Введение

Рыбки Danio rerio (D. rerio, Zebrafish) являются одним из перспективных и популярных объектов для моделирования патологических состояний и изучения влияния на организм условий среды [1—3]. Получаемые в результате этих исследований данные, с одной стороны, позволяют уточнять роль генов, их вовлечение в те или иные молекулярно-генетические механизмы. С другой стороны, проведение исследований на Zebrafish позволяет тестировать различные препараты, что является перспективным с прикладной точки зрения [4].

Большое количество таких работ при этом проводят на транскриптомном уровне [5, 6]. Для транскриптомных исследований особо остро стоит вопрос использования стабильных генов «домашнего хозяйства» (ГДХ), на экспрессию которых происходит нормирование экспрессии генов-кандидатов при проведении количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Поиск адекватных ГДХ в настоящее время проводится на всех исследуемых объектах, включая человека, мышей и крыс, и для каждого объекта набор ГДХ должен подбираться отдельно [7]. Необходимо также учитывать возможность изменения транскриптомных профилей в процессе онтогенеза, что может потребовать изменения набора ГДХ при изучении на разных стадиях развития организма [8]. Это утверждение справедливо и для D. rerio, особенно исходя из того, что большая часть работ проводится на ранних этапах онтогенеза этих животных.

В связи с тем, что D. rerio относительно недавно стали широко применяться в исследованиях, при их анализе часто используются ГДХ, популярные на других объектах. Так, одними из самых часто встречающихся ГДХ являются gapdh и actb [9]. Однако, несмотря на частоту применения и публикуемость данных об этих и других часто используемых ГДХ, необходимо уточнить список возможных ГДХ и проанализировать их стабильность на разных этапах онтогенеза D.rerio.

Исходя из этих предпосылок, нами был проведен отбор кандидатных ГДХ и анализ их стабильности на стадии вылупления (2-й день после фертилизации, дпф) и ранних стадиях малька (5 дпф, 9 дпф) у рыб D. rerio в нормальных условиях.

Материал и методы

Содержание рыб Danio rerio линии AB

Рыбы D. rerio линии AB содержались в проточной аквариумной системе (Aqua Schwarz GmbH, Германия) при температуре 28 °C. Световой режим поддерживался автоматически и составлял цикл 14/10 часов день/ночь. Кормление производилось в соответствии с возрастом. Взрослых рыб кормили один раз в день науплиями Artemia salina (Barrom, Россия) и сухим кормом Sera Vipan (Sera GmbH, Германия). Мальков в возрасте 4 дпф и старше кормили инфузориями Paramecium caudatum (Barrom, Россия). Исследование было проведено в соответствии с руководством ARRIVE 2.0 [14]. Вся экспериментальная работа осуществлялась в соответствии с правилами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных (СДСЕ №123) и нормами биоэтики (https://cioms.ch/images/ stories/CIOMS/IGP2012.pdf). Работы с животными одобрены комиссией по биоэтике НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ (№2/19 от 20 февраля 2019 г.).

Экспрессионный анализ

Подбор праймеров и зондов TaqMan

Праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени были подобраны с использованием программы Beacon Designer 7.0.2 (Premier Biosoft International, США) и соответствующих нуклеотидных последовательностей генов рыб из баз данных NCBI и Ensembl [10, 11]. Для поиска первичных данных об экспрессии генов на разных временных промежутках нами использовался ресурс ZFIN [12]. Так, все гены экспрессируются на отобранных нами стадиях, что позволяет их взять в дальнейшую работу. Подбор праймеров осуществлялся на основе следующих критериев: температура отжига праймеров должна находиться в пределах |Tm|~58-61 °C, длина праймеров должна составлять от 20—30 нуклеотидов (н.о.), длина ампликона 80—180 н.о. В свою очередь, длина зонда должна варьироваться от 25—30 нуклеотидов, температура отжига выше температуры праймеров на 5—10 градусов. Энергия Гиббса для самодимеров, шпилек и кросс-димеров между праймером и зондом должна принимать значения меньше или равной 3. Для отбора ГДХ для оценки их экспрессии на выбранных стадиях развития организма D. rerio также использовался ресурс ZFIN [12]. Специфичность праймеров и зондов проверяли при помощи Primer-BLAST [13]. Последовательности специфичных для генов праймеров и зондов перечислены в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности специфичных для генов праймеров и зондов

Примечание. *NM — ссылка на последовательность мРНК в базе данных нуклеотидов, **VIC — флуоресцентный краситель, ***BHQ — Black Hole Quencher — гаситель флуоресценции.

Выделение тотальной РНК

В работе изучались 3 временные точки: 2 дпф, 5 дпф и 9 дпф. Выделение тотальной РНК из всего организма эмбрионов и мальков рыб проводили с использованием набора Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research Corp., Irvine, CA, США). Концентрацию выделенной РНК измеряли с использованием набора флуориметра Qubit 3.0 (Invitrogen, США). После выделения к образцам РНК добавлялась дрожжевая тРНК в концентрации 1 мг/мл [14]. Все процедуры проводили согласно рекомендациям производителей. Выделение образцов с последующим проведением реакции обратной транскрипции проводили в один день при одинаковых условиях. Нормирование концентрации РНК проводили по образцу с самой низкой концентрацией.

Проведение обратной транскрипции и количественной ПЦР

Анализ относительных уровней мРНК генов-кандидатов проводили с использованием ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan. Одноцепочечную ДНК синтезировали с использованием 120 нг тотальной РНК, 100 нг тРНК дрожжей в качестве носителя [14], специфических праймеров и набора RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fischer Scientific, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученная в реакции обратной транскрипции кДНК была использована в качестве матрицы для количественной ПЦР. Ее разводили в 50 раз водным раствором тРНК дрожжей (0,02 нг/мкл) [14]. ПЦР проводили с использованием системы QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific, США) и реагентов для ПЦР (Syntol, Россия). Температурный цикл для образцов выполняли следующим образом: 60 с при 50 °C, 40 циклов по 15 с при 95 °C и 30 с при 61 °C; 30 с при 25 °C. Реакцию повторяли 3 раза для каждой кДНК для корректировки различий в качестве образцов и эффективности обратной транскрипции.

Оценку относительных уровней референсных генов проводили с использованием значений пороговых циклов реакции Ct, программ Excel и RefFinder.

Результаты

Для отбора кандидатных ГДХ был проведен скрининг статей в базе данных PubMed. На первом этапе проверки по ключевым словам (housekeeping genes) AND (danio rerio) было выявлено1805 публикаций. В связи с тем, что большое количество исследований на D. rerio проводятся на эмбриональной стадии развития, при поиске публикаций поисковой запрос был уточнен посредством добавления ключевого слова larvae. При этом в базе данных PubMed было обнаружено 156 публикаций. Поскольку в литературе часто используемым синонимом термина housekeeping genes выступает reference genes, нами также был проведен дополнительный поиск статей по аналогичному запросу, тем самым был получен 51 результат. При дальнейшем уточнении поискового запроса добавлением ключевого слова rt-qpcr ресурсом PubMed было выявлено 12 и 8 публикаций для housekeeping genes и reference genes соответственно (табл. 2).

Таблица 2. Наименования поисковых запросов в базе данных PubMed

Из всех этих работ только в 4 наиболее подробно представлен анализ ГДХ у D. rerio на разных стадиях развития, включая следующие факторы: пол, влияние различных химических веществ и гормонов [9, 15—17]. На основе этих работ был сформирован следующий список потенциальных ГДХ: actb, lsm12b, mob4, eef1a1l1, b2m, g6pd, rpl13a, 18s, rps18, rplp0, rpl8, gapdh, tmem50a, ube2a.

На втором этапе нами был проведен анализ литературы для оценки частоты использования ГДХ из этого списка. Нами исключались наиболее редко встречающиеся гены (1—2 статьи в PubMed), а также ГДХ, которые были описаны как нестабильные при различных условиях, например при обработке рыб ДМСО, ТХДД, этиловым спиртом, а также при воздействии гормональных веществ [15, 17].

В итоге для дальнейшего анализа были отобраны 4 ГДХ: actb, eef1a1l1, lsm12b, mob4. Также были исключены считающиеся классическими гены g6pd и gapdh, так как в ряде случаев эти гены являются нестабильными [2].

Необходимо отметить, что ген actb, часто используемый как ГДХ [9] [9, 15—17], у рыб имеет 2 формы: actb1 и actb2, которые были включены в дальнейший анализ. Кроме того, дополнительно в анализ были взяты четыре наиболее стабильных ГДХ, отобранных у мышей: aars1, psmb6, bcat2 и polr2f [18]. Таким образом был сформирован следующий список потенциальных ГДХ: actb1, actb2, lsm12b, mob4, eef1a1l1, aars1, psmb6, bcat2 и polr2f.

Далее для отобранных ГДХ были подобраны системы праймеров и зондов TaqMan. На этом этапе был исключен ген eef1a1l1, так как он имеет высокую гомологию с геном eef1a1l2 (90% по данным выравнивания с использования ресурса BLAST-NCBI), который не является подтвержденным ГДХ.

После проведения количественной ПЦР и получения данных Ct для каждого кандидатного ГДХ проводили оценку стабильности на основе анализа данных в программе RefFinder. В этой программе совмещены 4 алгоритма подсчета стабильности кандидатных ГДХ: geNorm, Normfinder, BestKeeper и сравнительный метод ΔΔCt. Представленные методики основаны на разных статистических алгоритмах и могут давать разные оценки стабильности в рамках одного и того же исследования референсных генов. Оценка стабильности экспрессии генов была проведена в два этапа. На первом этапе анализ полученных данных после количественной ПЦР проводили по каждому алгоритму отдельно. В результате была получена оценка, на основе которой составляется рейтинг ГДХ для каждого алгоритма в отдельности. На втором этапе на основе рейтинговых оценок по отдельным алгоритмам каждому ГДХ присваивается суммарная оценка, которая определяется как среднее геометрическое по всем четырем алгоритмам [6].

В результате нами были определены итоговые оценки стабильности ГДХ для D. rerio через 2 дпф, 5 дпф и 9 дпф (табл. 3). Также нами был определен суммарный рейтинг ГДХ для всех изучаемых ранних стадий D. rerio. При этом подсчет проводился по всем полученным пороговым циклам реакции (Ct) без разделения по возрастам рыб.

Таблица 3. Рейтинг генов «домашнего хозяйства» на всех изучаемых стадиях развития D. rerio

Примечание. ¹ГДХ — гены «домашнего хозяйства», ²Итоговая совокупная оценка — рейтинг, составленный на основе оценок по четырем алгоритмам (geNorm, Normfinder, BestKeeper и сравнительный метод ΔΔCt, ³Наиболее стабильным является ГДХ, имеющий минимальную оценку по этому показателю.

Как видно из представленных данных, на разных стадиях развития стабильно экспрессируются разные ГДХ. На 2 дпф наиболее стабильной является пара ГДХ aars1 и polr2f, на 5 дпф — aars1 и psmd6, а на 9 дпф — bcat2 и actb1. В то же время для всех одновременно изучаемых стадий развития D. rerio наиболее стабильными ГДХ являются aars1 и lsm12b.

Обсуждение

В настоящее время растет количество работ по изучению экспрессии генов, связанных с нейродегенеративными заболеваниями, физиологическими и иммунными процессами, опухолевыми трансформациями на модельном организме D. rerio. Для нормализации полученных экспрессионных данных крайне важна правильно подобранная система ГДХ. Необходимо отметить, что не существует идеального набора ГДХ для всех экспериментальных ситуаций. В различных экспериментальных условиях для оценки относительных уровней мРНК генов широко применяется метод ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan. Также важно понимать,что как для ГДХ, так и для целевых генов использование зондов TaqMan позволяет более специфично идентифицировать транскрипты, избегая ложноположительных результатов, например, при кросс-димеризации праймеров.

В данной работе был проведен анализ относительных уровней мРНК ГДХ у рыб на самых ранних стадиях развития: 2 дпф (стадия вылупления), 5 дпф и 9 дпф (ранние стадии малька). Эти стадии были выбраны нами, исходя из частоты их использования в исследованиях, связанных с патологическими процессами. Выбранные ГДХ должны стабильно экспрессироваться на всех изучаемых нами ранних стадиях развития, начиная от стадии вылупления и заканчивая стадией малька.

В соответствии с результатами проанализированных работ нами был сформирован следующий список возможных ГДХ: actb, lsm12b, mob4, eef1a1l1, b2m, g6pd, rpl13a, 18s, rps18, rplp0, rpl8, gapdh, tmem50a, ube2a. Данные гены были отобраны либо ввиду того, что являются классическими ГДХ (actb1, eef1a1l1, g6pd, b2m, gapdh), либо были отобраны как референсные в статьях (lsm12b, mob4, rpl13a, 18s, rps18, rplp0, rpl8, tmem50a, ube2a) [16, 17].

Важным критерием при отборе ГДХ является отсутствие псевдогенов. Псевдогены — копии генов, которые имеют какие-либо дефекты в своей кодирующей последовательности. С одной стороны, часть псевдогенов может амплифицироваться с целевой мРНК. С другой стороны, существуют процессированные псевдогены, которые лишены интронов и являются полной копией зрелой мРНК кодирующего гена [19]. В связи с этим нельзя полностью удостовериться в специфичности подобранных систем праймеров, если у гена подтверждено наличие псевдогенов. Необходимо отметить, что информация о наличии псевдогенов у ГДХ для D. rerio является противоречивой. Так, в своей работе Y. Hu и соавт. указывают на то, что, возможно, lsm12b, mob4, actb1, actb2 имеют псевдогены [16]. Однако, согласно данным из базы Gene-NCBI [20], эти ГДХ не имеют псевдогенов (на момент 27 января 2024 г.), в связи с этим данные ГДХ были взяты в работу.

Особое место в списке занимает ген actb. Он часто используется в качестве ГДХ не только при проведении исследований на D. rerio, но и на других модельных организмах. У рыб этот ген имеет 2 формы — actb1 и actb2. Обе формы были нами проанализированы в этой работе. Полученные нами данные указывают на то, что только actb1 может применяться в качестве ГДХ и только на стадии 9 дпф (табл. 3). Эти результаты в целом указывают на противоречивость использования этого гена как ГДХ, а также на существенное различие в стабильности разных форм гена actb. Это заключение подтверждается независимыми исследованиями. Так, в статье R. Tang и соавт. [9] actb описывается как наиболее стабильный, однако в других исследованиях этот ген являлся наименее стабильным по сравнению с другими ГДХ [15—17]. Такие противоположные результаты могут быть связаны с анализом разных форм гена actb, однако в большинстве работ авторы публикаций не раскрывают, какие именно формы были выбраны для исследований.

В результате проведенных нами исследований для стадии вылупления (2 дпф) наиболее стабильной парой ГДХ является aars1 и polr2f, для ранних стадий малька (5 дпф и 9 дпф) — aars1 и psmd6, bcat2 и actb1 соответственно. Из этих генов у D. rerio как ГДХ активно используется только ген actb1. Остальные ГДХ были включены в исследование, так как показали свою стабильность на мышах и человеке [18]. Для более поздних стадий развития (30 дпф и 90 дпф) следует проводить отдельный подбор ГДХ в связи с тем, что уже сформированы системы органов, и для каждого органа/системы органов ГДХ должны подбираться отдельно [7].

Следует подчеркнуть, что при одновременном исследовании нескольких стадий онтогенеза D. rerio необходимо использовать единую подобранную для этих стадий пару ГДХ. В связи с этим нами был посчитан общий рейтинг ГДХ по всем изучаемым нами стадиям онтогенеза D.rerio (2 дпф — 9 дпф). Согласно полученным данным, для этих стадий наиболее стабильными ГДХ являются aars1 и lsm12b. При этом нами впервые было показано, что самым стабильным ГДХ для ранних стадий развития D. rerio является aars1. Примечательно, что ген aars1 впервые был отобран как ГДХ для рыб на ранних стадиях развития. Адекватность использования этого гена в качестве ГДХ косвенно подтверждается его стабильностью в качестве ГДХ на других организмах [18]. Вторым по стабильности ГДХ является lsm12b. Полученные нами данные о стабильности гена lsm12b согласуются с ранее опубликованными данными. Так, в статье Y. Hu и соавт. приведены данные, что на ранних стадиях развития самыми оптимальными ГДХ для нормализации экспрессионных данных являются другие ГДХ: lsm12b и mob4 [16]. При этом обращает на себя внимание то, что в разных работах признаны стабильными разные ГДХ для исследования экспрессии генов на ранних стадиях развития D. rerio. В работе H. Xu и соавт. рассматривают ГДХ ube2a и tmem50a в качестве наиболее адекватных референсных генов для ранних стадий развития [17]. Таким образом, использование генов aars1 и lsm12b в качестве референсных на ранних стадиях развития D. rerio не вызывает сомнений.

Заключение

В данной работе нами было показано, что для оценки изменения экспрессии генов на различных стадиях развития D.rerio подходят разные ГДХ. При проведении оценки изменения экспрессии генов на стадии вылупления (2 дпф) оптимальной парой ГДХ является: aars1 и polr2f, для ранней стадии малька (5 дпф) — aars1 и psmd, а для 9 дпф — bcat2 и actb1. При проведении транскриптомных исследований сразу на нескольких стадиях развития — от стадии вылупления до стадии малька — необходимо использовать единую подобранную пару ГДХ для всех исследуемых стадий развития рыб: aars1 и lsm12b. Следует отметить, что ген aars1 впервые был отобран как ГДХ для рыб на ранних стадиях развития. Полученные нами данные о стабильности гена lsm12b согласуются с данными ранее проведенных работ.

Финансирование работы. Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда (номер гранта 22-75-00013).

Соблюдение этических стандартов. В ходе исследования были соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных. Исследование было проведено в соответствии с руководством ARRIVE 2.0 [21]. Вся экспериментальная работа осуществлялась в соответствии с правилами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных (ETS №123) и нормами биоэтики (https://cioms.ch/images/stories/CIOMS/IGP2012.pdf). Работы с животными одобрены комиссией по биоэтике НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ (№2/19 от 20 февраля 2019 г.).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.