Важным фактором патогенеза варикозной болезни нижних конечностей является дисрегуляция синтеза коллагена [1—5]. В многочисленных исследованиях установлены многогранные изменения содержания в венозной стенке коллагенов разных типов. Наибольшее внимание исследователей привлекло в первую очередь изучение содержания интерстициальных коллагенов I и III типов, которые формируют крупные фибриллы в стенке вен. Следует отметить, что тщательный анализ литературы выявил некоторую противоречивость в данных, приводимых разными авторами. Большинство авторов [3, 4, 6—9] отмечают изменение соотношения содержания двух типов коллагена в сторону увеличения в стенке содержания коллагена I типа и уменьшение содержания коллагена III типа. В то же время Z. Haviarova и соавт. [10] и И.В. Сорокина и соавт. [2] в своих исследованиях выявили противоположную тенденцию: увеличение в венозной стенке содержания коллагена III типа и уменьшение содержания коллагена I типа. Полученные исследователями разные данные противоречивы только на первый взгляд. Если учесть, что коллаген I типа является перицеллюлярным (клеточно-связанными), сосредоточен вокруг клеток и образует для них опору по типу экзоцитоскелета, то становится понятным: соотношение коллагенов I и III типов может варьировать в разные периоды патологического процесса и на разных участках вены. При этом в одной вене может одновременно наблюдаться чередование участков гипертрофии и атрофии мышечных элементов.

Предпринимались попытки изучения содержания в варикозных венах и других типов коллагенов. Так, Y. Waksman и соавт. [8] установили, что в варикозно-расширенных венах содержание еще одного интерстициального коллагена — коллагена V типа ниже, чем в нормальных венах. Объяснить данный факт трудно, тем более что коллаген V типа, как и коллаген I типа, также относится к перицеллюлярным. Можно только предположить, что в силу происходящих изменений синтез коллагена V типа нарушается, и он заменяется коллагеном I типа.

Нефибриллярным коллагенам, в частности IV и VI типов, исследователями было незаслуженно уделено гораздо меньше внимания. Эти два типа коллагенов играют важную роль в обеспечении нормальной пространственной и функциональной организации сосудистой стенки. Как известно, коллаген IV типа является основным компонентом базальной мембраны сосудов, а коллаген VI типа — компонентом микрофибриллярных структур, локализованных вокруг клеток, формирует сеть между волокнами коллагенов I и III типов, базальной мембраной. Следует обоснованно предположить, что возможные изменения содержания данных типов коллагенов также могут иметь значение в развивающихся патоморфологических изменениях венозной стенки. Мы не смогли найти работ, в которых бы предпринимались попытки изучения содержания в стенке варикозно-измененных вен коллагена VI типа, и имеются только отдельные исследования по оценке изменений содержания коллагена IV типа [2, 9, 11, 12]. Данные упомянутых работ также противоречивы. D. Kirsch и соавт. [11, 12] в своих работах привели данные об увеличении содержания коллагена IV типа, особенно в субэндотелии. Z. Krasiński и соавт. [9], а также И.В. Сорокина и соавт. [2] приводят данные об уменьшении содержания коллагена IV типа в варикозно-расширенных венах. В целом, рассматривая вопросы дисрегуляции коллагена в венозной стенке при варикозной болезни, можно полностью согласиться с C. Lim и A. Davies [13], которые, проанализировав данные литературы, в своем обзоре высказали мнение, что изменения содержания коллагена при варикозной трансформации вен еще окончательно не определены.

Очевидно, что выявленные изменения содержания разных типов коллагенов в варикозно-измененных венах имеют значение для понимания процессов изменения архитектоники коллагенового каркаса вен. Известно, что венозная стенка имеет довольно сложную пространственную организацию опорных и сократительных структур. Коллагеновые, эластические волокна и гладкомышечные клетки формируют сложные комплексы, обеспечивающие совместную реализацию их функций [14]. Коллагеновые волокна являются опорными структурами, выполняют роль своеобразного скелета сосудистой стенки, обеспечивают прочность и жесткость ее. Уникальность устройства коллагенового каркаса вены заключается в том, что он, обладая высокой прочностью и жесткостью, обеспечивает нормальную конфигурацию сосуда в обычных условиях и сохраняет его целостность при экстремальных воздействиях, при этом не препятствуя сосудодвигательным реакциям. Несомненно, разрушение или изменения хотя бы части конструкции каркаса приводят к морфологическим и функциональным нарушениям венозной стенки.

Учитывая вышеизложенное, представляется актуальным продолжение исследований, направленных на дальнейшее уточнение особенностей дисрегуляции синтеза коллагенов и выяснение их роли в процессе изменения упругоэластичных свойств стенки поверхностных и глубоких вен при варикозной болезни.

Цель исследования — изучить содержание коллагенов IV и VI типов в стенке большой подкожной и задних большеберцовых вен при варикозной болезни нижних конечностей.

Исследование одобрено этическим комитетом УО «Витебский государственный медицинский университет». Материалом для исследования являлись участки большой подкожной и задних большеберцовых вен 18 пациентов (4 женщины, 14 мужчин) с варикозным расширением вен нижних конечностей (класс С3 — у 8 пациентов, класс С4 — у 10), которым была выполнена флебэктомия и резекция задних большеберцовых вен в хирургическом отделении УЗ «Вторая Витебская областная клиническая больница» в период с октября 2012 г. по апрель 2013 г.

У всех пациентов при проведении ультразвукового ангиосканирования выявили несостоятельность клапанов задних большеберцовых вен, что стало в соответствии с принятой в клинике концепцией основанием для выполнения одновременно с длинным стриппингом большой подкожной вены коррекции кровотока в глубоких венах голени путем резекции задних большеберцовых вен. Операцию выполняли не в классическом варианте, описанном в литературе [15], а в виде дистальной резекции, когда задние большеберцовые вены резецируются на протяжении 1—1,5 см позади медиальной лодыжки [16]. Для гистологического исследования забирали также дистальный (на уровне медиальной лодыжки) участок большой подкожной вены, удаляемой при стриппинге.

В качестве контроля были использованы по 7 образцов большой подкожной и задних большеберцовых вен, полученные в Витебском областном клиническом патологоанатомическом бюро от умерших, у которых не выявлено варикозного расширения вен нижних конечностей. Возрастных различий между оперированными пациентами и лицами, включенными в группу контроля, не было.

Для морфологического исследования из образцов после фиксации в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и стандартной гистологической проводки готовили серийные срезы толщиной 4—5 мкм. Использовали следующие методы окраски: гематоксилином и эозином, по методу Ван-Гизона — обзорная микроскопия, по Эйнарсону, по Гейденгайну, иммуногистохимическую с применением лиофилизованных моноклональных антител Collagen Type IV и Collagen Type VI (alpha 3 Chain) «Novocastra»).

При проведении морфометрической оценки гистологических препаратов использовали компьютерную систему анализа изображений (микроскоп Leica DM 2000 с цифровой камерой и лицензионной программой Leica Aplication Suite, Version 3.6.0). С помощью световой микроскопии при ×100, ×200, ×400, ×630 оценивали гистоморфологические изменения в исследуемых фрагментах большой подкожной вены и задних большеберцовых вен, характер экспрессии коллагенов IV и VI типов по отношению к основным структурным компонентам венозной стенки.

Для исследования препаратов, окрашенных моноклональными антителами к коллагенам IV и VI типов, производили фотографирование каждого препарата в 10 полях зрениях при ×400. Дальнейшую обработку цифровых изображений проводили с использованием программы WCIF ImageJ 1,45s, в рамках которой количественно оценивали площадь гистологического препарата, площадь положительно проэкспрессировавших коллагеновых волокон в составе основных компонентов венозной стенки.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007 и лицензионной программы Statistica 10.0 («StatSoft, Inc»., 2001). Для оценки характера распределения полученных данных использовали критерий Колмогорова—Смирнова. С учетом того, что распределение в выборках отличалось от нормального, использовали непараметрические методы статистического анализа. Определяли медиану (Me), 25%-й (LQ) и 75%-й (UQ) квартили. Для оценки достоверности различий между группами использовали U-тест Манна—Уитни и двухвыборочный критерий Колмогорова—Смирнова. Критическое значение уровня значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 5% (р<0,05).

Исследование характера экспрессии коллагена IV типа в образцах большой подкожной вены, взятых у пациентов с варикозной болезнью, показало, что проэкспрессировавшие коллагеновые волокна определялись во всех слоях сосудистой стенки. Аналогичная картина была выявлена и в контрольных образцах (рис. 1).

Морфометрический анализ дал следующие результаты. Суммарная площадь положительно проэкспрессировавшего коллагена IV типа в образцах большой подкожной вены при варикозной болезни составила 0,000760 (0,000566; 0,001177) мкм². В контрольных образцах она была выше — 0,000973 (0,000789; 0,001420) мкм² (p≤0,01).

Характер экспрессии коллагена IV типа в образцах задних большеберцовых вен был аналогичен выявленному в образцах большой подкожной вены. Положительно проэкспрессировавшие коллагеновые волокна определялись во всех слоях венозной стенки как при варикозной болезни, так и в контрольной группе (рис. 2). Вместе с тем, как и в поверхностных венах, в стенке задних большеберцовых вен пациентов, страдающих варикозной болезнью, площадь проэкспрессировавших коллагеновых волокон IV типа была достоверно меньше — 0,000577 (0,000411; 0,000863) мкм², чем в контрольных образцах — 0,000696 (0,000574; 0,000827) мкм² (p≤ 0,05).

При исследовании характера экспрессии коллагена VI типа в образцах большой подкожной вены положительно проэкспрессировавшие коллагеновые волокна определялись во всех слоях сосудистой стенки как при варикозной болезни, так и в контрольных образцах (рис. 3).

Морфометрическая оценка выраженности экспрессии маркера показала довольно высокую степень экспрессии коллагена VI типа в образцах большой подкожной вены с варикозной трансформацией. Суммарная площадь положительно проэкспрессировавшего коллагена VI типа составляла 0,006037 (0,004729; 0,007869) мкм². В контрольной группе экспрессия коллагена VI типа была достоверно ниже — 0,003538 (0,002516; 0,004647) мкм² (p<0,0001).

Исследование характера экспрессии коллагена VI типа в образцах задних большеберцовых вен показало, что положительно проэкспрессировавшие коллагеновые волокна также определялись во всех слоях сосудистой стенки и при варикозной болезни, и в контрольной группе (рис. 4). В образцах задних большеберцовых вен при варикозной болезни, как и в варикозно-трансформированных поверхностных венах, установлено повышенное содержание коллагена VI типа — 0,004395 (0,002775; 0,006437) мкм² — по сравнению с группой контроля — 0,003259 (0,002634; 0,0044197) мкм² (p=0,012).

Как показал морфометрический анализ, при варикозной болезни и в поверхностных венах (большая подкожная вена), и в глубоких венах (задние большеберцовые вены) содержание коллагенов IV и VI типов отличается от нормального. Однако выявленные изменения носят различный характер. Так, можно говорить, что количество коллагена IV типа в стенке большой подкожной вены уменьшается по сравнению с нормой, а количество коллагена VI типа увеличивается. В отношении коллагена IV типа наши результаты совпадают с представленными Z. Krasiński и соавт. [9] и И.В. Сорокиной и соавт. [2], которые также в своих исследованиях выявили уменьшение содержания коллагена IV типа в поверхностных венах при варикозной трансформации. В то же время следует отметить, что D. Kirsch и соавт. [11, 12] в своих работах привели противоположные результаты. По их мнению, содержание коллагена IV типа в варикозно-расширенных венах увеличивается.

Для объяснения полученных нами результатов и имеющихся противоречивых данных других исследователей следует вспомнить хорошо изученные общие морфологические изменения различных слоев венозной стенки при варикозной трансформации. На начальных стадиях заболевания в варикозно-расширенных венах выявляется утолщение интимы [1, 5, 13, 17—20]. Обусловлено это изменениями в субэндотелиальном слое, в котором на фоне дистрофических изменений типа мукоидного и фибриноидного набухания [20] отмечается увеличение содержания эластических и коллагеновых волокон [1, 19, 21, 22], миграция мышечных клеток в субэндотелий [2, 23]. На более поздних стадиях развивается фиброз внутренней оболочки вен, эластические волокна утолщаются, а внутренняя мембрана разрыхляется и разрушается [2, 17, 24, 25]. Это приводит к уменьшению толщины интимы с сохранением отдельных участков гипертрофии [20]. В средней оболочке на ранних стадиях заболевания отмечается гипертрофия мышечных элементов [5, 13, 17, 18, 21, 26, 27], что приводит к ее выраженному утолщению. При этом в среднем и наружном слоях отмечается увеличенное количество vasa vasorum, свидетельствующее об усилении кровоснабжения венозной стенки [28, 29]. Очевидно, что эти изменения являются компенсаторно-приспособительными и направлены на восстановление извращенного венозного оттока. По мере прогрессирования патологического процесса в средней оболочке появляется атрофия мышечных структур, поэтому она истончается. Нередко отмечается чередование участков стенки с гипертрофией и атрофией мышечных элементов [30]. Одновременно в средней и адвентициальной оболочках уменьшается количество vasa vasorum, они становятся извитыми, склерозируются и окклюзируются [28, 29].

