По данным Международного агентства по изучению рака ВОЗ, рак желудка (РЖ) занимает 6-е место по частоте и 7-е среди причин смерти от опухолевых заболеваний в мире [1]. В России РЖ занимает 6-е место в структуре онкологической заболеваемости, при этом отмечается более высокая смертность — 2-е место среди всех опухолей в Российской Федерации, а среднероссийский показатель несвоевременной диагностики (III—IV клиническая стадия) РЖ в 2023 г. составил 57%, летальность больных в течение года с момента установления диагноза превышает 40%. Также нужно отметить прерванную наблюдавшуюся ранее тенденцию к снижению заболеваемости, в 2022 и 2023 гг. выявлено увеличение количества диагностированных случаев [2].

Перспективные пути решения этой проблемы — ранняя диагностика и прогноз риска развития РЖ при помощи оценки в слизистой оболочке желудка (СОЖ) молекулярных маркеров, нарушение экспрессии которых возникает на ранних этапах канцерогенеза. Потенциал развития данного направления также отмечается экспертами ВОЗ: «Возможность использования молекулярных маркеров в отношении стратификации риска развития РЖ находится на этапе исследования» [3].

Белок PDCD4 (programmed cell death protein 4) является важнейшим белком-мишенью, в частности, для хорошо изученной miR-21, за счет подавления синтеза которого некодирующая РНК реализует свое влияние на ключевые биологические процессы клетки [4—6]. При этом сама miR-21 является одним из наиболее актуальных маркеров-предикторов в отношении оценки риска развития РЖ [7—9]. Белок PDCD4 взаимодействует с eIF4A (эукариотический фактор инициации трансляции 4A), который затем связывается с eIF4G (эукариотический фактор инициации трансляции 4G) и формирует эукариотический комплекс инициации трансляции (eIF4F), необходимый для кэп-зависимой трансляции и синтеза белков [10]. Взаимодействие с белком PDCD4 ведет к подавлению хеликазной активности eIF4A по отношению к мРНК и ингибированию кэп-зависимой трансляции, таким образом происходит подавление гиперпродукции большого количества белков, таких как SIN1, c-Myc, XIAP, TWIST1, связанных с регуляцией апоптоза, пролиферации, эпителиально-мезенхимального перехода, за счет чего и реализуется роль PDCD4 как онкосупрессора [11—13].

В клетках злокачественных опухолей показано выраженное снижение количества белка PDCD4, в норме расположенного преимущественно в ядре и в меньшей степени — в цитоплазме клеток [11]. Также был продемонстрирован высокий уровень мутаций с утратой экспрессии белка PDCD4 и гиперэкспрессии miR-21 при микросателлит-нестабильном РЖ [14]. Таким образом, оценка белка PDCD4 в СОЖ представляет интерес с точки зрения его возможного предиктивного и диагностического потенциала в отношении определения предраковых изменений и РЖ.

Цель исследования — оценка экспрессии PDCD4 в качестве потенциального маркера предикции развития рака желудка и дифференциальной диагностики дисплазии слизистой оболочки желудка.

Материал и методы

Объектами исследования были фрагменты слизистой оболочки желудка. В 1-ю группу вошло 62 образца эндоскопического биопсийного материала СОЖ пациентов с диспептическими жалобами (35 мужчин, 27 женщин, средний возраст 51±14 лет) при хроническом гастрите (по международному протоколу OLGA [15]). Из 5 фрагментов условно выделен 1 образец слизистой оболочки антрального отдела желудка с так называемыми ранними предраковыми изменениями [15].

Во 2-й группе представлен операционный материал — 60 случаев спорадического РЖ (39 мужчин, 21 женщина, средний возраст 64±9 лет). В каждом случае из резецированного желудка проводили забор 1 образца ткани опухоли и 1 фрагмента слизистой оболочки антрального отдела желудка дистантной зоны (на отдалении от границы опухолевого роста не менее 10 мм). Тубулярная аденокарцинома (ICD-O код 8211/3) обнаружена в 57 случаях, папиллярная аденокарцинома (ICD-O код 8260/3) выявлена в 3 случаях; дифференцировка опухоли в 29 случаях соответствовала низкой степени злокачественности (высоко- и умеренно дифференцированные), в 31 случае — высокой степени злокачественности (низкодифференцированные) в соответствии с «Классификацией опухолей системы пищеварения Всемирной организации здравоохранения», 5-й пересмотр [3]. В 36 случаях опухоль находилась в антральном отделе, в 24 — в теле желудка. Исключались из исследования дискогезивная и перстневидно-клеточная карцинома, карцинома с лимфоидной стромой.

В 3-ю группу вошло 50 случаев эндоскопического биопсийного исследования СОЖ пациентов с диспептическими жалобами (21 мужчина, 29 — женщин, средний возраст 66±10 лет) и наличием в биоптате дисплазии эпителия («выраженные предраковые изменения» [15]): 25 образцов СОЖ соответствовали дисплазии низкой степени, 25 случаев —высокой степени. В соответствии с фенотипическими вариантами из всех случаев дисплазии низкой степени 16 соответствовали кишечному фенотипу, 4 — пилорическому, 4 — фовеолярному, 1 — зубчатому; среди случаев дисплазии высокой степени 23 имели кишечный фенотип, 1 — пилорический, 1 — фовеолярный [3].

Гистологическую проводку материала, заливку в парафин, приготовление парафиновых срезов и окраску гематоксилином и эозином проводили по общепринятой методике. Выраженность воспаления и атрофии в биоптатах СОЖ, образцах операционного материала оценивали при помощи визуально-аналоговых шкал Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита OLGA [16].

Гистохимическое определение и типирование кишечной метаплазии биоптатов 1-й группы проводились за счет комбинированной гистохимической методики обнаружения щеточной каемки (полная, тип I), гистохимического типирования муцинов при помощи окраски альциановым синим и реактивом Шиффа/ШИК-реакции (неполная, II тип), диамином железа (неполная, III тип) [17].

Для проведения иммуногистохимического (ИГХ) исследования с помощью модифицированного метода tissue microarray были сформированы тканевые матрицы, включающие 20 исследуемых образцов и отрицательный внешний контроль [18]. ИГХ-оценка экспрессии PDCD4 во всех случаях проводилась на парафиновых срезах с использованием кроличьих моноклональных антител, разведение 1:100 (клон EP102, Abcam, Великобритания) с использованием системы детекции Diagnostic BioSystems (США). Депарафинизация и регидратация, высокотемпературная демаскировка антигена при pH 6,0 в цитратном буфере, инкубация с антителами проводились по стандартному протоколу в соответствии с инструкцией производителя. Лимфоциты воспалительного инфильтрата использовались в качестве внутреннего положительного контроля, фрагмент ткани аденокарциномы толстой кишки использовался как внешний отрицательный контроль.

Для анализа результатов ИГХ-исследования белка PDCD4 использовался оригинальный метод расчета индекса полуколичественной ИГХ-оценки белка PDCD4 [19] по следующей формуле:

Индекс PDCD4= ЭЯ+ЭЦ, где ЭЯ=ЧОЯ·ИЯ,

где ЭЯ — экспрессия в ядре; ЧОЯ — частота окрашивания ядер (отсутствие экспрессии — 0 баллов, 1—30% окрашенных ядер — 1 балл, 31—70% окрашенных ядер — 2 балла, более 70% окрашенных ядер — 3 балла); ИЯ — интенсивность окраски ядер (отсутствие метки — 0 баллов, слабая метка — 1 балл, умеренная интенсивность метки — 2 балла, выраженная интенсивность метки — 3 балла); ЭЦ — экспрессия в цитоплазме, полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски цитоплазмы (отсутствие метки — 0 баллов, слабая метка — 1 балл, умеренная интенсивность метки — 2 балла, выраженная интенсивность метки — 3 балла).

Микрофотографии выполнены камерой AxioCam MRc5, микроскоп Axioscope 40, обработка изображений проведена при помощи пакета программного обеспечения ZEISS ZEN (Carl Zeiss, Германия).

Статистическая обработка данных выполнялась в Microsoft Office Excel (Microsoft, США), пакет Statistika 10.0 (StatSoft, США). Описательная статистика представлена в виде медианы, межквартильного диапазона, максимального и минимального значения (количественные данные, распределение, отличающееся от нормального), среднеарифметического и стандартного отклонения (количественные данные, распределение, соответствующее нормальному), процентного соотношения (номинальные данные). Аналитическая статистика выполнена с использованием точного критерия Фишера (номинальные данные, малое количество случаев в одной или более вариант), критерия Манна—Уитни (порядковые данные, сравнение 2 групп), критерия Краскела—Уоллиса с апостериорным попарным сравнением с использованием критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони (порядковые данные, сравнение 3 групп и более). Для оценки прогностического и диагностического потенциала использовался метод простого регрессионного анализа, ROC-анализ.

Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России (протокол № 16 от 28.12.23).

Результаты и обсуждение

В 1-й группе по результатам гистологической оценки была обнаружена меньшая степень выраженности воспаления (слабое — 28, умеренное — 25, выраженное — 9 образцов) и атрофии (атрофия отсутствует — 28, слабая — 20, умеренная — 8, выраженная — 6 образцов) в сравнении с образцами СОЖ дистантной зоны 2-й группы (слабое воспаление в 17 случаях, умеренное в 30, выраженное в 13; атрофия отсутствовала в 20 случаях, слабая — в 12, умеренная — в 10, выраженная — в 18 образцах). В отношении воспаления различия оказались статистически незначимыми (p=0,082), а большая выраженность атрофии в образцах СОЖ дистантной зоны 2-й группы была статистически значимой (p=0,034).

По результатам гистохимического типирования кишечная метаплазия в 1-й группе соответствовала полной (тип I) в 12 случаях, неполной (тип II) в 5 случаях, неполной (тип III) в 3 образцах; в образцах СОЖ дистантной зоны 2-й группы кишечная метаплазия была полной (тип I) в 21 образце, неполной (тип II) в 6, неполной (тип III) в 5 образцах. При этом отличий в распределении между группами не обнаружено (p=0,86).

Экспрессия PDCD4 в слизистой оболочке желудка на этапах каскада канцерогенеза

При ИГХ-оценке PDCD4 в СОЖ как в группе биопсийного материала при хроническом гастрите, так и в дистантной зоне операционного материала выявлена выраженная ядерная экспрессия и слабая либо умеренная цитоплазматическая экспрессия в эпителиоцитах, что соответствует данным, показанным в аналогичных работах [14]. Было получено высокое значение индекса ИГХ-оценки белка PDCD4: медиана составила 10 баллов (10—11) в обеих группах (рис. 1, а—б; рис. 2).

Рис. 1. Экспрессия белка PDCD4 в слизистой оболочке и аденокарциноме желудка.

а — биоптат СОЖ антрального отдела, интенсивная, преимущественно ядерная экспрессия в эпителиоцитах (индекс PDCD4 — 10 баллов); б — образец СОЖ антрального отдела дистантной зоны, интенсивная ядерная экспрессия в эпителиоцитах (индекс PDCD4 — 9 баллов); в — высокодифференцированная тубулярная аденокарцинома, утрата экспрессии PDCD4 в опухолевых клетках (индекс PDCD4 — 1 балл); г — умеренно-дифференцированная тубулярная аденокарцинома, утрата ядерной при наличии интенсивной цитоплазматической экспрессии (индекс PDCD4 — 4 балла); д — СОЖ антрального отдела дистантной зоны 2-й группы, отсутствие продукции белка PDCD4 в светлом центре лимфоидного фолликула; е — биоптат СОЖ антрального отдела, умеренная абсолютная атрофия, выраженная экспрессия белка PDCD4 (индекс PDCD4 — 10 баллов); ж — биоптат СОЖ антрального отдела, неполная (тип II) кишечная метаплазия, выраженная экспрессия PDCD4 (индекс PDCD4 — 10 баллов); з — биоптат СОЖ антрального отдела, полная (тип I) кишечная метаплазия, выраженная экспрессия PDCD4 (индекс PDCD4 — 10 баллов). Иммуногистохимическая реакция, а—в — ×200 (врезки ×400); г — ×400; д—е — ×100; ж — ×200; з — ×400.

Рис. 2. Распределение значений индекса белка PDCD4 в исследуемых группах.

1 — группа биоптатов СОЖ при хроническом гастрите; 2 — образцы дистантной зоны операционного материала желудка; 3 — группа биоптатов СОЖ с наличием дисплазии; 4 — образцы аденокарциномы желудка.

Интенсивная ядерная метка PDCD4 отмечалась в подавляющем большинстве эпителиальных клеток СОЖ при различной степени выраженности воспалительной инфильтрации и атрофии, а также при регенераторных изменениях эпителиоцитов. В случае формирования лимфоидных фолликулов отмечалось отсутствие ИГХ-метки белка PDCD4 в светлых центрах (рис. 1, д—е). Это соответствует функции белка PDCD4 как ингибитора пролиферации, продемонстрированной в ряде работ [11,12].

В очагах кишечной метаплазии ядерная экспрессия PDCD4 сохранялась на высоком уровне, в отдельных случаях даже несколько превышая по интенсивности ядерную метку в эпителии фовеолярного типа и железах пилорического типа, что наблюдалось вне зависимости от типа метаплазии как в случае полной (тип I), так и неполной (тип II и III) кишечной метаплазии (рис. 1, ж—з). По результатам сравнения статистически значимые различия в уровне экспрессии белка PDCD4 обнаружены не были как в группе биоптатов СОЖ при хроническом гастрите, так и в группе дистантной зоны в зависимости от выраженности воспаления (p= 0,85; p= 0,59), атрофии (p=0,46; p=0,66), типа метаплазии (p=0,24; p=0,92).

В тканях аденокарциномы при анализе результатов полуколичественной ИГХ-оценки белка PDCD4 отмечался низкий уровень продукции белка PDCD4 главным образом за счет исчезновения ядерной экспрессии белка. При этом в части случаев сохранялась цитоплазматическая экспрессия белка PDCD4 (рис. 1, в-г). Медиана индекса PDCD4 составила 3 балла (1—4) (см. рис. 2). При сравнении значений индекса PDCD4 в опухолях с низкой и высокой степенью дифференцировки статистически значимые различия не обнаружены (p=0,85).

При анализе результатов ИГХ-исследования в 3-й группе биоптатов СОЖ с наличием дисплазии как в случае низкой, так и высокой степени обнаружено выраженное снижение продукции белка, аналогичное таковому в тканях аденокарциномы желудка (рис. 3), медиана индекса полуколичественной ИГХ-оценки белка PDCD4 составила 3 балла (2—5). Таким образом, характер продукции белка PDCD4 в очагах дисплазии не отличался от такового в тканях аденокарциномы (см. рис. 2).

Рис. 3. Экспрессия белка PDCD4 в биоптатах слизистой оболочки желудка с наличием дисплазии.

а — утрата ядерной экспрессии, низкая цитоплазматическая экспрессия белка PDCD4 в биоптате СОЖ антрального отдела с дисплазией низкой степени (индекс PDCD4 — 2 балла); б — низкая ядерная и цитоплазматическая экспрессия белка PDCD4 в биоптате СОЖ антрального отдела с признаками дисплазии высокой степени при сохранной экспрессии PDCD4 в прилегающих фоновых железах без признаков дисплазии (индекс PDCD4 — 2 балла).

Иммуногистохимическая реакция — ×200 (врезки — ×400).

При сравнении значений индекса PDCD4 между исследуемыми группами выявлены статистически значимые отличия (p=0,00001). При апостериорном попарном сравнении индекс PDCD4 в ткани аденокарциномы и в очагах дисплазии был статистически достоверно ниже такового при сравнении как с группой биоптатов СОЖ при хроническом гастрите, так и с образцами дистантной зоны (p=0,00001). При этом статистически значимых отличий между группой биоптатов СОЖ при хроническом гастрите и дистантной зоной не обнаружено (p=0,48), так же как и в случае сравнения образцов аденокарциномы и биоптатов СОЖ с признаками дисплазии; p=0,43 (см. рис. 2). Показанная в исследовании каскада канцерогенеза плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта аналогичная тенденция нарушения экспрессии PDCD4 при дисплазии эпителия и злокачественной опухоли свидетельствует об универсальности и значимости онкосупрессора PDCD4 в канцерогенезе [20].

Наличие установленного в исследовании статистически значимого снижения ИГХ-экспрессии PDCD4 в тканях аденокарциномы по сравнению с СОЖ вне опухолевого роста представляет интерес в аспекте возможного потенциала в качестве маркера при дифференциальной диагностике неопределенной дисплазии эпителия (реактивные и воспалительные изменения слизистой оболочки) и истинной дисплазии эпителия — категория выраженных предраковых изменений СОЖ.

Оценка потенциала индекса белка PDCD4 в качестве диагностического маркера дисплазии

Для оценки возможного потенциала использования ИГХ-оценки белка PDCD4 в качестве диагностического маркера дисплазии эпителия была построена модель простой логистической регрессии, где независимая переменная — индекс белка PDCD4. Переменная отклика — значение 0 для биоптатов СОЖ при хроническом гастрите и 1 для образцов с наличием дисплазии. Для оценки эффективности модели и определения порога отсечения, свидетельствующего о наличии дисплазии, был проведен ROC-анализ, при этом площадь под кривой AUC составила 0,987 (ДИ=[0,965-0,996]; p=0,0001), порог отсечения, соответствующий максимальной суммарной чувствительности и специфичности индекса PDCD4, — 7 баллов. Чувствительность составила 95%, специфичность — 93% (рис. 4).

Рис. 4. ROC-кривая модели простой логистической регрессии.

Переменная отклика — наличие дисплазии; предикторная переменная — индекс PDCD4; чувствительность — 95%; специфичность — 93%.

Полученные результаты, а также отсутствие изменений в продукции белка PDCD4 в СОЖ при абсолютной и метапластической атрофии (как состояний, ассоциированных с риском возникновения рака желудка), выраженного воспаления и регенераторных изменений эпителия свидетельствуют о специфичности утраты продукции белка PDCD4 только при возникновении истинной дисплазии.

Интерес представляет сопоставление экспрессии miR-21, изученной ранее [21, 22], и белка PDCD4. Так, минимальный уровень экспрессии miR-21 обнаружен в группе биоптатов СОЖ при хроническом гастрите: медиана 42, межквартильный диапазон от 33 до 83 (33—83). В образцах дистантной зоны РЖ уровень относительной экспрессии miR-21 значительно повышен: медиана 158 (105—269). Максимальные значения обнаружены в образцах аденокарциномы желудка: медиана составила 270 (130—385). При сравнении значений уровня экспрессии miR-21 между исследуемыми группами выявлено наличие статистически значимых отличий (p=0,0007). Апостериорное попарное сравнение показало статистически значимое (p=0,0006) повышение уровня miR-21 в тканях СОЖ дистантной зоны опухоли по сравнению с биоптатами СОЖ при хроническом гастрите с сопоставимой гистологической картиной по OLGA-system, но без ассоциации с РЖ. При этом уровень экспрессии белка PDCD4 демонстрирует закономерную инверсию — увеличение экспрессии miR-21 сопровождается утратой продукции белка (рис. 5).

Рис. 5. Распределение значений относительного уровня экспрессии miR-21 в сравнении с индексом белка PDCD4 в исследуемых группах в сопоставлении с каскадом канцерогенеза P. Correa [23].

1 — группа биоптатов СОЖ при хроническом гастрите; 2 — образцы дистантной зоны операционного материала желудка; 3 — группа биоптатов СОЖ с наличием эпителиальной дисплазии; 4 — образцы аденокарциномы желудка.

Таким образом, индекс полуколичественной ИГХ-оценки PDCD4 может быть использован при оценке феномена неопределенной дисплазии: сохранная высокая продукция белка PDCD4 в эпителии СОЖ свидетельствует о реактивных изменениях, связанных с регенераторной пролиферацией, а падение индекса PDCD4 ниже порога отсечения при оценке феномена неопределенной дисплазии СОЖ, вероятно, следует рассматривать как подтверждение наличия дисплазии низкой либо высокой степени. В связи с изложенным оцененный в модели логистической регрессии предиктивный потенциал экспрессии маркера PDCD4 позволяет рассматривать его в качестве диагностического маркера.

Заключение

В тканях аденокарциномы желудка отмечается снижение иммуногистохимической экспрессии PDCD4 преимущественно за счет исчезновения ядерной метки, при этом в СОЖ дистантной зоны сохраняется высокий уровень белка, сопоставимый с уровнем в биоптатах СОЖ при хроническом гастрите, что исключает возможность использование PDCD4 в качестве фактора предикции риска развития аденокарциномы желудка.

Иммуногистохимически идентифицируемое падение продукции белка PDCD4 при дисплазии, аналогичное наблюдаемому в тканях аденокарциномы желудка, а также сохранение высокого уровня продукции белка PDCD4 в образцах дистантной зоны и биоптатах СОЖ при хроническом гастрите вне зависимости от выраженности атрофии и воспаления свидетельствуют о высоком потенциале оценки белка PDCD4 при дифференциальном диагнозе неопределенной и истинной дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания Минздрава России № 124021400033-6. от 14.02.24 г.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Мозговой С.И., Поморгайло Е.Г., Кононов А.В.

Сбор и обработка материала — Рубцов В.А., Мозговой С.И., Шиманская А.Г., Маркелова М.В.

Статистическая обработка данных — Рубцов В.А.

Написание текста — Рубцов В.А., Поморгайло Е.Г.

Редактирование — Поморгайло Е.Г., Мозговой С.И., Кононов А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.