно почерпнуть из комплексного анализа данных, полученных в ходе экспрессионных исследований, а также при совокупном анализе данных по протеому. Для этого сейчас уже предложены биоинформатические подходы [42].

В настоящей работе мы объединили результаты ДНК-микрочиповых исследований и выполнили их функциональную аннотацию, проанализировав представленность в перечне дифференциально экспрессируемых генов категорий «генной онтологии». Проект «Генная онтология» (Gene Ontology) создан в целях систематизации и унификации биологических знаний, для чего были разработаны специфические «словари», в которые входят «термины» — группы генов, объединенные по общим функциональным признакам [43]. Таких словарей три — «Биологический процесс», «Молекулярная функция» и «Клеточный компонент». Термины в словарях связаны между собой через отношения различного типа («А является частью В», «А является частным случаем В» и др.). Каждый ген можно отнести к одному или нескольким терминам внутри словарей, тем самым охарактеризовав его роль в жизнедеятельности организма. База данных «Генной онтологии» постоянно обновляется и редактируется по мере получения новых биологических данных и уточнения старых, поэтому термины динамичны и могут менять свой состав.

Представленность функциональных групп генов (термины) в списке анализируют с помощью биоинформатических алгоритмов под общим названием Gene Set Enrichment Analysis (дословно: анализ обогащения набора генов). Смысл метода заключается в статистическом сравнении числа генов из списка, попавших в ту или иную категорию, с их теоретически ожидаемым количеством в этой группе. Мы выполнили такой анализ с помощью инструмента PANTHER Overrepresentation Test системы PANTHER, которая является частью консорциума «Генной онтологии» [44]. Дополнительно мы проанализировали данные с помощью аналогичного инструмента на платформе geneXplain (http://genexplain.com/). Результаты, получаемые с помощью разного программного обеспечения, могут отличаться друг от друга, что объясняется разницей в применяемых алгоритмах и использованием разных версий «словарей» из базы данных. В связи с этим мы представили категории, которые были выявлены одновременно обоими инструментами (табл. 3).

Таблица 3. Функциональная аннотация генов, дифференциально экспрессируемых в варикозно-измененных венах нижних конечностей, выявленных с помощью технологии ДНК-микрочипов (дата анализа: 11.10.17) Примечание. * — идентификационный номер термина генной онтологии; ** — c учетом поправки на множественное сравнение.
Таблица 3. Функциональная аннотация генов, дифференциально экспрессируемых в варикозно-измененных венах нижних конечностей, выявленных с помощью технологии ДНК-микрочипов (дата анализа: 11.10.17) (окончание) Примечание. * — идентификационный номер термина генной онтологии; ** — c учетом поправки на множественное сравнение.
Мы ограничились словарями «Биологический процесс» и «Молекулярная функция». Система PANTHER также позволяет проаннотировать список генов относительно молекулярных путей базы данных Reactome (http://reactome.org/), и мы добавили эту аннотацию в свой анализ (табл. 4).
Таблица 4. Функциональная аннотация дифференциально экспрессируемых генов, выявленных с помощью технологии ДНК-микрочипов, относительно молекулярных путей базы данных Reactome (дата анализа: 11.10.17) Примечание. * — идентификационный номер пути; ** — c учетом поправки на множественное сравнение.

Категории генов, которыми был обогащен исследуемый список, в целом соответствовали предполагаемым либо уже продемонстрированным функциональным особенностям варикозной болезни. Многие термины были так или иначе связаны с организацией клеточных и внеклеточных структур — цитоскелета, внеклеточного матрикса, взаимодействием компонентов матрикса с клетками и между собой (в частности, такими были все термины словаря «молекулярная функция»). Среди биологических процессов много терминов относилось к ответу на воздействие различных органических молекул, в том числе цитокинов. Ожидаемо было обнаружить термины «развитие тканей», «сокращение гладкомышечных клеток», «клеточная адгезия» и «регуляция клеточной миграции». Все это неудивительно, поскольку главная характеристика ВБНК – это патологический ремоделинг. Примечательно, что значительное обогащение было показано для категорий, имеющих отношение к гемостазу, таких как собственно «гемостаз», «дегрануляция тромбоцитов», «аггрегация тромбоцитов» и др. Тромбофлебит поверхностных вен является одним из основных осложнений варикозной болезни. Возможно, это связано с повреждением эндотелиальных клеток и высвобождением факторов свертывания. Существует взаимосвязь и с тромбозом глубоких вен: варикозное расширение вен может развиваться вторично в результате посттромботических нарушений кровотока. И, наоборот, у пациентов, страдающих ВБНК, риск тромбоза глубоких вен немного увеличен [45]. К сожалению, нам сложно судить о причинно-следственных связях между экспрессией генов этой системы и варикозной трансформацией, поскольку, во-первых, не во всех ДНК-микрочиповых исследованиях были приведены классы заболевания (теоретически, у части пациентов могли уже быть трофические язвы), во-вторых, лишь в одной работе авторы указали, что изучали именно первичное варикозное расширение вен [38]. Стоит также отметить, что гены из тестируемого перечня, благодаря которым произошло обогащение категориями системы гемостаза, отнюдь не специфичны для процессов свертывания. Это те же гены коллагенов, тубулинов, актинов, кластерина, калюменина и других белков.

Еще одна любопытная и неожиданная находка — это выявление молекулярных путей, связанных с вирусом гриппа (см. табл. 4). Такой результат получился из-за высокой представленности генов некоторых рибосомальных белков, таких как RPL13A и RPSA, в списке генов с дифференциальной экспрессией. Рибосомальные белки взаимодействуют с РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса, необходимой для его репликации [46]. Имеется ли какая-либо биологическая основа под этим обогащением либо это просто случайное пересечение молекулярных путей, сказать затруднительно. Тем более мы не знаем, может ли сам вирус влиять на экспрессию генов данных белков. Поскольку вирус гриппа способен поражать эндотелий сосудов, можно все же предположить, что между этими заболеваниями есть какое-то взаимодействие. Аналогично этому высокое обогащение категорией «развитие черного вещества» (substantia nigra), возможно, объясняется просто случайным совпадением, так как эта маленькая группа включает всего 43 гена, из которых в нашем списке — 5 (см. табл. 3).

Анализ дифференциальной экспрессии генов при ВБНК — один из инструментов изучения ее патогенеза, который применяется уже почти два десятка лет. В комплексе с другими видами исследований этот подход помог сформировать современные представления о молекулярных основах варикозной трансформации, подтверждая либо опровергая гипотезы и открывая новых участников этого процесса. Большинство работ в данной области проведено в формате ген-кандидатных исследований (на сегодняшний день — 23 публикации в электронных базах данных), но есть и работы по поиску генов «вслепую», без изначальной гипотезы. В одной из них дифференциальная экспрессия проанализирована на уровне полного генома [40]. В целом как для самого подхода, так и для отдельных работ характерны некоторые недостатки. Анализ экспрессии генов позволяет установить, какие изменения происходят при патологии, но не разграничивает причину и следствие, поэтому не может ответить на актуальный в данном случае вопрос: что запускает развитие болезни? Теоретически этот подход дает возможность выяснить, в каком порядке возникают нарушения при прогрессии заболевания. Но для этого необходимо анализировать четко охарактеризованные группы образцов, относящиеся к разным этапам развития ВБНК. Недостаточно подробно описанные выборки — это еще одна проблема, присущая работам в этой области. Отсутствие информации о классе варикозной болезни, локализации сегмента вен и их характеристиках (первичное или вторичное поражение), о возрасте пациентов — все это затрудняет сравнение результатов и мешает понять причины, почему данные не воспроизводятся или даже противоположны. Безусловно, на это следует обратить внимание в дальнейших исследованиях.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках научного проекта № 17−75−20223 «Исследование механизмов ремоделирования стенки вены при ее варикозном расширении».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Шадрина А.С. E-mail: weiner.alexserg@gmail.com ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1384-3413;

Сметанина М.А. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6080-4615;

Золотухин И.А. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-6563-0471;

Селиверстов Е.И. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9726-4250

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail