Михеева И.О.

ООО «Гастарт»

Цапкова Л.А.

ГБУЗ города Москвы «Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы»

Бодунова Н.А.

ГБУЗ города Москвы «Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы»

Бордин Д.С.

ГБУЗ города Москвы «Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы»;
ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России;
ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России

Дехнич Н.Н.

ФГБУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России

Полякова В.В.

ГБУЗ города Москвы «Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова Департамента здравоохранения города Москвы»

Репьев А.П.

ООО «Гастарт»

Сравнительное исследование лабораторных методов выявления антибиотикорезистентности Helicobacter pylori

Авторы:

Михеева И.О., Цапкова Л.А., Бодунова Н.А., Бордин Д.С., Дехнич Н.Н., Полякова В.В., Репьев А.П.

Подробнее об авторах

Просмотров: 2372

Загрузок: 117


Как цитировать:

Михеева И.О., Цапкова Л.А., Бодунова Н.А., Бордин Д.С., Дехнич Н.Н., Полякова В.В., Репьев А.П. Сравнительное исследование лабораторных методов выявления антибиотикорезистентности Helicobacter pylori. Доказательная гастроэнтерология. 2023;12(3):64‑73.
Mikheeva IO, Tsapkova LA, Bodunova NA, Bordin DS, Dekhnich NN, Polyakova VV, Repyev AP. A comparative study of laboratory methods for detecting Helicobacter pylori antibiotic resistance. Russian Journal of Evidence-Based Gastroenterology. 2023;12(3):64‑73. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/dokgastro20231203164

Рекомендуем статьи по данной теме:
Осо­бен­нос­ти вос­па­ли­тель­но­го про­цес­са в сли­зис­той обо­лоч­ке же­луд­ка при ее со­че­тан­ном бак­те­ри­аль­но-ви­рус­ном ин­фи­ци­ро­ва­нии. До­ка­за­тель­ная гас­тро­эн­те­ро­ло­гия. 2024;(3):13-19
Вли­яние Heli­cobacter pylori и ду­оде­но­гас­траль­но­го реф­люк­са на раз­ви­тие и ре­зуль­та­ты ле­че­ния ги­пер­плас­ти­чес­ких по­ли­пов же­луд­ка. До­ка­за­тель­ная гас­тро­эн­те­ро­ло­гия. 2024;(4):5-9
Эф­фек­тив­ность аль­фа-глу­та­мил-трип­то­фа­на в ле­че­нии хро­ни­чес­ко­го ат­ро­фи­чес­ко­го гас­три­та на кли­ни­чес­ких при­ме­рах. До­ка­за­тель­ная гас­тро­эн­те­ро­ло­гия. 2024;(4):121-128
Эф­фек­тив­ность Киот­ской клас­си­фи­ка­ции приз­на­ков гас­три­та в ди­аг­нос­ти­ке ин­фек­ции Heli­cobacter pylori. До­ка­за­тель­ная гас­тро­эн­те­ро­ло­гия. 2025;(1):29-38
Ра­ци­ональ­ность при­ема ан­ти­би­оти­ков на­се­ле­ни­ем Рос­сий­ской Фе­де­ра­ции. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(6):14-21
Роль Киот­ской клас­си­фи­ка­ции в эн­дос­ко­пи­чес­кой ди­аг­нос­ти­ке гас­три­та, ас­со­ци­иро­ван­но­го с ин­фек­ци­ей Heli­cobacter pylori. Эн­дос­ко­пи­чес­кая хи­рур­гия. 2024;(4):65-72
Осо­бен­нос­ти при­ема ан­ти­бак­те­ри­аль­ных пре­па­ра­тов на­се­ле­ни­ем в Рес­пуб­ли­ке Бе­ла­русь. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(10):15-22
KID-син­дром у маль­чи­ка 12 лет. Кли­ни­чес­кая дер­ма­то­ло­гия и ве­не­ро­ло­гия. 2024;(5):546-551
Эти­оло­ги­чес­кие осо­бен­нос­ти но­зо­ко­ми­аль­но­го си­ну­си­та. Вес­тник ото­ри­но­ла­рин­го­ло­гии. 2024;(5):35-42
Выз­ван­ные эпи­леп­си­ей осо­бен­нос­ти лич­нос­тно­го про­фи­ля сог­лас­но мо­де­ли «Боль­шая пя­тер­ка». Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. 2024;(10):16-21

Введение

Инфекция H. pylori в настоящее время остается широко распространенной среди населения во всем мире. Приблизительно 4,4 млрд человек инфицированы H. pylori [1, 2].

H. pylori — грамотрицательная жгутиковая бактерия. Предполагается, что H. pylori эволюционировала вместе с человеком. Отмечаются сильные различия в распространенности инфекции H. pylori среди населения в зависимости от региона, возраста, расы/этнической принадлежности и социально-экономического статуса [3, 4].

Распространенность H. pylori, оцененная по данным 13C-уреазного дыхательного теста у пациентов, ранее не получавших лечения, в России в настоящее время оценивается на уровне около 40%, самая высокая — в Южном (54,9%) и Северо-Кавказском (45,1%) федеральных округах РФ [5].

Большинство инфицированных H. pylori людей не имеют каких-либо симптомов, однако, попадая на слизистую оболочку желудка, бактерия всегда вызывает хронический гастрит, может служить фоном для развития язвенной болезни, атрофического гастрита и рака желудка [1, 6—9]. Helicobacter pylori является причиной более 90% случаев злокачественных новообразований (ЗНО) желудка. Рак желудка является причиной более 8,2% всех случаев смерти от рака во всем мире. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) отнесла H. pylori к канцерогенам первой группы [10]. Данные эпидемиологических исследований показывают, что у 2—3% людей, зараженных инфекцией H. pylori, в последующем развивается аденокарцинома желудка, а у 0,1% — MALT-лимфома желудка [10—12]. Обсуждается роль H. pylori при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК), гастроэзофарингеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ), неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), B12-дефицитной анемии и других заболеваниях [13—16].

Вышесказанное определяет важность своевременного выявления инфекции у пациентов и назначении эффективного лечения. Целью терапии является полное устранение (эрадикация) бактерии и профилактика осложнений. Через 30 дней после завершения приема схемы эрадикации должен быть проведен контроль ее эффективности [17].

Согласно российским клиническим рекомендациям (2022 г.), всем пациентам с хроническим гастритом с положительными результатами тестирования на инфекцию H. pylori в качестве этиологического лечения рекомендуется проведение эрадикационной терапии. Обязательна диагностика и эрадикационная терапия при язвенной болезнь (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки, MALT-лимфоме желудка, раннем раке желудка, у пациентов, перенесших эндоскопическую резекцию. В качестве методов первичной диагностики инфекции H. pylori и для контроля успеха терапии рекомендованы дыхательный тест с мочевиной, меченной 13C (13УДТ), определение моноклонального антигена H. pylori в кале [18].

Терапией первой линии для эрадикации инфекции H. pylori служит 14-дневная стандартная тройная терапия, включающая ингибитор протонной помпы (ИПП), кларитромицин и амоксициллин, усиленная висмута трикалия дицитратом или метронидазолом. В качестве альтернативы в качестве терапии первой линии может быть назначена классическая четырехкомпонентная терапия — ИПП, висмута трикалия дицитрат, тетрациклин и метронидазол [17, 18]. Этот же вариант может применяться в качестве терапии второй линии при неэффективности схем первой линии с кларитромицином. Другая схема терапии второй линии включает ИПП, левофлоксацин и амоксициллин, эффективность которой значимо повышается при добавлении препарата висмута. Терапия третьей линии подбирается индивидуально в зависимости от выбора предшествующих схем лечения [18].

Эффективность эрадикации инфекции H. pylori снижается на фоне нарастающей антибиотикорезистентности, связанной с мутациями генома бактерии [6, 19, 20]. Существует ряд тестов, позволяющих выявить антибиотикорезистентность, их можно разделить на две группы: фенотипические и молекулярно-генетические.

Методы выявления антибиотикорезистентности H. pylori

Методы определения антибиотикорезистентности подразделяют на фенотипические (традиционные) и молекулярно-генетические. К фенотипическим методам относят: диско-диффузионный метод, метод серийных разведений (в агаре, в бульоне) и комбинированный E-тест [6, 21, 22].

Диско-диффузионный метод основан на диффузии антибиотика из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста культуры бактерий в той зоне, в которой концентрация препарата превышает минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). В качестве носителя антибиотика применяются бумажные диски. Оценка антибиотикорезистентности проводится по величине диаметра зоны подавления роста культуры бактерий: чем больше диаметр подавления роста, тем ниже МИК и тем он эффективнее в отношении исследуемой культуры бактерий [6, 23].

Метод серийных (предельных) разведений также основан на выявлении показателя минимальной ингибирующей концентрации. Для этого в питательную среду добавляют заранее приготовленные концентрации антибиотика. После инкубации проводится оценка роста культуры бактерий в питательной среде, выявляют активную дозу антибиотика. Наиболее удобен способ разведения с использованием жидких питательных сред — есть возможности автоматизации данной методики, однако из-за сложностей выращивания и культивирования H. pylori этот метод не совсем удобен для масштабного применения [6, 23].

Комбинированный E-тест — разновидность диско-диффузионного метода — также основан на явлении простой диффузии. В данном случае носителем антибиотика является полимерная полоска, на которую нанесен градиент концентраций антибиотика. Оценка активности антибиотика проводится также по величине зоны подавления роста бактерий. Величину МИК определяют в том месте, где зона подавления роста вплотную примыкает к носителю антибиотика [6, 24, 25].

Представленные методы определения антибиотикорезистентности являются высокоспецифичными. Несмотря на широкое применение и введение в практику современных автоматических анализаторов, а также применение коммерческих наборов, данные методы все же остаются очень трудоемкими и длительными по времени исполнения, имеют множество предшествующих этапов перед выполнением непосредственно исследования на антибиотикорезистентность, таких как: приготовление питательной среды, контроль качества среды, приготовление бактериальной суспензии (инокулюма), инокуляция чашек с агаром, нанесение дисков с антибиотиками (для диско-диффузионного метода) или нанесение полимерной полоски с градиентом концентраций антибиотика (для E-теста), приготовление различных концентраций антибиотиков (метод серийных (предельных) разведений) и т.д. [23].

Для диско-диффузионного метода нет четких границ оценки МИК, все получаемые результаты имеют субъективную оценку. Также фактором, осложняющим рутинное применение данных методик выявления антибиотикорезистентности H. pylori, являются трудности, связанные с выращиванием и культивированием самой бактерии. Так как H. pylori является по своей природе анаэробом, поэтому быстро погибает в воздушной среде. Для увеличения шансов успешно вырастить культуру, необходимо как можно быстро доставить биоптат в лабораторию. Для использования фенотипических методов выявления антибиотикорезистентности необходимо соблюдение следующих требований: использовать субстанции антибиотиков с известным уровнем активности, соблюдать режимы хранения, тщательно выполнять контроль качества питательных сред. В противном случае высока вероятность ложных результатов, что ведет к выбору ошибочной и неэффективной схемы лечения и ухудшению качества жизни пациента.

В последнее время для выявления антибиотикорезистентности H. pylori стали активно внедрять и использовать молекулярно-генетические методы. Молекулярно-генетические методы позволяют выявить изменения в геноме бактерии, которые привели к ее резистентности в отношении конкретного препарата [26]. К таким методам относятся: полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (РТ-ПЦР), гибридизация с олигонуклеотидными зондами, анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP), секвенирование по Сэнгеру и секвенирование NGS [6]. Кроме того, молекулярный метод исследования не имеет таких жестких требований по скорости доставки биоптата в лаборатории.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации специфических последовательностей молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и последующего обнаружения ампликонов [27, 28]. Типичный процесс ПЦР включает циклическое повторение двух или трех температурных этапов, включающих денатурацию двухцепочечной ДНК, отжиг праймера и удлинение/синтез, что приводит к удвоению числа копий ДНК после каждого цикла. После завершения реакции ампликон может быть обнаружен путем разделения в агарозном геле или капиллярным электрофорезом (ПЦР по конечной точке) — отражает только качественную информацию. Начальная концентрация ампликонов может быть определена во время температурного цикла или путем добавления в реакционную смесь неспецифических интеркалирующих красителей ДНК, либо путем гибридизации продуктов реакции с флуоресцентными олигонуклеотидами (зондами) — ПЦР в режиме реального времени — количественный анализ [29, 30]. Метод полимеразной цепной реакции является высокочувствительным и характеризуется низким процентом погрешности. Так, согласно литературным данным, диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР-метода в отношении диагностики резистентности к кларитромицину в образцах кала составили 96,3% (95% ДИ, 92—98%) и 98,7% (95% ДИ, 97—99%) соответственно [30].

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это цитогенетический метод, основанный на гибридизации флуоресцентно меченных ДНК-зондов, со специфическими последовательностями ДНК, рРНК микроорганизмов и могут идентифицировать H. pylori и ее антибиотикорезистентность в срезах тканей или колониях H. pylori. Интерпретация результатов проводится с помощью флуоресцентного микроскопа [31, 32].

Секвенирование по Сэнгеру и NGS-секвенирование — методы, позволяющие выявить последовательность нуклеотидов в ДНК. На сегодняшний день эти методы полностью автоматизированы и проводятся на специальных приборах — секвенаторах. Метод секвенирования по Сэнгеру основан на принципе терминации цепи из-за избирательного включения дидезоксинуклеотидов ДНК-полимеразой во время синтеза цепи ДНК. Далее фрагменты разделяются с помощью электрофореза. Методика секвенирования по Сэнгеру применялась в исследовании антибиотикорезистентности H. pylori среди населения Китая. Данный метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью [33, 34].

Метод NGS — секвенирование с более высокой пропускной способностью, основан на методах пиросеквенирования, секвенирования путем синтеза, секвенирования путем лигирования и секвенирования ионных полупроводников. С помощью данного метода можно секвенировать весь геном бактерии H. pylori.

Группой ученых во главе с Jina Vazirzadeh, было проведено исследование резистентности к кларитромицину штаммов H. pylori, выделенных из биоптатов слизистой оболочки желудка пациентов с диспепсией в Исфахане (Иран). Была проведена оценка точечных мутаций в гене 23S рРНК. В результате частота мутаций A2143G и A2144G составила 68,4 и 31,5% соответственно. Мутация A2143C не была выявлена ни в одном изоляте [31]. Еще одной исследовательской группой было проведено изучение антибиотикорезистентности китайских клинических изолятов H. pylori с помощью секвенирования по Сэнгеру. В результате были выявлены генетические детерминанты резистентности к кларитромицину — 23S рРНК, к амоксициллину — Pbp1, к метронидазолу — гексоген A, к левофлоксацину — GyrA и GyrB [35].

В исследовании B.G. Nezami и его научной команды методом NGS выявляли мутации в генах gyrA, 23S рРНК и 16S рРНК. H. pylori была обнаружена в 126 из 133 биоптатов желудка (чувствительность 95%). Мутации, ассоциированные с антибиотикорезистентностью, присутствовали в 92 (73%) случаях, в том числе в 63 (50%) случаях с одной мутацией и в 29 (23%) случаях с мутациями в нескольких генах. В шестнадцати из пятидесяти восьми случаев терапия оказалась неудачной (28%). Неудача терапии коррелировала с количеством мутаций в генах резистентности: успешная эрадикация в случаях отсутствия мутаций (0/15), неудача в 19% (5/27) случаев с одной мутацией гена и неудача в 69% (11/16) случаев с мутацией более чем в одном гене. Мутации 23S рРНК (A2142G или A2413G) присутствовали в 88% (14/16) неудачных случаев в сравнении с 10% (4/42) случаев успешной эрадикации (p<0,001) [36].

Несмотря на то что методы секвенирования обладают высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, использовать их в рутинной клинико-диагностической практике экономически нецелесообразно. Данные методы, как правило, используют в научных целях.

В табл. 1 представлено сравнение методов определения антибиотикорезистентности H. pylori [6].

Таблица 1. Сравнительная характеристика методов определения антибиотикорезистентности H. pylori

Метод

Чувствительность/ Специфичность (%)

Трудоемкость

Степень автоматизации

Затраты времени, часов

Диско-диффузионный метод

96/99

Высокая

Низкая

18—48

Метод серийных разведений

Высокая

Высокая

Низкая

16-48

E-тест

96/99

Высокая

Низкая

16-48

Метод ПЦР

96/99

Низкая

Высокая

4—5

Секвенирование по Сэнгеру

98/98

Средняя

Высокая

8—9

NGS

98/98

Высокая

Средняя

до 72

FISH

Высокая

Средняя

Высокая

14—20

Оценивая приведенные данные о чувствительности, специфичности, трудоемкости, степени автоматизации и времени выполнения методов антибиотикорезистентности, можно сделать вывод, что не все методы удобны для масштабного, рутинного применения в клинико-лабораторной практике. Фенотипические методы слишком трудоемки и требуют значительных временных затрат, степень их автоматизации низкая. Метод NGS также не уступает по трудоемкости и дороговизне. Самым доступным, с точки зрения экономической эффективности, технической доступности, точности, чувствительности и специфичности является ПЦР-метод.

Цель исследования — провести сравнительную характеристику лабораторных методов выявления антибиотикорезистентности H. pylori, оценить диагностическую чувствительность и специфичность данных методик.

Материал и методы

Исследованы образцы чистых культур H. pylori (n=25) с установленной фенотипической резистентностью и чувствительностью к антибактериальным препаратам, предоставленные НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского государственного медицинского университета. Фенотипическое определение антибиотикорезистентности культур H. pylori проведено методом серийных разведений в катион-сбалансированном агаре Мюллера—Хинтон (OXOID, Великобритания) с добавлением бараньей крови (итоговая концентрация 5%) (E&O Laboratories Ltd., Шотландия) в соответствии с рекомендациями Института по клиническим и лабораторным стандартам США (CLSI). Использовали критерии оценки чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам, представленные в табл. 2 [23].

Таблица 2. Критерии оценки чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам

Препарат

МПК, мг/л

чувствительный1, ≤

резистентный1, >

Кларитромицин

0,25

0,5

Левофлоксацин

1,0

1,0

Примечание. 1Данные критерии не являются клиническими, а представляют собой эпидемиологические пограничные значения, разделяющие штаммы с природной чувствительностью и штаммы со сниженной чувствительностью.

Молекулярную резистентность определяли методом секвенирования по Сенгеру в Московском клиническом научном центре им. А.С. Логинова с использованием специально разработанных праймеров для секвенирования участков генов резистентности к кларитромицину 23S рРНК и левофлоксацину gyrA [37]. Молекулярно-генетическое исследование резистентности культур H. pylori к кларитромицину и левофлоксацину осуществляли методом RT-PCR с помощью коммерческого набора, предоставленного ООО «Гастарт» согласно инструкции производителя.

Результаты

В данной работе мы сопоставили три метода выявления антибиотикорезистентности H. pylori к кларитромицину и левофлоксацину: фенотипический, метод секвенирования по Сенгеру [37] и RT-PCR. Результаты фенотипической и молекулярной резистентности представлены в табл. 3.

Таблица 3. Данные о фенотипической и молекулярной резистентности 25 культур H. pylori

№ образца

Фенотип. резист. (МПК, мг/л)

Молекул. резист. Сенгер

Молекул. резист. РТ-ПЦР

Фенотип. резист. (МПК, мг/л)

Молекул. резист. Сенгер

Молекул. резист. РТ-ПЦР

Кларитромицин

Левофлоксацин

1

8

2142G

+

1

Wt

2

4

2142A/G

+

4

272G

+

3

8

2143A/G

+

0,5

Wt

-

4

4

2143G

+

1

272A/G

+

5

0,016

Wt

4

272A/G

+

6

0,03

Wt

1

Wt

7

0,016

Wt

4

271A

+

8

0,016

Wt

0,5

Wt

-

9

0,016

Wt

0,06

Wt

-

10

0,016

Wt

4

261A

+

11

0,016

Wt

0,125

Wt

12

0,016

Wt

0,125

261T/A, 271G/A

+

13

0,016

Wt

0,125

Wt

14

0,016

Wt

4

271A

+

15

0,016

Wt

4

261T/A

+

16

0,016

Wt

4

261T/A, 271G/A

+

17

0,016

Wt

0,125

261A

+

18

0,016

Wt

0,125

Wt

19

4

2143G

+

0,125

Wt

20

8

2142G

+

4

261G

+

21

4

2142G

+

4

271A

+

22

16

2143G

+

0,5

Wt

23

8

2143G

+

4

271A

+

24

16

2143G

+

4

272G

+

25

8

2143G

+

0,5

Wt

Примечание. Wt — аллель дикого типа; 2142, 2143 — позиции гена 23S rRNA, отвечающие за резистентность H. pylori к кларитромицину; 261, 271, 272 — позиции гена gyrA, отвечающие за резистентность к левофлоксацину. «+» — резистентен, «—» — чувствителен.

Одиннадцать культур, имеющие фенотипическую резистентность к кларитромицину, несли мутации в гене резистентности к кларитромицину 23S рРНК. Фенотипическую резистентность к левофлоксацину имели 11 культур H. pylori, тогда как мутации в гене, отвечающем за резистентность к левофлоксацину, наблюдались в 14 культурах.

Диагностическая чувствительность и специфичность метода RT-PCR в отношении резистентности к кларитромицину составила 100%. Диагностическая чувствительность и специфичность в отношении резистентности к левофлоксацину составила 100 и 78,57% соответственно.

Процентное соотношение выявленных мутаций, приводящих к устойчивости к кларитромицину и левофлоксацину, представлены на рис. 1. Самым частым вариантом гена 23S рРНК среди резистентных к кларитромицину культур оказался вариант 2143G, частота которого составила 64%. Самими частыми вариантами гена gurA оказались варианты 272G, 261A, 271A, частоты которых составили 33, 33 и 27% соответственно.

Рис. 1. Спектр вариантов генов 23S рРНК (а) и gurA (б) среди резистентных культур.

Обсуждение

Маркеры молекулярно-генетической резистентности гена 23S рРНК (2142G и 2143G) были выявлены во всех изолятах H. pylori с фенотипической резистентностью к кларитромицину. При оценке маркеров резистентности к левофлоксацину было показано, что все культуры с фенотипической резистентностью к левофлоксацину также имеют мутации в гене гиразы — gurA. В культурах под номерами 4, 12 и 17 не имеющих фенотипической резистентности к левофлоксацину, были обнаружены мутации, причем культура под номером 12 имеет мутацию как в 87, так и в 91 кодонах гена gyrA. Следует отметить, что во всех трех культурах наблюдается наличие аллеля как дикого, так мутантного типов. Это может объясняться наличием генетической гетерогенности бактерии H. pylori в представленных культурах. Необходимо дальнейшее изучение генетической устойчивости H. pylori к левофлоксацину. Возможно, что в отношении резистентности к левофлоксацину наряду с молекулярными участвуют и иные механизмы, приводящие к фенотипической резистентности.

Диагностическая чувствительность и специфичность метода RT-PCR в отношении резистентности к кларитромицину составила 100%, в отношении резистентности к левофлоксацину — 100 и 78,57% соответственно.

Ранее опубликованные нами данные о результатах молекулярно-генетического определения резистентности методом секвенирования по Сенгеру путем выявления аллельных вариантов в генах, ответственных за резистентность к кларитромицину — 23S рРНК (2142A>C, 2142A>G и 2143A>G) и левофлоксацину — gyrA (87-й кодон 259A>T, 261T/C>G/A и 91-й кодон 271G>A, 271G>T, 272A>G) продемонстрировали близкие результаты. Чувствительность и специфичность молекулярно-генетического метода определения резистентности к кларитромицину составили 100%, в отношении резистентности к левофлоксацину эти показатели составили 93 и 92% соответственно [37].

Чувствительность и специфичность различных методов исследования антибиотикорезистентности H. pylori может отличаться. Если слизистую оболочку желудка будут населять не только резистентные и не только чувствительные штаммы H. pylori, а гетерогенная группа бактерий, то результат исследования антибиотикорезистентности H. pylori будет зависеть от того, какие именно бактерии попали во фрагмент биоптата на исследование. Чувствительность метода РТ-ПЦР выше метода секвенирования по Сенгеру. Например, слизистую оболочку желудка населяет гетерогенная группа H. pylori с преобладанием чувствительных бактерий, тогда на хроматограмме сиквенса будет регистрироваться наличие двух аллелей — дикого и мутантного типов, при этом сигнал флуоресценции, соответствующий аллелю дикого типа, будет выше сигнала флуоресценции соответствующего мутантному аллелю. И наоборот, если в слизистой желудка преобладают бактерии H. pylori с антибиотикорезистентностью, то флуоресцентный сигнал, соответствующий мутантному аллелю, будет выше, чем сигнал флуоресценции, соответствующий сигналу аллеля дикого типа (рис. 2) [37]. Однако, если доля резистентных бактерий окажется слишком мала, ниже порога чувствительности метода секвенирования по Сенгеру, то детектировать наличие резистентности этим методом не удастся. В этом смысле метод РТ-ПЦР обладает большей чувствительностью по сравнению с методом секвенирования по Сенгеру. Так, в работе Ch. Zhang (2021) показано, что по сравнению с методом секвенирования по Сэнгеру мультиплексный тест аллель-специфичной ПЦР имел высокую диагностическую чувствительность и специфичность выявления резистентности к кларитромицину (96 и 93%), к левофлоксацину (95 и 92%) [34].

Рис. 2. Хроматограмма нуклеотидной последовательности участка гена gyrA, демонстрирующая генетическую гетерогенность H. pylori [37].

В 2021 г. в журнале Pathology Oncology Research вышла статья, посвященная гетерогенности H. pylori в отношении резистентности к кларитромицину и ее прогностической роли в отношении терапии. В исследовании использовался метод гибридизации in situ для визуализации сосуществования резистентных и чувствительных бактерий в одном образце ткани [32]. В работе наглядно продемонстрирована генетическая гетерогенность H. pylori, населяющих слизистую оболочку желудка (рис. 3). Для исследования брали 5 фрагментов слизистой оболочки желудка (3 фрагмента из антрального отдела и 2 фрагмента из тела желудка).

Рис. 3. Изображение гетерогенности Helicobacter pylori в отношении резистентности к кларитромицину, обнаруженной с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Чувствительные к кларитромицину бактерии H. pylori проявляют зеленую флуоресценцию, устойчивые к кларитромицину бактерии H. pylori проявляются желтым цветом [32].

Таким образом, очевидно, что универсального метода исследования антибиотикорезистентности H. pylori, с точки зрения ее гетерогенности, нет. Для получения более точного результата рекомендуется брать для исследования более двух фрагментов слизистой оболочки желудка. Тем не менее метод РТ-ПЦР является самым предпочтительным для диагностики инфекции H. pylori и ее антибиотикорезистентности в контексте экономической целесообразности, меньшей трудоемкости, быстрым получением результата по сравнению с другими методами.

Выводы

1. Результаты анализа фенотипической и молекулярно-генетической резистентности культур H. pylori показывают полное совпадение в отношении кларитромицина и близкие данные в отношении левофлоксацина. Диагностическая чувствительность и специфичность молекулярно-генетических методов определения резистентности к кларитромицину составила 100%, к левофлоксацину — 100 и 78,57% соответственно.

2. Необходимо учитывать гетерогенность бактерии H. pylori, населяющую слизистую оболочку желудка. Для получения более точного и объективного результата в отношении диагностики наличия инфекции H. pylori и ее антибиотикорезистентности необходимо исследовать от 3 до 5 фрагментов слизистой желудка у одного пациента.

3. Сравнительная характеристика методов демонстрирует, что метод РТ-ПЦР является самым оптимальным для применения в клинико-диагностической практике.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Репьев А.П., Бодунова Н.А., Бордин Д.С.

Сбор и обработка материала — Дехнич Н.Н., Цапкова Л.А., Михеева И.О., Полякова В.В.

Статистический анализ данных — Цапкова Л.А.

Написание текста — Михеева И.О.

Редактирование — Цапкова, Л.А., Репьев А.П., Бордин Д.С., Дехнич Н.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution:

Study design and concept — Repyev A.P., Bodunova N.A., Bordin D.S.

Data collection and processing — Dekhnich N.N., Tsapkova L.A., Mikheeva I.O., Polyakova V.V.

Statistical analysis — Tsapkova L.A.

Text writing — Mikheeva I.O.

Editing — Tsapkova, L.A., Repyev A.P., Bordin D.S., Dekhnich N.N.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.