Муцины (от лат. Mucus — слизь), мукопротеины — семейство высокомолекулярных О-гликозилированных протеинов (2—50 MDa), содержащих кислые полисахариды [1], которые формируют сложную полимерную сеть на поверхности слизистых оболочек, ответственную за их увлажнение и защиту [2]. Муцины играют существенную защитную роль, покрывая слизистые оболочки и формируя физический, химический и иммунологический барьер между организмом и внешней средой, они являются первым барьером на пути бактериальной инфекции [3]. Строение муцинов варьирует в разных органах [4]. В организме человека известно как минимум 20 генов, отвечающих за синтез муцинов, среди них: MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19 и MUC20 [5].

В норме клетки слизистой оболочки желудка продуцируют MUC1, MUC5AC, MUC6. Экспрессия MUC1 наблюдается в слизистых клетках покровно-ямочного эпителия антрального отдела желудка, очагово — в эпителиоцитах желез фундального и антрального отделов. MUC5AC интенсивно вырабатывается фовеолярным эпителием всех отделов желудка. В очагах кишечной метаплазии появляется экспрессия MUC2, который в норме синтезируется бокаловидными клетками кишечника.

Изменения экспрессии муцинов описаны во многих злокачественных опухолях, а также при предопухолевых изменениях [6—10]. В желудке данные изменения были впервые описаны P. Correa и соавт. в очагах кишечной метаплазии. Кишечная метаплазия характеризуется заменой желудочного эпителия на эпителий кишечного типа с соответствующей инактивацией генов MUC1, MUC5AC и MUC6, характерных для нормальной слизистой оболочки желудка, и экспрессией MUC2, который в норме не экспрессируется слизистой оболочкой желудка [11]. Имеются данные о связи аномальной экспрессии муцинов и агрессивного поведения различных опухолей [12—16].

В последнее время авторы [17—24] начали подразделять раки желудка на различные группы в зависимости от экспрессии муцинов и других маркеров кишечной дифференцировки. Чаще всего выделяют кишечный фенотип (положительная экспрессия MUC2 и/или CD10), желудочный (положительная экспрессия MUC5AC и/или MUC6), смешанный (положительная экспрессия как MUC2 и/или CD10, так и MUC5AC и/или MUC6), а также null-фенотип (MUC2-, CD10-, MUC5AC- и MUC6-отрицательные). Существуют и другие попытки классификации рака желудка по признаку наличия желудочной или кишечной дифференцировки. A. Kabashima и соавт. [25] подразделяют опухоли на 4 фенотипа: полный кишечный, неполный кишечный, желудочный и неклассифицируемый. Y. Egashira и соавт. [26] классифицируют рак желудка на три фенотипа: желудочный, кишечный и смешанный.

Корреляции MUC-фенотипов рака желудка с такими клинико-морфологическими характеристиками, как пол, возраст, локализация и макроскопическая форма, не выявлены [27]. Показано, что опухоли смешанного фенотипа чаще (в 80% случаев) рецидивируют при эндоскопической мукозальной резекции, а новообразования кишечного фенотипа значимо реже (в 76% случаев рецидив отсутствует) [17]. По данным K. Kerckhoffs и соавт., среди перстневидноклеточных раков опухоли с кишечным и смешанным фенотипами характеризуются большими размерами и глубиной инвазии, наличием метастазов в лимфатических узлах и лимфоваскулярной инвазией [24]. При этом опухоли с желудочным фенотипом значимо отличаются от остальных и имеют меньшие размеры, более низкую частоту лимфогенного метастазирования и сосудистой инвазии. Схожие результаты получили D. Kim и соавт. [18] на выборке из 412 пациентов: желудочный фенотип характеризовался значимо меньшими размерами, более ранними стадиями болезни, при нем реже встречались эмболы в лимфатических сосудах. Пациенты с ранними стадиями рака желудка, который принадлежал к желудочному фенотипу, имели значительно лучшую 5-летнюю выживаемость по сравнению с лицами с остальными подтипами. У пациентов с продвинутыми стадиями не было обнаружено связи фенотипа и прогноза.

На основании того, что среди ранних раков желудка чаще встречаются опухоли с желудочным фенотипом, а среди опухолей на продвинутых стадиях — кишечный фенотип, некоторые авторы отмечают возможность смены фенотипа при прогрессировании опухолей и его вероятное происхождение из фовеолярных клеток эпителия желудка, а не из очагов кишечной метаплазии [28, 29].

Желудочный и кишечный фенотипы частично соотносятся с подтипами рака желудка, выделенными TCGA [30]. MSI и EVB-ассоциированный подтипы чаще соответствуют желудочному фенотипу, однако характерный профиль экспрессии для геномно-стабильного и хромосомно-нестабильного подтипов пока не ясен [28].

Таким образом, в литературе имеются противоречивые и скудные данные, касающиеся не только связи различных MUC-фенотипов рака желудка с клинико-морфологическими характеристиками, но и по выживаемости пациентов.

Цель данной работы — уточнение связи MUC-фенотипов рака желудка с клинико-морфологическими параметрами, а также их прогностической ценности.

Материал и методы

В исследовании использованы образцы операционного материала от 310 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка, не получавших в предоперационном периоде химио- или лучевую терапию. Критериями исключения были карцинома in situ, недостаточное количество материала в парафиновых блоках, верифицированный нейроэндокринный рак, лимфома желудка или гастроинтестинальная стромальная опухоль желудка. Возраст пациентов варьировал от 22 до 85 лет (средний — 63 года). Медиана наблюдения за пациентами составила 83 мес.

Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли с помощью системы детекции UltraVision Quanto («Thermo Fisher Scientific», США) согласно протоколу производителя в иммуностейнере Autostainer 480S («Thermo Fisher Scientific», США). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов выполняли при помощи буфера Thermo Dewax and HIER Bufer H (pH 9,0) при температуре 95—98 °C в течение 20 мин в модуле предобработки (PT-Module, «Thermo Fisher Scientific», США). В работе использованы следующие моноклональные антитела Dako/Agilent Technologies, США: MUC2 (клон CCP58, разведение RTU), MUC5AC (клон CLH2, RTU), CD10 (клон 56C6, разведение RTU). Время инкубации антител составляло 20—30 мин в соответствии с инструкцией производителя.

Реакция с маркерами оценивалась по 2-балльной шкале: 0 — отрицательная или положительная менее чем в 10% опухолевых клеток, 1 — положительная более чем в 10% опухолевых клеток.

В зависимости от экспрессии MUC2, CD10 и MUC5AC все опухоли были разделены на 4 группы (MUC-статуса):

— с экспрессией только маркеров кишечной дифференцировки (MUC2 и/или CD10, статус MUC-I);

— с экспрессией маркера желудочной дифференцировки (MUC5AC, статус MUC-G);

— с экспрессией MUC2, CD10 и MUC5AC (смешанные, статус MUC-mix);

— в которых отсутствует экспрессия всех маркеров (статус MUC-null).

Далее проведено сопоставление полученных групп с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка. Для оценки дистальной/проксимальной локализации опухолей 1 случай из выборки был исключен (наличие опухоли в культе ранее оперированного желудка), n=309. Степень дифференцировки опухолей оценивали для тубулярного, папиллярного и смешанного гистологических типов рака (n=222). При анализе размеров опухолей исключены 8 наблюдений (n=302), где ввиду диффузно-инфильтративного характера роста опухолей не удалось точно провести измерение размеров опухоли. При анализе подтипов по P. Lauren из выборки исключен 1 случай аденоплоскоклеточного рака, n=309.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием анализа таблиц сопряженности, критерия χ², непараметрических критериев для парного и множественного сравнений, анализа выживаемости по Каплану—Мейеру, логрангового критерия, многофакторного анализа выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса (Statistica 10, «StatSoft, Inc.», США).

Результаты и обсуждение

Исследовано 310 образцов операционного материала рака желудка. Статус MUC-I (рис. 1, а, в, д, ж) выявлен в 72 (23,2%) случаях из 310, MUC-G (рис. 1, б, г, е, з) — в 93 (30%) из 310, MUC-mix (рис. 2, а, в, д, ж) — в 83 (26,8%) из 310, MUC-null (рис. 2, б, г, е, з) — в 62 (20%) из 310.

Рис. 1. Рак желудка со статусами MUC-I и MUC-G.

а, в, д, ж — тубулярная аденокарцинома; б, г, е, з — дискогезивная карцинома; в — экспрессия MUC2 более чем в 50% клеток опухоли; г — отсутствие экспрессии MUC2; д, е — отсутствие экспрессии CD10; ж — отсутствие экспрессии MUC5AC; з — экспрессия MUC5AC более чем в 50% клеток опухоли. а, б — окраска гематоксилином и эозином; в—з — иммуногистохимическая реакция, об. ×20.

Рис. 2. Тубулярные аденокарциномы желудка со статусами MUC-mix и MUC-null.

а, б — тубулярные аденокарциномы желудка; в — экспрессия MUC2 более чем в 50% клеток опухоли; г — отсутствие экспрессии MUC2; д, е — отсутствие экспрессии CD10; ж — экспрессия MUC5AC более чем в 50% клеток опухоли; з — отсутствие экспрессии MUC5AC. а, б — окраска гематоксилином и эозином; иммуногистохимическая реакция, об. ×20.

При анализе распределения по полу значимых различий между группами не обнаружено (p=0,155) (рис. 3, а). При анализе возрастных характеристик пациентов (табл. 1) наибольший средний возраст выявлен в группе со статусом MUC-null (рис. 3, б), однако статистически значимых различий между группами не выявлено (p=0,722).

Таблица 1. Возрастные характеристики пациентов в группах с различными MUC-статусами опухоли

Рис. 3. Структурные диаграммы и диаграммы размаха для пациентов в группах с различным статусом экспрессии маркеров желудочной и кишечной дифференцировки.

а — структурная диаграмма распределения по полу; б — диаграмма размаха распределения по возрасту; в — структурная диаграмма распределения дистальной/проксимальной локализации опухолей; г — структурная диаграмма распределения по макроскопической форме опухолей; д — диаграмма размаха распределения по размеру опухолей; е — структурная диаграмма распределения по гистологическому типу опухолей.

Рис. 3. Структурные диаграммы и диаграммы размаха для пациентов в группах с различным статусом экспрессии маркеров желудочной и кишечной дифференцировки (окончание).

ж — структурная диаграмма распределения по наличию/отсутствию перстневидных клеток в опухолях; з — структурная диаграмма распределения по клиническим стадиям; и — структурная диаграмма распределения по гистологическому типу P. Lauren.

Далее оценивали связь экспрессии MUC-статуса с клинико-морфологическими параметрами (табл. 2).

Таблица 2. Клинико-морфологические характеристики пациентов в группах с различными MUC-статусами опухоли

При оценке локализации опухолей в желудке (рис. 3, в) в группе со статусом MUC-I 65,3% составили опухоли с проксимальной локализацией, 33,3% — с дистальной и 1,4% — с субтотальной/тотальной. В группах со статусами MUC-mix и MUC-null субтотальные/тотальные опухоли составили 16,9 и 13,1% соответственно. По преобладанию субтотальных/тотальных опухолей группы MUC-null и MUC-mix значимо отличаются от группы MUC-I (p=0,022 и p=0,007 соответственно), где таких опухолей значимо меньше. Отмечена большая доля наблюдений с проксимальной локализацией в группе со статусом MUC-I, однако это различие статистически недостоверно.

При оценке макроскопической формы опухолей (рис. 3, г) отмечена меньшая доля опухолей с диффузно-инфильтративной формой роста в группе со статусом MUC-I, однако различия незначимы (p=0,314).

При оценке размеров опухолей (рис. 3, д) в группе со статусом MUC-I преобладали небольшие (<8 см) новообразования — 63 (90%) наблюдения. В группе со статусом MUC-G наблюдалось другое распределение: 78,9% — опухоли размером <8 см, 21,1% — >8 см. В группах со статусом MUC-mix и MUC-null доля крупных опухолей была больше (23,8 и 22,6% соответственно), различия недостоверны (p=0,669).

Анализ распределения опухолей по гистологическому типу согласно классификации ВОЗ 2019 г. (рис. 3, е) выявил, что тубулярный гистологический тип встретился в группе MUC-I в 62,5% случаев, MUC-G в 51,6%, MUC-mix в 43,4%, MUC-null в 77,5%. Дискогезивный тип выявлен в группе MUC-I в 18,1% случаев, MUC-G в 33,3%, MUC-mix в 26,5%, MUC-null в 14,5%. Таким образом, в группе со статусом MUC-null присутствует наибольшая доля случаев с тубулярным гистологическим типом; в группе со статусом MUC-G — наибольшая доля случаев с дискогезивным гистологическим типом; в группе со статусом MUC-mix — наименьшая доля тубулярных опухолей и наибольшая доля муцинозного гистологического типа. В свою очередь муцинозный гистологический тип выявлен только в группах со статусом MUC-I и MUC-mix. При статистическом анализе в группе со статусом MUC-null значимо чаще встречаются опухоли тубулярного гистологического типа (по сравнению с группами MUC-G; p=0,004 и MUC-mix; p=0,000) и значительно реже — смешанные карциномы (по сравнению с группами MUC-G; p=0,026 и MUC-mix; p=0,006). В группе со статусом MUC-I существенно чаще преобладает тубулярный гистологический тип по сравнению с группой со статусом MUC-mix (p=0,035).

При сравнении групп по наличию перстневидных клеток (рис. 3, ж) в группах со статусом MUC-mix и MUC-G количество случаев с выявленными перстневидными клетками в опухолях было максимальным: 60,2 и 49,5% соответственно. В группе со статусом MUC-null доля таких случаев была наименьшей — 29%. Таким образом, в группе со статусом MUC-null значимо меньше случаев с наличием перстневидных клеток в опухоли (p=0,000).

Распределение опухолей по клиническим стадиям (рис. 3, з) выявило значимые различия между группами (p=0,025), однако при более детальной разбивке по III стадии обнаружено, что количество наблюдений со стадией IIIA в группе со статусом MUC-G составляет лишь 6,5% против 18,1% в группе MUC-I, 19,3% в группе MUC-mix и 21% в группе MUC-null. Данное различие было статистически значимым в парах MUC-G—MUC-I (p=0,041), MUC-G—MUC-mix (p=0,031) и MUC-G—MUC-null (p=0,031). Обнаруженные различия влияют на значение общего p-критерия для всех стадий (p=0,025) и формально можно сделать вывод о наличии существенной разницы между группами, однако это различие не имеет клинического значения.

При сравнении групп по подтипам опухолей P. Lauren выявлено некоторое преобладание кишечного подтипа в группе со статусом MUC-I по сравнению с другими группами (рис. 3, и), однако это различие незначимо (p=0,062). Также обращает на себя внимание наименьшая доля диффузного подтипа в группе со статусом MUC-null по сравнению с другими группами.

По другим клинико-морфологическим параметрам (степень дифференцировки опухолей, наличие эмболов в кровеносных и лимфатических сосудах, глубина инвазии, наличие метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов) различий не выявлено.

Учитывая данные литературы о благоприятных клинико-морфологических характеристиках подтипа MUC-G в перстневидноклеточных карциномах, был проведен отдельный анализ дискогезивных карцином из нашей выборки (75 наблюдений). Среди всех клинико-морфологических параметров выявлена лишь значимая связь с локализацией опухоли: дискогезивные раки со статусом MUC-I имели почти исключительно проксимальную локализацию в желудке, p=0,003 (рис. 4, а). Других значимых отличий между опухолями с различными MUC-статусами не получено, хотя отмечается большее количество случаев без метастазов в лимфатических узлах в группе MUC-G, что соответствует данным литературы (рис. 4, б). Однако в этой же группе выявлено большое количество наблюдений с множественными метастазами в лимфатических узлах (N3a). Таким образом, значимых различий по наличию метастазов в лимфатических узлах не обнаружено (p=0,378).

Рис. 4. Структурные диаграммы для пациентов с дискогезивными раками в группах с различным статусом экспрессии маркеров желудочной и кишечной дифференцировки.

а — структурная диаграмма распределения дистальной/проксимальной локализации опухолей; б — структурная диаграмма распределения по количеству метастазов в регионарных лимфатических узлах.

Данные по выживаемости получены для 259 пациентов из общей выборки (310 наблюдений) (табл. 3, 4). Анализ общей 5-летней выживаемости пациентов не выявил значимых различий между группами — p-значение логрангового критерия составило 0,172 (рис. 5, а, б). Многофакторный анализ выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса показал, что MUC-статус не является значимым прогностическим признаком (HR=1,662; ДИ: 0,919—3,007; p=0,093).

Таблица 3. Статус выживаемости пациентов в группах с различными MUC-статусами опухоли

Таблица 4. Средние значения и медианы времени выживания пациентов в группах с различными MUC-статусами опухоли

Рис. 5. Анализ выживаемости пациентов с раком желудка для групп с различными MUC-статусами опухоли.

а — структурная диаграмма распределения по статусу выживаемости пациентов из общей выборки; б — функции выживания (кривая Каплана—Мейера) пациентов из общей выборки; в — структурная диаграмма распределения по статусу выживаемости пациентов с дискогезивными карциномами; г — функции выживания (кривая Каплана—Мейера) пациентов с дискогезивными карциномами.

Интересные данные касаются анализа выживаемости пациентов с дискогезивными раками (данные по выживаемости получены для 63 пациентов из 75). Наибольшая общая выживаемость наблюдалась в группе со статусом MUC-G (46,2%), а наименьшая — MUC-mix (5,9%). При анализе различий по статусу выживаемости (жив/мертв) только между указанными группами обнаружено значимое различие (p=0,030) (рис. 5, в). Однако при анализе методом Каплана—Мейера выявлено, что наибольшее значение медианы выживаемости (68 мес) характерно для группы со статусом MUC-null (см. табл. 4, рис. 5, г), а наименьшее — MUC-mix (11 мес); p-значение логрангового критерия составило 0,022.

Таким образом, детальный анализ клинико-морфологических характеристик выявил, что по преобладанию субтотальных/тотальных опухолей группы MUC-null и MUC-mix значимо отличаются от группы MUC-I (p=0,022 и p=0,007 соответственно), где таких опухолей значительно меньше. В группе со статусом MUC-null существенно чаще встречаются опухоли тубулярного гистологического типа и реже — смешанные карциномы по сравнению с группами со статусами MUC-G (p=0,026) и MUC-mix (p=0,006), а также в группе со статусом MUC-null значимо меньше случаев с наличием перстневидных клеток в опухоли (p=0,000). Других существенных различий между группами по клинико-морфологическим параметрам не выявлено. Результаты изучения дискогезивного гистологического типа не подтвердили данные литературы о меньших размерах опухолей, более низкой частоте лимфогенного метастазирования и сосудистой инвазии для статуса MUC-G, но выявили существенно более частую проксимальную локализацию опухолей со статусом MUC-I (p=0,003).

При анализе общей выборки наибольшая общая выживаемость выявлена в группе со статусом MUC-G (48,7%), а наименьшая — MUC-mix (26,1%), при этом статистически значимых различий в выживаемости не обнаружено (p=0,172). Различия в выживаемости обнаружены только при отдельном рассмотрении группы дискогезивных раков, где существенно лучшая выживаемость зафиксирована для группы со статусом MUC-null, а худшая —MUC-mix (p=0,022).

Заключение

В общей выборке пациентов выделенные группы значимо не различались по возрасту, полу, макроскопической форме опухолей, сосудистой инвазии, подтипу по классификации P. Lauren. Отмечены попарные различия в локализации опухолей (группы MUC-null и MUC-mix значительно чаще характеризуются субототальной/тотальной локализацией в желудке) и принадлежности к отдельным гистологическим типам (в группах со статусами MUC-null и MUC-I существенно чаще встречаются опухоли тубулярного гистологического типа по сравнению с группой MUC-mix). При выборочном анализе дискогезивных карцином желудка опухоли со статусом MUC-I имели почти исключительно проксимальную локализацию (p=0,003).

В общей выборке (310 пациентов) анализ общей 5-летней выживаемости не выявил значимых различий между группами (p=0,172). Однако при рассмотрении дискогезивных карцином значительные различия в выживаемости обнаружены для опухолей со статусами MUC-null и MUC-mix. Таким образом, разделение раков желудка в зависимости от MUC-статуса может иметь лишь ограниченную предиктивную и прогностическую ценность при отдельных гистологических формах рака.

Работа выполнена в рамках госзадания (номер ЦИТИС 121061800151-2) ФГБОУ ВПО «МГУ им. М.В. Ломоносова» и на оборудовании, приобретенном по программе развития ФГБОУ ВПО «МГУ им. М.В. Ломоносова».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В. Данилова, П.Г. Мальков

Сбор и обработка материала — Н.В. Данилова, А.В. Чайка, В.М. Хомяков, Т.Н. Сотникова

Статистическая обработка данных — Н.В. Данилова

Написание текста — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова

Редактирование — Ю.Ю. Андреева, П.Г. Мальков

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.