Определение суррогатного биологического подтипа опухоли на основе результатов иммуногистохимического (ИГХ) исследования статуса рецепторов эстрогенов (РЭ), рецепторов прогестерона (РП), онкобелка Her2/neu и маркера пролиферации Ki-67 играет существенную роль в выборе адекватной терапевтической тактики при лечении больных раком молочной железы (РМЖ). При этом дискордантность статуса каждого из биомаркеров в клетках первичной опухоли и метастазов (как отдаленных, так и регионарных) может приводить к неполному ответу опухоли на терапию, назначенную на основании результатов исследования первичной опухоли [1—4]. История исследования данной формы гетерогенности опухолей при РМЖ насчитывает более 35 лет, и к настоящему времени в научной среде сложилось единое мнение о биологической, а не артифициальной природе подобных различий [2, 5—8]. Публикуются результаты исследований, демонстрирующие повышение безрецидивной и общей выживаемости пациенток после генерализации РМЖ, которым была назначена противоопухолевая терапия с учетом результатов повторного тестирования статуса РЭ, РП, Her2/neu и Ki-67 в клетках отдаленных метастазов [1]. По данным разных авторов, частота случаев с дискордантным статусом РЭ составляет от 3 до 62%, РП — от 12 до 54%, Her2/neu — от 0 до 24%, Ki-67 — от 4 до 39% [3, 9—14].

В большинстве публикаций проводится оценка влияния ретестирования статуса ключевых ИГХ-маркеров в клетках отдаленных метастазов на эффект терапии. При этом опухолевая гетерогенность РМЖ, проявляющаяся в дискордантности статуса РЭ, РП, Her2/neu и Ki-67 в клетках первичной опухоли и регионарных метастазов также заслуживает внимания, поскольку существование клонов клеток, нечувствительных к назначенной терапии, может привести к снижению ее эффективности [2].

Цель исследования — оценить частоту случаев с дискордантным статусом РЭ, РП, Her2/neu и Ki-67 клеток первичной опухоли и регионарных метастазов при РМЖ, а также выявить закономерности в изменении экспрессии данных маркеров при метастазировании.

Материал и методы

В исследование вошли 104 пациентки в соответствии со следующими критериями включения: диагноз инвазивного РМЖ неспецифического типа; наличие метастатичес-кого поражения регионарных лимфатических узлов; проведение мастэктомии с удалением регионарных лимфатических узлов. Критерием исключения являлось проведение неоадъювантной терапии. Возраст пациенток на момент включения в исследование составлял от 33 до 83 лет, медиана возраста — 63 года, верхний квартиль — 70 лет, нижний квартиль — 55 лет, что позволяет косвенно судить о менструальном статусе.

Фиксированный формалином, залитый в парафиновые блоки материал первичной опухоли и регионарных лимфатических узлов исследовали гистологическим методом, после чего материал одного из блоков первичной опухоли и всех блоков, содержащих пораженные метастазами регионарные лимфатические узлы, исследовали ИГХ-методом. Для этого срезы толщиной 5 мкм окрашивали моноклональными антителами к рецепторам эстрогенов (клон 1D5, Dako, Дания), рецепторам прогестерона (клон PgR636, Dako, Дания), Ki-67 (клон MIB-1, Dako, Дания) с использованием автостейнера Dako Link (система визуализации — Dako EnVision Flex), а также моноклональными антителами к Her2/neu (клон 4B5, Ventana, США) при помощи автостейнера Ventana Benchmark GX (система визуализации — Ventana UltraView Universal DAB). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.

Для оценки результатов окрашивания опухолевых клеток антителами к стероидным гормонам использовали систему оценки D. Allred [15].

Результаты ИГХ-окрашивания ткани опухоли с антителами к Her2/neu оценивали в соответствии с рекомендациями Американского общества клинической онкологии и Коллегии американских патологов 2013 г. (ASCO/CAP 2013) [16].

Уровень экспрессии маркера пролиферации Ki-67 определялся как доля клеток с окрашенными ядрами среди 500 опухолевых клеток в полях зрения с наибольшей митотической активностью [17].

Материал первичной опухоли в случаях с неопределенным (2+) уровнем экспрессии онкобелка Her2/neu исследовали методом усиленной серебром гибридизации in situ (SISH) для оценки амплификации гена HER2 (набор зондов INFORM HER2 Dual ISH DNA ProbCocktail, Ventana, США, автостейнер Ventana Benchmark XT).

Результаты SISH-исследования оценивали при помощи световой микроскопии (х630) в соответствии с рекомендациями ASCO/CAP 2013 г. [16].

Частота изменений статусов РЭ, РП и Her2/neu с позитивного на негативный и с негативного на позитивный, Ki-67 с низкого уровня пролиферации (до 20%) на высокий (20% и более) и с высокого на низкий в клетках опухоли при регионарном метастазировании РМЖ сравнивали при помощи точного теста Фишера [18].

Для исследования изменений уровня экспрессии рецепторов к стероидным гормонам, онкобелка Her2/neu и маркера пролиферации Ki-67 при регионарном метастазировании РМЖ все 104 случая распределяли на группы в зависимости от уровня экспрессии каждого маркера в ткани первичной опухоли. Так, для исследования изменений уровня экспрессии рецепторов эстрогенов сформировано три группы: 1-я — экспрессия отсутствует (0 или 2 балла), 31 случай, 2-я — промежуточный уровень экспрессии (3—6 баллов), 43 случая, 3-я — высокий уровень экспрессии (7—8 баллов), 30 случаев. Для исследования изменений экспрессии рецепторов прогестерона материал распределяли также на три группы: 1-я — экспрессия отсутствует (0 или 2 балла), 46 случаев, 2-я — промежуточный уровень экспрессии (3—6 баллов), 42 случая, 3-я — высокий уровень экспрессии (7—8 баллов), 16 случаев. При исследовании изменений экспрессии онкобелка Her2/neu выделено четыре группы: 1-я — экспрессия отсутствует (0), 61 случай, 2-я — низкий уровень экспрессии (1+), 12 случаев, 3-я — неопределенный уровень экспрессии (2+), 19 случаев, 4-я — высокий уровень экспрессии (3+), 12 случаев. Для исследования изменений экспрессии маркера пролиферации Ki-67 сформировано три группы: 1-я — низкий уровень экспрессии (10% и менее), 29 случаев, 2-я — промежуточный уровень экспрессии (10—30%), 37 случаев, 3-я — высокий уровень экспрессии (30% и более), 38 случаев.

В случаях, где количество пораженных метастазами лимфатических узлов было 2 и более, для дальнейшего анализа отбирали 1 лимфатический узел, в котором клетки метастаза демонстрировали наиболее выраженное отличие уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона, Her2/neu и Ki-67 от клеток первичной опухоли.

В описанных группах проводили сравнение уровня экспрессии каждого из исследованных биомаркеров в ткани первичной опухоли и регионарных метастазов с использованием знаково-рангового теста Вилкоксона, а также частоты случаев с повышением и понижением уровня экспрессии каждого биомаркера при метастазировании при помощи точного теста Фишера.

Для выявления корреляционных связей между изменением уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и рецепторов прогестерона при регионарном метастазировании РМЖ применяли ранговую корреляцию Спирмена.

Для оценки частот сходимости положительных и отрицательных Her2/neu-статусов первичной и метастатической опухолей рассчитывалась каппа Коэна.

Статистический анализ проводили с использованием программ Gretl и MS Excel 2007. Принятый уровень статистической значимости (p) составлял 0,05 и менее.

Результаты и обсуждение

РЭ-статус клеток метастазов и первичной опухоли различался в 10 случаях из 104 (частота 9,6%, нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала (ДИ) для частоты 5,0—17,4%), изменение статуса с положительного на отрицательный наблюдалось в 5 случаях из 73 (6,8%, 95% ДИ 2,5—15,9%), с отрицательного на положительный — в 5 случаях из 31 (16,1%, 95% ДИ 6,1—34,5%) (p=0,16).

Общая частота изменений, частота повышения и понижения экспрессии рецепторов эстрогенов при регионарном метастазировании РМЖ в выборке и при группировке случаев приведены в табл. 1.

Таблица 1. Частота различий экспрессии рецепторов эстрогенов в регионарных метастазах при сравнении с первичной опухолью (частота; нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала для частоты)

Группа	Число случаев	Изменение уровня экспрессии (%)	Повышение уровня экспрессии (%)	Понижение уровня экспрессии (%)	p
Выборка	104	67 (64,4; 54,4—73,4)	49 (47,1; 37,3—57,1)	18(17,3; 10,1—26,3)	<0,05
1-я	31	8 (25,8; 12,5—44,9)	7 (22,6; 10,3—41,5)	1 (3,2; 0,2—18,5)	0,053
2-я	43	42(97,7; 86,2—99,9)	35 (81,4; 66,1—91,1)	7 (16,3; 7,3—31,3)	<0,001
3-я	30	17 (56,7; 37,7—74,0)	7 (23,3; 10,6—42,7)	10 (33,3; 17,9—52,9)	0,57

Статистически значимое различие частоты случаев с повышением и понижением уровня экспрессии рецепторов эстрогенов выявлено при анализе всей выборки и случаев 2-й группы.

Медианы уровня экспрессии РЭ в клетках первичной опухоли и метастазов приведены в табл. 2.

Таблица 2. Уровень экспрессии рецепторов эстрогенов в клетках первичной опухоли и регионарных метастазов в баллах по Allred: медиана (межквартильный размах)

Группа	Число случаев	Экспрессия РЭ в клетках первичной опухоли	Экспрессия РЭ в клетках метастазов	p
Выборка	104	5,5* (7)	7 (7)	<0,05
1-я	31	0 (0)	0 (0)	—
2-я	43	6 (1)	7 (1)	0,0017
3-я	30	7 (1)	7 (1)	0,39

Примечание. * — в выборках с четным набором наблюдений при расчете медианы вычисляется среднее арифметическое значений n/2 и n/2+1, которые в нашей выборке составили 5 и 6 баллов по шкале Allred соответственно, в связи с чем медиана имеет дробное значение.

Достоверное различие медиан значений уровня экспрессии РЭ наблюдалось при анализе всей выборки и случаев 2-й группы (рис. 1).

Рис. 1. Экспрессия рецепторов эстрогенов в первичной опухоли (а) и регионарном метастазе (б) в случае из 2-й группы.

а — экспрессия РЭ на уровне 5 баллов по Allred; б — экспрессия РЭ на уровне 7 баллов по Allred; а, б — ИГХ-реакция с анти-РЭ-антителами, ×100.

РП-статус различался в 17 случаях из 104 (16,3%, 95% ДИ 10,1—25,2%), изменение статуса с положительного на отрицательный выявлено в 7 случаях из 58 (12,1%, 95% ДИ 5,4—23,9%), с отрицательного на положительный — в 10 случаях из 46 (21,7%, 95% ДИ 11,4—36,8%) (p=0,28).

Частота изменений, повышения и понижения экспрессии рецепторов прогестерона при регионарном метастазировании РМЖ в выборке и при группировке случаев приведены в табл. 3.

Таблица 3. Частота различий экспрессии рецепторов прогестерона в регионарных метастазах при сравнении с первичной опухолью (частота; нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала для частоты)

Группа	Число случаев	Изменение уровня экспрессии (%)	Повышение уровня экспрессии (%)	Понижение уровня экспрессии (%)	p
Выборка	104	64(61,5; 51,5—70,8)	44 (42,3; 32,3—52,4)	20 (19,2; 12,4—28,4)	0,0005
1-я	46	14 (30,4; 18,2—45,9)	12 (26,1; 14,8—41,4)	2 (4,4; 0,8—16,0)	0,007
2-я	42	41 (97,6; 85,9—99,9)	29 (69,1; 52,8—81,9)	12 (28,6; 16,2—44,8)	0,0004
3-я	16	9 (56,3; 30,6—79,3)	3 (18,8; 5,0—46,3)	6 (37,5; 16,3—64,1)	0,433

Статистически значимое различие частоты случаев с повышением и понижением уровня экспрессии рецепторов прогестерона выявлено при анализе всей выборки и случаев 1-й и 2-й групп.

Медианы уровней экспрессии РП в клетках первичной опухоли и метастазов приведены в табл. 4.

Таблица 4. Уровень экспрессии рецепторов прогестерона в клетках первичной опухоли и регионарных метастазов в баллах по Allred: медиана (межквартильный размах)

Группа	Число случаев	Экспрессия РП в клетках первичной опухоли	Экспрессия РП в клетках метастазов	р
Выборка	104	3 (6)	6 (7)	0,002
1-я	46	0 (0)	0 (2)	—
2-я	42	5 (2)	6,5 (3)	0,03
3-я	16	7 (1)	7 (1,75)	0,23

Достоверное различие медиан значений уровня экспрессии РП наблюдалось при анализе всей выборки и случаев 2-й группы (рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия рецепторов прогестерона в первичной опухоли (а) и регионарном метастазе (б) в случае из 2-й группы.

а — экспрессия РП на уровне 5 баллов по Allred; б — экспрессия РП на уровне 7 баллов по Allred; а, б — ИГХ-реакция с анти-РП-антителами, ×100.

Her2/neu-статус различался в 9 случаях из 104 (8,6%, 95% ДИ 4,3—16,2%), изменение статуса с положительного на отрицательный наблюдалось в 5 случаях из 16 (31,2%, 95% ДИ 12,1—58,5%), с отрицательного на положительный — в 4 случаях из 88 (4,6%, 95% ДИ 1,5—11,9%) (p=0,004).

Общая частота изменений, частота повышения и понижения экспрессии онкобелка Her2/neu при регионарном метастазировании РМЖ в выборке и при группировке случаев приведены в табл. 5.

Таблица 5. Частота различий экспрессии онкобелка Her2/neu в регионарных метастазах при сравнении с первичной опухолью (частота; нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала для частоты)

Группа	Число случаев	Изменение уровня экспрессии (%)	Повышение уровня экспрессии (%)	Понижение уровня экспрессии (%)	p
Выборка	104	52 (50,0; 40,1—59,9)	22 (21,1; 14,0—30,5)	30 (28,9; 20,6—38,7)	0,26
1-я	61	19 (31,2; 20,3—44,4)	19 (31,2; 20,3—44,4)	0	<0,001
2-я	12	10 (83,3; 50,1—97,1)	2 (16,7; 2,9—49,1)	8 (66,7; 35,4—88,7)	0,036
3-я	19	17 (89,5; 65,5—98,2)	1 (5,3; 0,3—28,1)	16 (84,2; 59,5—95,8)	<0,001
4-я	12	6 (50; 22,3—77,7)	0	6 (50; 22,3—77,7)	0,014

Статистически значимое различие частоты случаев с повышением и понижением уровня экспрессии Her2/neu определено при анализе случаев 1-й, 2-й и 3-й групп.

Медианы уровней экспрессии Her2/neu в клетках первичной опухоли и метастазов приведены в табл. 6.

Таблица 6. Уровень экспрессии онкобелка Her2/neu в клетках первичной опухоли и регионарных метастазов: медиана (межквартильный размах)

Группа	Число случаев	Экспрессия Her2/neu в клетках первичной опухоли	Экспрессия Her2/neu в клетках метастазов	p
Выборка	104	0 (2)	0 (1)	0,15
1-я	61	0	0 (1)	—
2-я	12	1+	0 (1)	0,07
3-я	19	2+	1 (1)	<0,001
4-я	12	3+	2,5* (2)	>0,05

Примечание. * — в выборках с четным набором наблюдений при расчете медианы вычисляется среднее арифметическое значение n/2 и n/2+1, которые в нашей выборке составили 2+ и 3+ соответственно, в связи с чем медиана имеет дробное значение.

Достоверное различие медиан значений уровня экспрессии Her2/neu наблюдалось при анализе случаев 3-й группы (рис. 3).

Рис. 3. Экспрессия онкобелка Her2/neu в первичной опухоли (а) и регионарном метастазе (б) в случае из 3-й группы.

а — экспрессия Her2/neu на уровне 2+; б — экспрессия Her2/neu на уровне 1+; а, б — ИГХ-реакция с анти-Her2/neu-антителами, ×100.

Уровень пролиферации (Ki-67) клеток первичной и метастатической опухоли различался в 37 случаях из 104 (35,6%, 95% ДИ 26,6—45,6%), изменение уровня пролиферации с высокого на низкий наблюдалось в 23 случаях из 60 (38,3%, 95% ДИ 26,3—51,8%), с низкого на высокий — в 14 случаях из 44 (31,8%, 95% ДИ 19,1—47,7%) (p=0,54).

Общая частота изменений, частота повышения и понижения экспрессии маркера пролиферации Ki-67 при регионарном метастазировании РМЖ в выборке и при группировке случаев приведены в табл. 7.

Таблица 7. Частота различий экспрессии Ki67 в регионарных метастазах при сравнении с первичной опухолью (частота; нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала для частоты) Статистически значимое различие частоты случаев с повышением и понижением уровня экспрессии Ki-67 было выявлено при анализе случаев 1-й и 3-й групп

Группа	Число случаев	Изменение уровня экспрессии (%)	Повышение уровня экспрессии (%)	Понижение уровня экспрессии (%)	p
Выборка	104	47 (45,2; 35,5—55,2)	24 (23,1; 15,6—32,6)	23 (22,1; 14,8—31,5)	>0,999
1-я	29	6 (20,7; 8,7—40,3)	6 (20,7; 8,7—40,3)	0	0,023
2-я	37	13 (35,1; 20,7—52,6)	10 (27,0; 14,4—44,4)	3 (8,1; 2,1—23,0)	0,064
3-я	38	28 (73,7; 56,6—86,0)	8 (21,1; 10,1—37,8)	20 (52,6; 36,1—68,7)	0,008

Медианы уровня экспрессии Ki-67 в клетках первичной опухоли и метастазов указаны в табл. 8.

Таблица 8. Уровень экспрессии Ki-67 в клетках первичной опухоли и регионарных метастазов в процентах: медиана (межквартильный размах)

Группа	Число случаев	Экспрессия Ki-67 в клетках первичной опухоли	Экспрессия Ki-67 в клетках метастазов	р
Выборка	104	20 (27,5)	15 (30)	0,71
1-я	29	10 (5)	10 (12,5)	0,08
2-я	37	20 (10)	15 (25)	0,52
3-я	38	45 (40)	30 (60)	0,55

Достоверное различие медиан значений уровня экспрессии Ki-67 не выявлено.

Из 43 случаев с умеренным уровнем экспрессии рецепторов эстрогенов (2-я группа) в ткани первичной опухоли наблюдалось повышение уровня экспрессии РЭ в метастазах в 35 случаях, в 26 из которых выявлено повышение и уровня экспрессии рецепторов прогестерона, а снижение уровней экспрессии РЭ и РП при метастазировании — в 7 и 4 случаях соответственно. Доля случаев с одинаковым направлением изменений уровня экспрессии РЭ и РП в этой группе составила 69,8% (95% ДИ 53,7—82,3%). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена для разностей уровня экспрессии РЭ и РП в ткани метастаза и первичной опухоли составил 0,67 (положительная корреляционная связь средней силы) (p<0,001).

Поскольку уровень экспрессии Her2/neu в ткани первичной опухоли во всех случаях 3-й группы составлял 2+, этот материал был исследован с применением SISH-метода для оценки Her2/neu-статуса первичной опухоли. Из 19 случаев, вошедших в 3-ю группу, амплификация гена Erbb2 в ткани первичной опухоли обнаружена в четырех случаях, в одном из которых уровень экспрессии Her2/neu в ткани метастаза составлял 3+; в 15 случаях данный ген не был амплифицирован в клетках первичной опухоли, а белок Her2/neu не демонстрировал гиперэкспрессию в клетках метастазов. Частота совпадения Her2/neu-статуса ткани первичной и метастатической опухоли в 3-й группе составила 84,2% (95% ДИ 59,5—95,8%), каппа Коэна — 0,34 (удовлетворительная сходимость) [19].

При исследовании уровня экспрессии рецепторов эстрогенов в ткани первичной опухоли и изменений уровня экспрессии РЭ при регионарном метастазировании в случаях 3-й группы с негативным Her2/neu-статусом опухолевой ткани в первичном и метастатическом очаге (n=15) выявлено 8 случаев с более высоким уровнем экспрессии РЭ в ткани метастазов, чем в ткани первичной опухоли (53,3%, 95% ДИ 27,4—77,7%), и 2 случая, в которых уровень экспрессии РЭ в ткани метастазов был ниже, чем в ткани первичной опухоли (13,3%, 95% ДИ 2,3—41,6%). Различие полученных частот достоверно (p=0,05, точный тест Фишера).

Дискордантность статуса рецепторов эстрогенов в клетках первичной опухоли и регионарных метастазов наблюдалась в 9,6%, рецепторов прогестерона — в 16,3%, Her2/neu — в 8,6%, Ki-67 — в 35,6% случаев, достоверные различия обнаружены при сравнении частоты изменений статуса Ki-67 при метастазировании с частотами изменений других биомаркеров (p=0,003). При этом не выявлено достоверных различий частоты случаев с изменением статусов РЭ и РП с положительного на отрицательный и с отрицательного на положительный, Ki-67 с высокого уровня пролиферации на низкий и с низкого на высокий при регионарном метастазировании РМЖ, тогда как частота случаев с негативной конверсией Her2/neu-статуса преобладала над частотой случаев с позитивной конверсией статуса Her2/neu.

Частота случаев с дискордантностью Her2/neu-статуса (8,6%) существенно ниже, чем частота случаев с изменением уровня экспрессии Her2/neu (50%) в клетках регионарных метастазов, поскольку во многих случаях с изменением уровня экспрессии Her2/neu статус Her2/neu оставался неизменным, тогда как изменение статуса Her2/neu в каждом случае сопровождалось изменением уровня экспрессии этого биомаркера.

Взаимосвязи гетерогенности гистологических характеристик (степень структурной и клеточной дифференцировки) и уровней экспрессии исследованных биомаркеров в опухолевых клетках в первичной опухоли и регионарных метастазах РМЖ не обнаружено.

Заключение

Дискордантный статус РЭ, РП, Her2/neu и Ki-67 первичной опухоли и регионарных метастазов обнаружен в 9,6, 16,3, 8,6 и 35,6% изученных в исследовании случаев соответственно. Частота случаев с дискордантным статусом Ki-67достоверно выше частоты случаев с дискордантностью статуса рецепторов. Отрицательный Her2/neu-статус метастазов при положительном Her2/neu-статусе первичной опухоли наблюдается чаще, чем изменение Her2/neu-статуса в противоположном направлении.

В клетках регионарных метастазов РМЖ при сравнении с первичной опухолью обнаружено повышение уровня экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в случае с умеренным уровнем экспрессии РЭ и РП в клетках первичной опухоли и снижение уровня экспрессии Her2/neu при сохранении Her2/neu-статуса в случае с неопределенным (2+) уровнем экспрессии этого биомаркера в клетках первичной опухоли. Уровень экспрессии Ki-67 в клетках опухоли при регионарном метастазировании РМЖ изменялся разнонаправленно.

Клетки с высоким уровнем экспрессии РЭ, входящие в состав опухоли, основная масса клеток которой экспрессирует РЭ умеренно, по-видимому, имеют преимущество при формировании метастазов и отличаются высоким уровнем экспрессии РП. В свою очередь метастазы, образованные такими клетками, отражают их фенотип. Такая закономерность объясняется функционированием рецепторов эстрогенов в качестве как транскрипционных факторов, в том числе для гена рецептора прогестерона, так и компонентов цитоплазматических сигнальных путей MAPK, PI3K, приводящих к эпителиомезенхимальному переходу клетки, и ROCK, ведущего к перестройке актина и приобретению клеткой подвижности [20—24]. Наряду с этим молекулы РЭ способны снижать транскрипцию неамплифицированного гена HER2 путем воздействия на кофакторы SRC и AP-2, что объясняет снижение уровня экспрессии Her2/neu в опухолевых клетках при метастазировании РМЖ в случае с неопределенным уровнем экспрессии (2+) этого биомаркера в клетках первичной опухоли [25, 26].

Дискордантность статуса рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона, Her2/neuи Ki-67 в первичной опухоли и регионарных метастазах при РМЖ, по-видимому, потребует выработки новых специальных терапевтических подходов, поскольку проявление метастатической опухолью признаков иного биологического подтипа позволяет расширить арсенал средств противоопухолевой терапии.

Работа выполнена в рамках государственного задания УГМУ №056-00145-19-00.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — К. В. Конышев, С.В. Сазонов

Сбор и обработка материала — К.В. Конышев

Статистическая обработка данных— К.В. Конышев

Написание текста — К.В. Конышев

Редактирование — С.В. Сазонов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

<