Согласно данным Всемирного агентства по исследованию рака (GLOBOCAN) за 2022 г., рак желудка (РЖ) входит в десятку лидирующих причин онкологической заболеваемости и смертности, занимая 7-е и 6-е места соответственно [1]. Российские статистические данные отличаются от общемировых: по данным МНИОИ им. П.А. Герцена, в России в 2022 г. РЖ занимал 6-е место в структуре заболеваемости и 2-е в структуре смертности [2]. Аналогичные позиции он сохранил и в 2023 г. [3]. В 2022 и 2023 гг. отмечен рост числа зарегистрированных случаев РЖ. При этом среднероссийский показатель его несвоевременной диагностики (III–IV стадия) в 2023 г. составил 57%, а летальность больных в течение 1 года с момента установления диагноза превышает 40%. Радикальное лечение возможно лишь у 18,2% пациентов с впервые выявленным новообразованием [4].

Проблемы терапии РЖ отчасти обусловлены его значительной молекулярной гетерогенностью [5, 6]. Наиболее широко используемыми молекулярными классификациями РЖ являются классификации Атласа генома рака (The Cancer Genome Atlas — TCGA) и Азиатской группы по исследованию рака (Asian Cancer Research Group — ACRG) [7]. Несмотря на различия принципов, положенных в их основу, обе классификации выделяют варианты рака с признаками микросателлитной нестабильности (microsatellite instability — MSI). Даже в первой в истории российской молекулярной классификации РЖ рак с MSI выделен в отдельную группу [8].

В метаанализе 34 исследований, изучающих статус MSI в ассоциации с гистологическим типом опухоли по классификации Lauren, MSI была обнаружена в 10,7% случаев РЖ кишечного типа, в 2,9% рака диффузного типа и в 0,9% смешанного [9]. Взаимосвязь MSI со спорадическими и наследственными формами РЖ также неустойчива: нестабильность отмечается не только при наследственных синдромах, таких как синдром Линча, но и при спорадической форме опухолей [10, 11]. Вместе с тем наличие MSI при РЖ, как и при раке толстой кишки, является благоприятным прогностическим маркером и потенциальной точкой приложения таргетной терапии [6, 12].

Однако формирование MSI, вероятно, может происходить не на этапе состоявшейся опухоли, а на предшествующих этапах канцерогенеза. В отношении РЖ такими этапами выступают ранние и выраженные предраковые поражения — кишечная метаплазия (КМ), атрофия и дисплазия слизистой оболочки желудка (СОЖ) [9, 13, 14]. В соответствии с данными мировых исследований [15, 16] распространенность MSI в очагах КМ варьирует от 3,2 до 63,3%, в фокусах дисплазии эпителия — от 22,4 до 31,3%. Следует отметить, что работы, посвященные выраженным предраковым изменениям (дисплазии (интраэпителиальной неоплазии) эпителия), немногочисленны, и неосвещенным в них остается вопрос наличия или отсутствия MSI в зонах неопределенной дисплазии. Сложность и значимость ее дифференциальной диагностики демонстрируются исследованиями, постулирующими возможность обратного развития дисплазии низкой степени после эрадикации Helicobacter pylori (H. pylori) и проведенного курса лечения [17]. Такие результаты, вероятно, свидетельствуют, что неопределенная дисплазия, связанная с персистирующим воспалением СОЖ и регенераторными изменениями эпителия и, действительно, способная обратиться вспять после их исчезновения, может быть трактована на светооптическом уровне как дисплазия низкой степени, что еще раз подчеркивает сложность ее однозначной квалификации.

Таким образом, оценка микросателлитной нестабильности, экспрессии белков системы MMR представляет большой интерес с точки зрения ее возможного диагностического потенциала при оценке дисплазии СОЖ и предиктивной роли в аспекте прогнозирования риска развития РЖ.

Цель исследования — оценка белков системы MMR и MSI-статуса регенераторных (неопределенная дисплазия) и выраженных предраковых (дисплазия) изменений слизистой оболочки желудка в сопоставлении с раком для определения возможного потенциала в качестве диагностического маркера дисплазии слизистой оболочки желудка.

Материал и методы

Объектом исследования выступил биопсийный и операционный материал СОЖ. В 1-ю группу включили 150 случаев эндоскопического биопсийного исследования СОЖ пациентов с диспептическими жалобами: 43 биоптата с признаками дисплазии низкой степени, 32 — дисплазии высокой степени, 75 — неопределенной дисплазии. На момент проведения биопсийного исследования возраст пациентов (77 женщин, 73 мужчины) варьировал от 28 до 87 лет, медиана 66 лет. В 73% (n=109) случаев биоптаты были получены из СОЖ антрума, в 27% (n=41) — из тела желудка. Во 2-ю группу включили 155 случаев спорадического РЖ. Из каждого резецированного желудка проводили забор 1 образца ткани опухоли. Медиана возраста пациентов (56 женщин, 99 мужчин) на момент проведения операции составила 63 года, минимальное значение — 34 года, максимальное — 82 года.

Гистологическую проводку материала, заливку в парафин, приготовление парафиновых срезов и окраску гематоксилином и эозином проводили по общепринятой методике. Для оценки выраженности воспаления, активности и атрофии в биоптатах СОЖ 1-й группы использовали визуально-аналоговые шкалы Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита OLGA [18]. Детекцию и ранжирование выраженности дисплазии эпителия, определение гистологической формы опухолей желудка проводили в соответствии с критериями «Классификации опухолей системы пищеварения Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)», 5-й пересмотр [19]. Диагностическая категория «неопределенная дисплазия» использовалась при невозможности принятия окончательного решения в отношении наличия/отсутствия дисплазии эпителия СОЖ в связи с регенераторными изменениями, гиперпролиферативной КМ, малым объемом и/или деформацией, фрагментацией биопсийного материала [20].

Биоптаты 1-й группы подвергали гистохимическому исследованию для типирования КМ: обнаружение щеточной каемки с использованием ШИК-реакции (I тип КМ), детекция муцинов бокаловидных клеток, цилиндрических клеток — окраска альциановым синим (II тип КМ), выявления муцинов апикальных отделов цитоплазмы высоких цилиндрических клеток — окраска диамином железа (III тип КМ) [21]. Идентификацию H. pylori в биоптатах проводили с применением окраски 0,1% толуидиновым синим.

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования с использованием метода tissue microarray сформировали тканевые матрицы (мультиблоки), включающие 20 исследуемых образцов и отрицательный внешний контроль (фрагмент микросателлитно-нестабильной ткани аденокарциномы толстой кишки) [22]. ИГХ-исследование проводили на парафиновых срезах с использованием мышиных моноклональных антител (Diagnostic BioSystems, США) к белкам системы MMR: MLH-1 (клон G168—15, разведение 1:50), MSH2 (клон DBM15.82, разведение 1:100), MSH6 (клон 44, 1:50), PMS2 (клон А16—4, готовые к применению), системы детекции PolyVue Plus HRP/DAB (Diagnostic BioSystems, США). Депарафинирование и регидратацию, высокотемпературную демаскировку антигенов с использованием EDTA-буфера (pH 8,0), инкубацию с антителами проводили в соответствии с протоколом производителя. В качестве внутреннего положительного контроля реакции выступали лимфоциты воспалительного инфильтрата. При анализе результатов как случай с сохранной системой MMR (MMR-профицитный — pMMR) расценивали образцы с наличием ядерной экспрессии всех 4 белков системы MMR (MLH1, PMS2, MSH2 и MSH6) в эпителиоцитах, лимфоцитах воспалительного инфильтрата СОЖ независимо от интенсивности окрашивания. При отсутствии ИГХ-экспрессии одного или более белков MMR в ядрах эпителиоцитов и наличии окрашивания в лимфоцитах воспалительного инфильтрата, клетках стромы случай рассматривали как имеющий нарушение системы MMR (MMR-дефицитный — dMMR).

Для диагностики MSI-статуса использовали метод мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на препаратах из 5 микротомных срезов с парафиновых блоков толщиной 4 мкм с предотвращением перекрестной контаминации образцов. В 1-й группе оценку провели в 75 случаях (25 образцов неопределенной дисплазии, 25 — дисплазии низкой степени, 25 — дисплазии высокой степени), во 2-й группе — в 100 образцах. Для исключения мышечной ткани, очагов некроза, обеспечения забора материала для исследования в пределах репрезентативного опухолевого роста применяли ручную методику макродиссекции [23].

Выделение ДНК проводили в режиме ручной пробоподготовки с использованием набора для выделения нуклеиновых кислот ПараМаг с последующей мультиплексной амплификацией выделенной ДНК для получения ДНК-фрагментов микросателлитов (NR-21, NR-24, NR-27, BAT-25, BAT-26). Полученную смесь ампликонов анализировали методом капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500 с полимером POP-7 и 50-сантиметровыми капиллярами. Визуализацию полученных данных проводили с помощью программы GeneMapper, микросателлитные маркеры визуализировали в синем (NR-24, BAT-26) и желтом (NR-27, NR-21, BAT-25) каналах детекции. При этом нестабильность в одном и более маркере рассматривали как наличие микросателлитной нестабильности случая.

Микрофотографии сделаны при помощи камеры AxioCam MRc5, микроскопа Axioscope 40 («Carl Zeiss», Германия). Обработка изображения выполнена с использованием пакета программного обеспечения ZEISS ZEN (Carl Zeiss, Германия).

Статистическую обработку данных выполняли в Microsoft Office Excel (Microsoft, США), пакете Statistica 10.0 (StatSoft, США). Описательная статистика представлена в виде медианы, максимального и минимального значения (количественные данные, распределение, отличающееся от нормального) и процентного соотношения (номинальные данные). Аналитическая статистика проведена с использованием хи-квадрата (χ²) Пирсона, точного критерия Фишера, Манна–Уитни, таблиц сопряженности.

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России (протокол №04 от 24.03.23).

Результаты

В 1-й группе среди биоптатов с признаками дисплазии низкой и высокой степени 58 (77%) случаев соответствовали кишечному фенотипу, 7 (9%) — пилорическому, 9 (13%) — фовеолярному, 1 (1%) — зубчатому. Результаты гистологической оценки образцов первой группы представлены в таблице 1. Выявлена большая частота активного воспаления и наличия H. pylori-колонизации в образцах неопределенной дисплазии в сравнении с подгруппой дисплазии низкой и высокой степени. Выраженность воспаления в целом и локализация биоптатов в антральном отделе/теле желудка не имеют значимого отличия распределения.

Таблица 1. Морфологическая характеристика образцов неопределенной дисплазии в сравнении с подгруппой дисплазии низкой и высокой степени

По результатам гистохимической оценки КМ в образцах, соответствующих неопределенной дисплазии, полная (тип I) КМ выявлена в 39 (52%) случаях, неполная тонкокишечная (тип II) — в 7 (9%), неполная толстокишечная (тип III) — в 3 (4%). Гиперпролиферативная КМ отмечена в 13 образцах.

При оценке гистологической формы опухолей, включенных во 2-ю исследуемую группу, 125 случаев соответствовали критериям аденокарциномы: высокая степень дифференцировки выявлена в 57 образцах, низкая — в 67; в 2 случаях диагностирована аденокарцинома с лимфоидной стромой, в 2 — муцинозная аденокарцинома. Перстневидно-клеточная карцинома обнаружена в 7 случаях, дискогезивная карцинома — в 19.

По результатам ИГХ-оценки белков системы MMR в биоптатах СОЖ 1-й группы с дисплазией низкой и высокой степени дефицит системы MMR (dMMR) обнаружен в 6 (8%) случаях, в том числе 4 при дисплазии высокой степени и 2 при низкой. Все выявленные случаи dMMR (MSI) соответствовали кишечному фенотипу дисплазии по классификации ВОЗ 2019 [19]. При этом наиболее часто (в 3 случаях) отмечено отсутствие белков пары MLH1/PMS2 (рис. 1, 2), реже (в 2 случаях) — утрата экспрессии белков MSH2/MSH6. В 1 случае обнаружено сочетание отсутствия экспрессии белков MLH1/PMS2 и изолированной утраты MSH6 при сохранной метке белка MSH2.

Рис. 1. Оценка экспрессии белков системы MMR в очаге эпителиальной дисплазии высокой степени, биоптат слизистой оболочки антрального отдела желудка.

а — плотное расположение желез, атипичные клетки в фовеолярной зоне и железах, расположенных в поверхностных и глубоких отделах собственной пластинки; б — полиморфные клетки с крупными ядрами, утратившими полярность; в — MSH2, сохранная ядерная экспрессия белка; г — MSH6, сохранная ядерная экспрессия белка; д — MLH1, утрата экспрессии белка; е — PMS2, утрата экспрессии белка.

а, б — окраска гематоксилином и эозином; в–е — иммуногистохимическая реакция; а — ×200, б — ×400, в–е — ×200 (врезка ×400).

Рис. 2. Оценка экспрессии белков системы MMR в очаге эпителиальной дисплазии низкой степени, биоптат слизистой оболочки угла желудка.

а — фокус атипичных желез неправильных очертаний; б — клетки с крупными умеренно гиперхромными, удлиненными ядрами, расположенными базально, с признаками псевдостратификации, снижена продукция слизи; в — MSH2, сохранная ядерная экспрессия белка; г — MSH6, сохранная ядерная экспрессия белка; д — MLH1, утрата экспрессии белка; е — PMS2, утрата экспрессии белка.

а, б — окраска гематоксилином и эозином; в–е — иммуногистохимическая реакция; а — ×200, б — ×400, в–е — ×200 (врезка ×400).

При дисплазии низкой и высокой степени оценку MSI методом ПЦР выполнили в 50 случаях. Валидные результаты получили для 46 образцов, среди которых выявили 3 (6,5%). При этом в 2 случаях MSI определялась в биоптатах с дисплазией низкой степени, в 1 — в образце с дисплазией высокой степени.

При сопоставлении результатов ИГХ-исследования и ПЦР-оценки микросателлитной нестабильности обнаружено соответствие между случаями dMMR и MSI. При сравнении частоты встречаемости dMMR (MSI) при дисплазии высокой и низкой степени достоверных различий не обнаружено (p=0,39 и p=0,56 соответственно). Также не выявлено зависимости распространенности dMMR (MSI) от пола пациентов (p=0,76 и p=0,54). Однако микросателлитно-нестабильные случаи статистически достоверно чаще обнаружены у пациентов более старшего возраста (медиана 76 лет; p=0,01) в сравнении со случаями pMMR (MSS) (медиана 68 лет; p=0,027).

Степень воспалительной инфильтрации, активности, частота H. pylori-колонизации статистически не отличались в СОЖ с dMMR в сравнении с выборкой образцов с дисплазией низкой/высокой степени в целом (p=0,27, p=0,29 и p=0,65 соответственно).

При неопределенной дисплазии отмечена pMMR по результатам ИГХ исследования и MSS на основании ПЦР во всех случаях (рис. 3).

Рис. 3. Оценка экспрессии белков системы MMR в очаге неопределенной эпителиальной дисплазии, биоптат слизистой оболочки антрального отдела желудка.

а — тотальное замещение эпителием кишечного типа, удлиненные валики в фовеолярной зоне и глубоких отделах желез, много клеток с крупными гиперхромными ядрами, приводящими к утрате вертикального градиента дифференцировки; б — ядра клеток умеренно увеличены, располагаются вдоль базальной мембраны, продукция слизи сохранена; в — MSH2, сохранная ядерная экспрессия белка; г — MSH6, сохранная ядерная экспрессия белка; д — MLH1, сохранная ядерная экспрессия белка; е — PMS2, сохранная ядерная экспрессия белка.

а, б — окраска гематоксилином и эозином; в–е — иммуногистохимическая реакция; а — ×200, б — ×400, в–е — ×200 (врезка ×400).

При оценке ИГХ-экспрессии белков системы MMR в образцах РЖ выявлено 18 (12%) MMR-дефицитных случаев. Преимущественно (в 12 случаях) отмечена утрата экспрессии в паре белков MLH1/PMS2, несколько реже (6 случаев) — в паре MSH2/MSH6, в 3 случаях выявлена изолированная утрата белка MSH6. В 1 случае обнаружено сочетание отсутствия экспрессии белков MLH1/PMS2 и изолированной утраты MSH6 при сохранной метке белка MSH2. Все установленные случаи dMMR гистологически соответствовали высоко- либо низкодифференцированной тубулярной аденокарциноме (рис. 4).

Рис. 4. Оценка экспрессии белков системы MMR в высокодифференцированной тубулярной аденокарциноме.

а — высокодифференцированная тубулярная аденокарцинома, почкующиеся и сливающиеся железы различной формы и величины; б — выраженный клеточный и ядерный полиморфизм; в — MSH2, сохранная ядерная экспрессия белка; г — MSH6, сохранная ядерная экспрессия белка; д — MLH1, утрата экспрессии белка; е — PMS2, утрата экспрессии белка.

а, б — окраска гематоксилином и эозином; в–е — иммуногистохимическая реакция; а — ×200, б — ×400, в–е — ×200 (врезка ×400).

В группе РЖ из 100 образцов, подвергнутых ПЦР-оценке MSI-статуса, валидные результаты получены в 96 случаях. Обнаружено 10 (10%) образцов, соответствующих MSI (рис. 5). При сопоставлении с результатами ИГХ-исследования во всех выявленных образцах dMMR установлена микросателлитная нестабильность, за исключением 3 случаев изолированной утраты белка MSH6, которые продемонстрировали MSS.

Рис. 5. Сопоставление результатов оценки MSI-статуса методом ПЦР с иммуногистохимической оценкой экспрессии белков системы MMR. Демонстрация случая отсутствия микросателлитной нестабильности в сочетании с изолированной утратой экспрессии белка MSH6.

а — нормальное распределение пиков маркеров NR-21, NR-24, NR-27, BAT-25, BAT-26; б — сохранная ядерная экспрессия белка MSH2, в — утрата ядерной экспрессии белка MSH6; б, в — ×400.

При анализе распределения случаи dMMR (MSI) чаще соответствовали высокой степени дифференцировки (12 случаев dMMR и 7 MSI) в сравнении с низкодифференцированными аденокарциномами (6 случаев dMMR и 3 MSI), однако при анализе подгрупп статистически достоверных различий распределения в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы не обнаружено (p=0,074 и p=0,14 соответственно). При сравнении частоты встречаемости dMMR (MSI) в зависимости от пола и возраста пациентов достоверных различий не выявлено (p=0,8 и p=0,53 соответственно).

При проведении сравнения распределения случаев dMMR между подгруппой дисплазии низкой/высокой степени и группой образцов РЖ достоверные отличия отсутствуют, что можно рассматривать как подтверждение гипотезы об «опухолевом поле», где реализуется канцерогенез одного молекулярного пути (табл. 2).

Таблица 2. Сопоставление распределения MMR-статуса при дисплазии низкой/высокой степени и раке желудка

Интерес также представляет сравнение распределения MMR-статуса между случаями дисплазии низкой/высокой степени и неопределенной, по результатам которого dMMR статистически достоверно чаще встречалась при истинных неопластических изменениях в сравнении с неопределенной дисплазией (табл. 3).

Таблица 3. Сопоставление распределения MMR-статуса при неопределенной дисплазии и дисплазии низкой/высокой степени

Обсуждение

При анализе сопоставимости исследуемых групп по основным клинико-морфологическими характеристикам обнаружено преобладание мужчин в группе с состоявшимся РЖ по сравнению с группой дисплазии СОЖ, что закономерно, исходя из превалирования мужчин в структуре онкологической заболеваемости [3]. При этом хотя микросателлитно-нестабильные опухоли, по данным литературы [24, 25], чаще встречаются у женщин, в рамках проведенного исследования не обнаружено достоверной связи между полом пациентов и частотой развития dMMR (MSI) как при РЖ, так и при дисплазии СОЖ. Схожесть клинических и морфологических особенностей выборок 1-й и 2-й исследуемых групп не позволяет разделить их на группы высокого и низкого риска развития РЖ на основании классических систем, основанных на оценке наличия и выраженности атрофии и КМ. Это в свою очередь позволяет утверждать, что различие в распределении MMR-статуса связанно именно с ассоциацией образцов группы дистантной зоны с аденокарциномой и более высоким риском развития РЖ.

Несмотря на имеющиеся в публикациях [26, 27] данные о частом обнаружении MSI при муцинозном варианте аденокарциномы и аденокарциноме с лимфоидной стромой, в нашей выборке все случаи данных гистологических вариантов были микросателлитно-стабильными, что можно объяснить их небольшой долей, составляющей 2,5% от общего числа исследованных образцов. Вместе с тем преобладание MSI в РЖ кишечного типа (аденокарцинома) и отсутствие ее в дискогезивных карциномах соответствует данным литературы [7, 24, 28] о распространенности микросателлитно-нестабильных опухолей.

Наличие в группе РЖ 3 случаев с дефицитом системы MMR (dMMR), выявленным при ИГХ-исследовании, но микросателлитно-стабильных (MSS) по данным ПЦР, обусловлено изолированной утратой белка MSH6 (рис. 5). В отдельных публикациях описано его изолированное выпадение, не приводящее к дефициту функции системы MMR за счет замещения их функций другими белками системы и соответственно не сопровождающееся формированием микросателлитных повторов [29, 30], что сопоставимо с полученными результатами.

Обнаружение случаев MSI при дисплазии СОЖ низкой и высокой степени говорит о вероятном возникновении MSI на ранних этапах каскада канцерогенеза. При этом MSI сопровождает не все случаи «истинной» дисплазии и, по данным проведенного исследования, характеризуется сравнительно небольшой распространенностью. Исходя из этого, отсутствие дефицита системы MMR не может с высокой диагностической точностью указывать на отсутствие неопластической трансформации СОЖ, однако обнаружение MSI может с высокой степенью уверенности исключать диагноз неопределенной дисплазии.

Заключение

Обнаружение случаев с микросателлитной нестабильностью как при высокой, так и низкой степени дисплазии слизистой оболочки желудка говорит об ее вероятном возникновении на ранних этапах каскада канцерогенеза и может указывать на наличие потенциала исследования MMR-статуса в отношении оценки риска развития рака желудка, ассоциированного с микросателлитной нестабильностью. При этом прогностическая ценность исследования статуса системы MMR все еще недостаточно изучена и требует дополнительных исследований.

Отсутствие микросателлитной нестабильности в случаях неопределенной дисплазии указывает на возможность применения оценки MMR-статуса в комплексном подходе к дифференциальной диагностике регенераторных, реактивных изменений слизистой оболочки желудка (неопределенная дисплазия) и дисплазии низкой и высокой степени. Ее обнаружение может свидетельствовать о формировании в исследуемом случае истинно неопластических, а не регенераторных изменений и, вероятно, указывает на необходимость повторного биопсийного исследования с целью исключения дисплазии низкой либо высокой степени.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда «Микросателлитная нестабильность в слизистой оболочке желудка при ранних и выраженных предраковых изменениях как молекулярно-генетическая основа персонифицированной оценки риска развития рака желудка», № 23-25-10036 от 20.04.23, соглашение с Министерством промышленности и научно-технического развития Омской области № 33-с от 19.06.23.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Рубцов В.А., Поморгайло Е.Г., Кононов А.В.

Сбор и обработка материала — Рубцов В.А., Парыгина М.Н., Демидова Е.В., Мозговой С.И., Шиманская А.Г., Маркелова М.В.

Статистическая обработка данных — Рубцов В.А., Демидова Е.В.

Написание текста — Рубцов В.А., Парыгина М.Н., Поморгайло Е.Г.

Редактирование — Парыгина М.Н., Мозговой С.И., Шиманская А.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.