Рябков М.Г.

Городская клиническая больница №12, Нижний Новгород; больница скорой медицинской помощи, Дзержинск

Мокеев О.А.

ГБУЗ Нижегородской области «Городская клиническая больница №30 Московского района города Нижний Новгород», Нижний Новгород, Россия

Киселева Е.Б.

ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России

Шабанов Д.В.

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр «Институт прикладной физики» РАН, Нижний Новгород, Россия

Геликонов В.М.

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр «Институт прикладной физики» РАН, Нижний Новгород, Россия

Геликонов Г.В.

ФГБНУ ФИЦ «Институт прикладной физики РАН», Нижний Новгород, Россия

Спиридонов А.А.

ГБУЗ НО «Городская клиническая больница №30 Московского района Н. Новгород», Нижний Новгород, Россия

Бедерина Е.Л.

ГБУЗ НО «Городская клиническая больница №30 Московского района Н. Новгород», Нижний Новгород, Россия

Гладкова Н.Д.

ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России

Бесчастнов В.В.

ГБУЗ НО «Городская клиническая больница №30 Московского района Н. Новгород», Нижний Новгород, Россия

Значение оптической когерентной томографии и морфометрии для оценки состояния парапанкреатической жировой клетчатки при инфицированном панкреонекрозе

Журнал: Архив патологии. 2018;80(3): 46-52

Просмотров : 67

Загрузок :

Как цитировать

Рябков М. Г., Мокеев О. А., Киселева Е. Б., Шабанов Д. В., Геликонов В. М., Геликонов Г. В., Спиридонов А. А., Бедерина Е. Л., Гладкова Н. Д., Бесчастнов В. В. Значение оптической когерентной томографии и морфометрии для оценки состояния парапанкреатической жировой клетчатки при инфицированном панкреонекрозе. Архив патологии. 2018;80(3):46-52. https://doi.org/10.17116/patol201880346-52

Авторы:

Рябков М.Г.

Городская клиническая больница №12, Нижний Новгород; больница скорой медицинской помощи, Дзержинск

Все авторы (10)

Лечение инфицированного панкреонекроза — одна из наиболее сложных проблем современной хирургии. Рост эффективности диагностики и интенсивной терапии привел к тому, что в современных условиях до 80% летальных исходов фиксируют не на начальных этапах развития заболевания, а в фазе септической секвестрации деструктивного панкреатита [1]. Для принятия решения о способе дренирования очага инфекции при гнойно-некротическом парапанкреатите особенно важна объективная информация о состоянии парапанкреатической клетчатки [2, 3]. Однако работ, посвященных изучению морфологической структуры парапанкреатической клетчатки при дренировании гнойно-некротического парапанкреатического очага, в доступной литературе мы не встретили.

Традиционная технология гистологического метода оценки морфологической структуры предполагает активное воздействие на препарат при его фиксации, что требует времени и может изменить параметры микроструктуры исследуемой ткани. Современная хирургия стремится к получению информации о нативной микроструктуре ткани в реальном времени, этим условиям может соответствовать метод оптической когерентной томографии (ОКТ) [4]. В опубликованных ранее работах [5—7] ОКТ-визуализация жировой ткани сопутствует диагностике рака молочной железы и саркомы мягких тканей. Возможность применения ОКТ для оценки состояния парапанкреатической жировой ткани в реальном времени у пациентов с инфицированным панкреонекрозом до сих пор не изучена.

Мы выдвинули следующую гипотезу: жировая клетчатка очага гнойно-некротического поражения в условиях разных методов дренирования различается соотношением долей паренхимы, сосудисто-стромального компонента и участков некротизированной ткани.

Цель исследования — изучение особенности морфометрических и ОКТ-характеристик микроструктуры забрюшинной парапанкреатической жировой клетчатки при пассивном дренировании и в условиях активного перфузионно-аспирационного дренирования инфицированного панкреонекроза.

Материал и методы

Проведен сравнительный анализ 74 образцов парапанкреатической жировой клетчатки, полученной у 37 пациентов (24 (65%) мужчины и 13 (35%) женщин) с инфицированным панкреонекрозом и гнойно-некротическим парапанкреатитом. Стадию развития деструктивного панкреатита и наличие инфицированного панкреонекроза определяли по комплексу лабораторных и инструментальных данных в соответствии с Национальными рекомендациями по острому панкреатиту Российского общества хирургов (2014). Для сравнительного анализа морфометрических характеристик клетчатки пациенты и полученные у них образцы ткани были разделены на две группы. 1-ю группу составили 17 пациентов, у которых очаг гнойно-некротической деструкции дренировали пассивным способом — тампоном Пенроза и трубчатыми дренажами. Во 2-ю группу вошли 20 больных, у которых применена технология активного перфузионно-аспирационного дренирования парапанкреатического гнойно-некротического очага [8].