У всех пациентов, включенных в исследование, были клинические классы С3 и С4 и имелась выраженная трансформация большой подкожной вены, потребовавшая выполнения ее удаления на всем протяжении. Соответственно, морфологические изменения венозной стенки были существенными. Коллаген IV типа находится в базальной мембране сосудов. Если последняя разрушается и уменьшается количество vasa vasorum, то и количество коллагена данного типа уменьшается, что мы и установили в своем исследовании. Нельзя исключить, что на начальных стадиях, когда интима утолщается и возрастает количество vasa vasorum, возможно увеличение содержания коллагена IV типа, что и выявили в своих исследованиях D. Kirsch и соавт. [11, 12].

Увеличение содержания коллагена VI типа в стенке варикозно-измененной вены, по нашему мнению, объясняется развивающейся общей коллагенизацией стенки. Известно, что при прогрессировании заболевания во всех слоях венозной стенки наблюдается увеличение коллагеновых волокон и изменение их структуры. Они утолщаются, становятся грубыми и нередко разрушаются. Коллаген VI типа является компонентом микрофибриллярных структур, формирующих сеть между волокнами коллагенов I и III типов, а также мышечных клеток, количество которых тоже меняется. Соответственно, указанные изменения и могут обусловливать увеличение содержания коллагена VI типа. Можно даже предположить, что эти изменения направлены на сохранение коллагенового каркаса вены, страдающего за счет перестройки крупных фибрилл, формируемых коллагенами I и III типов.

Результаты нашей работы позволили выявить еще одну важную закономерность, которая ранее в литературе не описывалась. В глубоких венах (задние большеберцовые вены) содержание коллагенов IV и VI типов при варикозной болезни также отличается от нормального. Причем характер изменений аналогичен выявленному в поверхностных венах — содержание коллагена IV типа уменьшается, а VI типа увеличивается. Эти изменения протекают если и не синхронно, то, как минимум, однонаправленно. Все пациенты, включенные в исследование, имели недостаточность клапанов глубоких вен, что дает основание говорить о нарушении коллагенового каркаса и, соответственно, упруго-эластичных свойств стенки глубоких вен при данной форме заболевания. Возможно, это и является морфологическим субстратом возникновения патологических рефлюксов в глубоких венах.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при варикозной болезни отмечается уменьшение содержания коллагена IV типа и увеличение содержания коллагена VI типа как в стенке большой подкожной вены, так и в стенке задних большеберцовых вен. Можно предположить, что эти изменения лежат в основе изменений упругоэластичных свойств не только поверхностных, но и глубоких вен, и играют существенную роль в нарушении венозного оттока и развитии хронической венозной недостаточности.

1. При варикозной болезни в стенке большой подкожной вены содержание коллагена IV типа уменьшается, а коллагена VI типа увеличивается по сравнению с нормой.

2. В стенке задних большеберцовых вен при варикозной болезни у пациентов с несостоятельностью клапанов глубоких вен содержание коллагена IV типа меньше, а коллагена VI типа больше, чем в норме.

3. Выявленные изменения содержания коллагенов IV и VI типов в стенке поверхностных и глубоких вен могут играть важную роль в нарушении упругоэластичных свойств венозной стенки.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — С.А.

Сбор и обработка материала — С.А., И.В., М.М.

Статистическая обработка — С.А.

Написание текста — С.А., И.В., М.М.

Редактирование — С.А., И.В.