С целью оценки микроструктуры парапанкреатических тканей на 7—8-е сутки после первичной операции и установки дренажа Пенроза (1-я группа) или активной перфузионно-аспирационной системы (2-я группа) у пациентов из очага воспалительной деструкции забирали образцы парапанкреатической жировой ткани размером от 10×10×5 до 15×20×5 мм. Исследуемые образцы ткани локализовались под нижним краем тела и хвоста поджелудочной железы в зоне, непосредственно контактировавшей с тампоном или дренажем. Всего получено 74 образца ткани: 34 у пациентов 1-й группы и 40 у пациентов 2-й группы. После описания макроструктуры и фотосъемки каждого препарата на них тушью отмечали анатомические ориентиры, в частности поверхность, непосредственно контактировавшую с дренажем. Далее часть из них (58%, а именно 22 образца из 1-й группы и 21 образец из 2-й группы) помещали в изотонический раствор хлорида натрия и не позже чем через 2 ч от момента забора исследовали с помощью ОКТ. Все образцы фиксировали в 10% растворе формалина и проводили их гистологическое исследование (рис. 1).

Рис. 1. Этапы исследования, данные о количестве пациентов и образцов жировой парапанкреатической ткани. ОКТ — оптическая когерентная томография.

Для получения ОКТ-изображений использовали установку скоростной спектральной ОКТ (Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород) cо следующими характеристиками: рабочая длина волны 1320 нм, мощность излучения на объекте ~5 мВт, разрешение по глубине (в воздухе) ~10 мкм, поперечное разрешение ~15 мкм, скорость сканирования 80 000 А-сканов в с, частота получения двухмерных изображений размером 5,5×1,5 мм (ширина × высота) составляет 40 кадров/с [9, 10]. Анализ ОКТ-изображений и их сопоставление с гистологическими срезами препаратов проводили для того, чтобы установить возможность получения объективных данных о микроструктуре нативной (нефиксированной) парапанкреатической жировой ткани интраоперационно в реальном времени. Для этого на ОКТ-изображениях оценивали отличия в визуальных характеристиках некротизированной ткани, адипоцитов и междольковой соединительной ткани.

С целью морфометрического исследования на криотоме получали гистологические срезы препаратов толщиной 20 мкм, при этом макропрепарат ориентировали таким образом, чтобы направление и локализация среза точно совпадали с локализацией и направлением в проведенном ранее ОКТ-исследовании (рис. 2).

Рис. 2. Прицельное параллельное исследование препарата парапанкреатической жировой ткани. а — образец ткани на криотоме, прямоугольниками обозначены поверхности, подвергнутые дальнейшему исследованию с помощью оптической когерентной томографии — ОКТ (бар — 1000 мкм); б — ОКТ-изображения участков ткани (бар — 1000 мкм); в — гистологический микропрепарат, исследованный с помощью ОКТ (окраска гематоксилином и эозином, бар — 100 мкм, ×100). 1 — паренхима жировой ткани, 2 — сливные участки некроза.

Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону. Гистологические препараты исследованы на микроскопе Leica DM 2500, описаны и пошагово сфотографированы с использованием цифровой камеры Leica DFC 245C. После компьютерной реконструкции пошаговых гистологических срезов каждого из препаратов до получения его панорамного изображения путем склеивания общего изображения из нескольких проводили морфометрический анализ в программе ImageJ 1.46. Изображение масштабировали, затем всю поверхность ткани, обращенную к тампону или дренажу, делили на секторы размером 1×2 мм, ориентированные перпендикулярно поверхности ткани. В площади полученных секторов оценивали доли (в процентах от общей площади анализируемого участка ткани) некроза, адипоцитов, междольковой соединительной ткани.

Для статистической обработки данных использовали программу Statistica 6.0. При сравнении групп по качественному признаку применяли метод Фишера, по количественному признаку критерий — Манна—Уитни (U). Приводимые далее выборочные параметры имеют следующие обозначения: Ме — медиана, Q1 — верхний квартиль, Q3 — нижний квартиль, р — статистическая значимость различий. Критический уровень значимости принимали равным 5% (р≤0,05).

Результаты

При гистологическом исследовании выявлено, что у пациентов обеих групп в забрюшинной парапанкреатической жировой клетчатке развивались выраженные нарушения кровообращения, дистрофия и некробиоз адипоцитов. В то же время в микроструктуре ткани у пациентов двух групп выявлены качественные и количественные отличия. Так, для микроструктуры исследуемой поверхности образцов ткани из 1-й группы, в которой использованы традиционные методы дренирования, характерна относительно небольшая доля жизнеспособной паренхимы, при этом адипоциты и междольковая соединительная ткань локализовались преимущественно не на поверхности препарата, а под выраженным слоем некроза (рис. 3, а,

Рис. 3. Микроструктура парапанкреатической жировой ткани. 1-я группа. а, б — гистологические препараты: а — панорамное микрофото поверхности (окраска гематоксилином и эозином, бар — 500 мкм, ×20); б — микрофото участка некротизированной жировой клетчатки с геморрагическим пропитыванием (окраска по ван Гизону, бар — 100 мкм, ×200); в — ОКТ-изображение поверхности образца (бар — 500 мкм). 1 — междольковая соединительная ткань, 2 — адипоциты, 3 — некроз ткани, 4 — тромбированный сосуд.
б, зоны 1, 2). На большей части поверхности препарата, соприкасавшейся с тампоном Пенроза, определялся струп, состоящий из деструктурированных гомогенных фрагментов разного размера с потерей волокнистой структуры соединительной ткани, отмечены превращение большей части коллагеновых и эластических волокон в сплошную гомогенную массу, геморрагическое пропитывание рыхлой соединительной ткани и жировой паренхимы, тромбирование регионарных микрососудов (см. рис. 3, а, б, зона 3). В жировой ткани вокруг участков некроза наблюдали васкулит с выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией стенок сосудов и периваскулярных зон (см. рис. 3, а, б, зона 1).

На ОКТ-изображениях зон препарата, соответствующих некротизированным тканям, преобладали бесструктурные участки с высоким уровнем сигнала (см. рис. 3, в, зона 3), а на участках с паренхимой визуализировался ячеистый структурированный рисунок (см. рис. 3, в, зона 2).

При количественном морфометрическом анализе гистологических срезов образцов из 1-й группы выявлено, что некротизированная ткань занимала значительную часть препаратов и составила 46,2 (35,6; 56,1)%. Волокна междольковой соединительной ткани и сосуды в зоне непосредственного контакта с тампоном составляли от min 2,9 до max 9,1% площади микропрепарата — 5,6 (3,9; 6,1)%. Доля жировых клеток в 7,9 раза превышала долю сосудисто-стромального компонента ткани и составляла 44,6 (41,2; 51,6)%. При этом в поверхностных тканях, контактирующих с тампоном, установленным в оментобурсостому, на глубине до 2 мм волокна стромы жировой ткани и ее паренхима были выражены в наименьшей степени, преобладали участки деструктурированной некротизированной паренхимы с выраженной нейтрофильной инфильтрацией.

В образцах из 2-й группы в микроструктуре ткани также наблюдали участки некроза, полиморфно-клеточную инфильтрацию, выраженные микрососудистые нарушения. Однако выраженность этих процессов качественно и количественно отличалась от таковой образцов из 1-й группы (см. таблицу).

Количественные характеристики микроструктуры парапанкреатической жировой клетчатки, % (медиана (верхний квартиль; нижний квартиль))
Некротизированные участки ткани также характеризовались потерей волокнистой структуры соединительной ткани, превращением коллагеновых и эластических волокон в сплошную гомогенную массу, полиморфно-клеточной инфильтрацией, но в отличие от таковых в образцах из 1-й группы не составляли крупных массивов и встречались фрагментарно (рис. 4, а,
Рис. 4. Микроструктура парапанкреатической жировой ткани, 2-я группа. а, б — гистологические препараты: а — панорамное микрофото поверхности препарата жировой ткани с выраженным стромальным компонентом (окраска по ван Гизону, бар — 500 мкм, ×20); б — микрофото поверхности препарата с небольшими очагами некроза (окраска гематоксилином и эозином, бар — 500 мкм, ×40); в — ОКТ-изображение образца жировой ткани с выраженным стромальным компонентом (бар — 500 мкм). 1 — междольковая соединительная ткань, 2 — адипоциты, 3 — некроз ткани.
зона 2). Сосудисто-стромальный компонент был представлен в большем объеме, доля соединительнотканных волокон и сосудов в препаратах из 2-й группы составила 16,2 (11,4; 19,7)%. При этом в поверхностно-расположенных тканях, контактирующих с перфузионно-аспирационной системой, установленной в оментобурсостому, эластические и коллагеновые волокна стромы и сосуды жировой ткани были выражены в большей степени, чем в образцах из 1-й группы (см. рис. 4, а, б, зона 4), а доля паренхимы (адипоцитов) составила 68,5 (59,7; 71,2)% (см. рис. 4, а, б, зона 3; см. таблицу).

На ОКТ-изображениях поверхностных участков ткани преобладали зоны с ячеистой структурой, характерной для паренхиматозных компонентов ткани (см. рис. 4, в, зона 3), с выраженными элементами стромы ткани (см. рис. 4, в, зона 4) и небольшими бесструктурными фрагментами с высоким уровнем сигнала (см. рис. 4, в, зона 2), соответствующие зонам некроза.

Таким образом, результаты сравнительного морфометрического исследования гистологических срезов из двух групп подтвердили гипотезу, что в микроструктуре парапанкреатической жировой ткани, находящейся в очаге гнойно-некротической деструкции и подвергающейся различным способам дренирования и некрэктомии, соотношение сосудисто-стромального и паренхиматозного компонентов статистически значимо различается.

Сопоставление гистологической картины и ОКТ-изображений участков ткани показало, что некротизированная парапанкреатическая ткань на ОКТ-изображении выглядит бесструктурной и имеет значительно более высокий уровень обратного рассеяния. Жизнеспособная жировая ткань, наоборот, имеет структуру ячеек (сот) из-за минимального сигнала от содержимого жировых клеток и высокого сигнала от прослоек соединительной ткани. Гистотомографические сопоставления позволили установить, что микроструктура образцов нефиксированной в формалине парапанкреатической жировой ткани, включая границу паренхиматозного и некротического компонентов, достаточно точно видна на ОКТ-изображениях. Не имея гистологического заключения, по данным ОКТ, можно было предположить наличие и выраженность некроза в каждом конкретном участке исследуемой ткани. Следует отметить, что метод не требует окрашивания/контрастирования ткани, изображения внутренней структуры ткани строятся в режиме реального времени, получение ОКТ-изображения, включая позиционирование зонда относительно поверхности ткани, занимает несколько секунд.

Обсуждение

Морфологические исследования с разным масштабом визуализации продемонстрировали существенные качественные и количественные различия в зависимости от способа дренирования парапанкреатической клетчатки при панкреонекрозе. При активном перфузионно-аспирационном дренировании гнойного очага более выраженно, чем при пассивном дренировании, снижается объемная плотность некротизированных тканей и увеличивается объемная плотность сосудов и стромы жировой ткани. Этот факт имеет большое клиническое значение, так как именно своевременное удаление очагов некроза, позволяет остановить гнойно-некротический процесс и снизить уровень интоксикации при инфицированом панкреонекрозе. К сожалению, доказательные данные отсутствуют и у международных экспертов нет единого мнения по вопросу оптимального способа дренирования очагов инфекции при панкреонекрозе [11].

Необходимо отметить, что технические возможности световой микроскопии, традиционная технология приготовления гистологических препаратов не позволяют оценить нативную структуру ткани. В настоящей работе впервые образцы парапанкреатической клетчатки, удаленной из гнойного очага у пациентов с панкреонекрозом, исследованы методом ОКТ. Существенно различающиеся оптические свойства паренхимы жировой ткани, соединительнотканной стромы и некротизированной ткани позволяют верифицировать их на ОКТ-изображении даже при визуальной оценке. Многочисленные адипоциты, наполненные жиром, и находящиеся между ними тяжи соединительнотканной стромы формируют ячеистые структуры и на ОКТ-изображениях имеют специфический рисунок из-за очень разной рассеивающей способности составляющих жировую ткань компонентов. Сопоставление ОКТ-изображений и морфологических данных позволяет поставить вопрос о перспективности применения метода ОКТ для прижизненного получения характеристик парапанкреатической клетчатки в фазе септической секвестрации гнойно-некротического парапанкреатита и о мониторинге эффективности его лечения.

Заключение

На микроструктуру парапанкреатической жировой клетчатки гнойно-некротического очага активно воздействует способ дренирования. Перфузионно-аспирационное дренирование по сравнению с традиционным способом пассивного дренирования ассоциировано с меньшей долей некротизированной ткани (14,4% против 46,2%; p≤0,05) и большей долей сосудисто-стромального компонента (16,2% против 5,6%; p≤0,05). Метод оптической когерентной томографии позволяет качественно отличать паренхиму жизнеспособной жировой парапанкреатической клетчатки от участков некротизированной ткани и подтверждает данные, полученные при гистоморфометрии, о существенных различиях микроструктуры жировой клетчатки, изъятой из очага гнойно-некротического поражения после дренирования различными способами. Существенной особенностью при этом является возможность исследования структуры нативной (нефиксированной) жировой ткани.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.Г.Р., Н.Д.Г., В.М.Г.

Сбор и обработка материала — М.Г.Р., О.А.М, Е.Б.К, А.А.С., Е.Л.Б, Г. В.Г., Д.В.Ш.

Статистическая обработка — М.Г.Р., В.В.Б.

Написание текста — М.Г.Р., Е.Б.К., В.В.Б., О.А.М.

Редактирование — Н.Д.Г., В.М.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Рябков Максим Георгиевич — e-mail: maxim-ryabkov@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9555-190X

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail