Варламов А.В.

Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Секачева М.И.

Отделение хирургии печени, желчных путей и поджелудочной железы Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Скипенко О.Г.

Российский научный центр хирургии им. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Фёдоров Д.Н.

РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Влияние предоперационной лекарственной терапии на экспрессию маркеров ангиогенеза в метастазах колоректального рака в печени

Журнал: Архив патологии. 2017;79(1): 36-42

Просмотров : 16

Загрузок : 1

Как цитировать

Варламов А. В., Пальцева Е. М., Секачева М. И., Скипенко О. Г., Фёдоров Д. Н. Влияние предоперационной лекарственной терапии на экспрессию маркеров ангиогенеза в метастазах колоректального рака в печени. Архив патологии. 2017;79(1):36-42. https://doi.org/10.17116/patol201779136-42

Авторы:

Варламов А.В.

Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Все авторы (5)

Формирование сосудов является важной составной частью развития большинства тканей, в том числе опухолевых. Однако в сравнении с нормальными тканями сосуды опухолей имеют ряд особенностей. В частности, в них нарушено соотношение артериол, вен и капилляров, между эндотелиоцитами формируются широкие щели, через которые возможно пропотевание плазмы в ткань опухоли с повышением внутритканевого давления. Перициты в сосудах опухоли очень слабо связаны с эндотелиоцитами и базальной мембраной. Кроме того, имеет место сдавление сосудов опухолевой тканью. Все эти факторы приводят к нарушению кровоснабжения опухоли с развитием тканевой гипоксии и ацидоза [1]. В метастазах колоректального рака (КРР) в печени, как и в ткани первичных опухолей, имеются участки, находящиеся в состоянии гипоксии, в ответ на которую происходит синтез соответствующих факторов, в частности индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF1α). Показано, что экспрессия HIF1α значительно выражена в метастазах колоректальных карцином в печени. Под влиянием данного белка происходит каскад событий, в том числе индукция транскрипции VEGF-А — важного фактора ангиогенеза и опухолевой прогрессии [2]. Ангиогенез представляет собой способ формирования сосудов, при котором происходит ветвление существующих сосудов по мере развития ткани [3]. Известно, что секретируемый эндотелиальными клетками VEGF-A поддерживает сосудистый гомеостаз [4], в то время как синтезируемый опухолевыми или стромальными клетками VEGF-A играет роль в формировании аномально разветвленных опухолевых сосудов [5]. Экспрессия VEGF-A определяется в нормальной ткани толстой кишки и значительно усиливается в толстокишечных аденомах и еще более — в аденокарциномах. Также обнаружена прямая зависимость степени экспрессии данного фактора со степенью дифференцировки опухоли и ее прогрессии [6].

В предоперационной терапии метастазов КРР в печени применяют различные химиотерапевтические схемы, одной из наиболее широко применяемых является FOLFOX, в состав которой входят 5-фторурацил, лейковорин и оксалиплатин. Для повышения эффективности в комбинации со стандартной цитотоксической химиотерапией применяются таргетные препараты, направленно воздействующие на молекулы, участвующие в канцерогенезе. Одним из таких препаратов, используемых при КРР, является бевацизумаб, представляющий собой моноклональное антитело к VEGF-A. При применении бевацизумаба уменьшается плотность сосудов, повышается доля покрытых перицитами сосудов, что приводит к уменьшению интерстициального давления жидкости. В целом, согласно современным представлениям, воздействие бевацизумаба приводит к временной «нормализации» сосудистого русла опухоли, сопровождающейся общим улучшением ее кровоснабжения, снижением гипоксии и повышением чувствительности к химио- и лучевой терапии [7].

В то же время при проведении анти-VEGF-терапии может возникнуть дефицит сосудов в ткани опухоли с повторным возникновением гипоксии и активацией иных механизмов формирования сосудов. Один из таких механизмов может быть активирован белком SDF1α (CXCL12) [8]. Данный белок представляет собой хемокин, активация экспрессии которого, как и VEGF, происходит под влиянием HIF1α [9]. Роль данного белка в формировании сосудов определяется тем, что SDF1α участвует в мобилизации CD45-положительных клеток-модуляторов неоваскулогенеза моноцитарного ряда. Также функцией данного белка является обеспечение последующего «удерживания» данных клеток в ткани опухоли [10].

Рецепторами SDF1α являются трансмембранные белки CXCR4 и CXCR7 [11]. Показано, что экспрессия CXCR4 и SDF-1α в норме определяется в некоторых тканях, в том числе в эпителиоцитах толстой кишки [12]. В тканях многих злокачественных опухолей, в том числе КРР, также определяется экспрессия CXCR4. Система SDF1α/CXCR4 задействована в метастазировании клеток КРР в печень [13], а повышенная экспрессия CXCR4 и VEGF является предиктором раннего появления отдаленных метастазов при II и III стадиях заболевания. Формирование сосудов по пути SDF1α/CXCR4 происходит по механизмам коопции и васкулогенеза [14]. Коопция — механизм, при котором, строго говоря, не происходит формирования новых сосудов, опухоль поглощает уже имеющиеся в ткани сосуды, используя их в дальнейшем для собственного развития. При васкулогенезе происходит дифференцировка костномозговых эндотелиальных клеток-предшественников с формированием впоследствии сосудистой сети [3].

Рецептор CXCR7 имеет сродство к SDF1α в 10 раз большее, чем CXCR4 [11]. Известно, что экспрессия данного рецептора в клетках многих злокачественных опухолей, в том числе КРР, существенно выше, чем в нормальных клетках. Кроме того, обнаружена связь между степенью экспрессии CXCR7 при КРР и развитием регионарных и отдаленных метастазов [15]. Показано также, что CXCR7 может быть обнаружен в эндотелиоцитах при неоваскуляризации, при этом вне данного процесса экспрессия CXCR7 в эндотелиоцитах не наблюдается [16]. Однако остается неизученной роль системы SDF1/CXCR4/CXCR7 в индукции альтернативного пути формирования сосудов при лечении метастатического КРР анти-VEGF-препаратами.

Цель данной работы — исследование экспрессии маркеров ангио- и васкулогенеза в метастазах колоректальных аденокарцином в печени под влиянием сочетанной цитотоксической и таргетной анти-VEGF-терапии в сравнении с воздействием только цитотоксических препаратов.

Материал и методы

Исследование проведено на операционном материале метастазов колоректальных аденокарцином в печени, полученном от 96 пациентов. В 1-ю группу вошли 16 пациентов (мужчин — 9, женщин — 7; возраст от 47 до 73 лет, медиана возраста 58 лет), получавшие комбинированную предоперационную терапию FOLFOX6 (оксалиплатин, лейковорин, 5-фторурацил) и бевацизумабом. 2-ю группу составил 41 пациент (мужчин — 18, женщин — 23; возраст от 27 до 78 лет, медиана возраста 59 лет), получавший предоперационную химиотерапию в качестве первой линии в режиме FOLFOX6. Группу сравнения составили 39 пациентов с метастазами в печени (мужчин — 17, женщин — 22; возраст от 39 до 76 лет, медиана возраста 60 лет), которым химиотерапию не проводили.

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), осуществляли проводку на гистопроцессоре и заливали в парафин. Для гистологического и ИГХ-исследования изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм. Депарафинирование и ИГХ-окрашивание проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica») c первичными антителами к CXCR4 («GeneTex», кроличьи, клон UMB2; разведение 1:400), CXCR7 («GeneTex», кроличьи, поликлональные; разведение 1:200), VEGF-A («GeneTex», кроличьи, клон EP1176Y; разведение 1:50), SDF-1 («Santa Cruz Biotechnology», кроличьи, поликлональные; разведение 1:200).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Экспрессию SDF1α, VEGF-A определяли в цитоплазме опухолевых клеток, стромальных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов опухоли и оценивали полуколичественным методом как выраженную «+++», умеренную «++», слабую «+», отсутствие окрашивания «–». Экспрессию CXCR7 определяли в мембране данных клеток и оценивали аналогичным образом. Экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов также определяли в цитоплазме и оценивали по указанной градации. Однако в клетках опухоли и стромы экспрессию CXCR4 выявляли в ядрах и оценивали как выраженную «++» (при окраске более чем 50% ядер) либо как слабую «+» (при окраске 10—50% ядер). Окрашивание менее чем 10% клеток оценивали как отсутствие экспрессии «–». Экспрессию белков CXCR4, CXCR7, SDF1α оценивали во всех группах пациентов. Экспрессию VEGF-A определяли в группе получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Результаты исследования проанализированы с использованием программы Statistica 8.0. Сравнительный анализ выполнен методом Пирсона χ2, точным методом Фишера. Статистическая значимость принималась при p<0,05.

Результаты и обсуждение

При анализе экспрессии белка CXCR4 в клетках опухоли не было выявлено достоверных различий между тремя группами ни среди мужчин, ни среди женщин.

При сравнении экспрессии CXCR4 в клетках стромы (рисунок, а, б) метастатических опухолей у мужчин обнаружено, то в группе пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию, выраженную экспрессию наблюдали у 78% (7 из 9 человек), при этом у остальных 22% (2 человека) имелась слабая экспрессия. В группе пациентов, получавших только цитотоксическую терапию, у 5% (1 из 18 мужчин) экспрессия CXCR4 в клетках стромы отсутствовала, у 67% (12 человек) отмечали слабую экспрессию, у 28% (5 человек) — выраженную. В группе нелеченых пациентов в 12% (2 из 17 случаев) экспрессия отсутствовала, в 47% (8 случаев) была слабая экспрессия, в 41% (7 случаев) — выраженная экспрессия. Таким образом, выраженную экспрессию CXCR4 в клетках стромы достоверно более часто наблюдали у мужчин в группе пациентов, леченных цитотоксическими и анти-VEGF-препаратами, по сравнению с мужчинами из группы леченных только цитотоксическими препаратами (р<0,05). Однако при сопоставлении данных групп с группой сравнения статистически значимых различий выявлено не было. Среди женщин статистически значимых различий в экспрессии CXCR4 в клетках стромы между группами тоже выявлено не было (табл. 1).

Таблица 1. Экспрессия CXCR4 в метастазах колоректального рака в печени Примечание. Здесь и в табл. 2: «+» — слабая экспрессия, «++» — умеренная, «+++» — выраженная; * — р<0,05 при сопоставлении со 2-й группой; ** — р<0,05 — с группой сравнения.

При анализе экспрессии рецептора CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов опухоли (см. рисунок, б) получены противоречивые результаты. В 1-й группе среди мужчин экспрессию данного белка в сосудах определяли у 44% (4 из 9) пациентов, из них у 33% (3 случая) выраженную, у 11% (1 случай) умеренную, у остальных 56% (5 из 9) экспрессия отсутствовала. Среди женщин данной группы CXCR4 в эндотелиоцитах определяли у 57% (4 из 7 человек), из них у 14% (1 случай) отмечена слабая экспрессия, у 14% (1 случай) — умеренная и у 29% (2) — выраженная. Во 2-й группе экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов у мужчин выявляли у 83% (15 из 18) пациентов, из них у 17% (3 случая) слабая, у 38% (7 случаев) умеренная, у 28% (5 случаев) выраженная. Среди женщин данной группы экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов опухоли определяли в 78% (18 из 23) случаев, причем количество случаев с низким, умеренным и высоким содержанием данного рецептора составило по 6 для каждой степени. В группе сравнения у мужчин экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов определяли в 94% (16 из 17) случаев, из них в 24% (4 случая) выявлена слабая экспрессия, в 6% (1 случай) — умеренная, в 64% (11 случаев) — выраженная. Из 22 женщин данной группы CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов опухоли определяли у 100% пациентов, из них в 23% (5 пациентов) слабая экспрессия, в 14% (3) умеренная, в 63% (14 пациентов) выраженная. Таким образом, экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов достоверно реже определяли в группе пациентов, у которых использовали сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию, чем в группе пациентов, не получавших лекарственную терапию, как среди мужчин, так и женщин (p<0,05). Аналогичные результаты получены при сопоставлении группы пациентов, леченных цитотоксическими препаратами и группы нелеченых пациентов среди женщин (p<0,05), однако среди мужчин изменения были статистически незначимы (р=0,6; см. табл. 1).

Экспрессия SDF1α, CXCR4, CXCR7 и VEGF в метастазах колоректального рака в печени. а — экспрессия CXCR4 в ядрах опухолевых клеток и единичных клетках стромы после цитотоксической терапии; б — экспрессия CXCR4 в сосудах и единичных клетках стромы опухоли и ядрах отдельных опухолевых клеток после цитотоксической терапии; в — мембранная экспрессия CXCR7 в опухолевых клетках у пациента, получавшего сочетанную терапию; г — слабая экспрессия SDF1α в опухолевых клетках у пациента, получавшего сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию; д — выраженная экспрессия SDF1α в клетках опухоли и стромы у пациента, получавшего сочетанную терапию; е — умеренная экспрессия VEGF в опухолевых клетках и слабая — в единичных клетках стромы у пациента из группы сравнения; а—е — иммуногистохимическая окраска, ×200.

При исследовании экспрессии CXCR7 в опухолевых клетках (см. рисунок, в) было выявлено, что в группах пациентов, получавших предоперационную лекарственную терапию, среди мужчин наличие данного белка определяли в большинстве случаев: при сочетанной терапии в 89% (8 случаях из 9), при цитотоксической терапии в 100% случаев. В группе, не получавшей лекарственную терапию, у мужчин экспрессию наблюдали в 59% (10 из 17) случаев. Таким образом, достоверно чаще наличие экспрессии CXCR7 в опухолевых клетках у мужчин определяли в группе пациентов, леченных цитотоксическими препаратами по схеме FOLFOX6, по сравнению с группой пациентов, не получавших лекарственную терапию (p<0,05). Других достоверных различий в экспрессии белка CXCR7 между группами выявлено не было.

Анализ экспрессии CXCR7 в клетках стромы метастатических очагов выявил различия экспрессии данного белка у мужчин. Так, среди мужчин в 1-й группе экспрессию CXCR7 в строме наблюдали у 89% (8 из 9) пациентов, во 2-й группе — у 89% (16 из 18 мужчин). Среди мужчин из группы сравнения экспрессию CXCR7 в клетках стромы наблюдали у 53% (9 из 17) пациентов. Согласно полученным данным, выявлено, что в группе пациентов, получавших цитотоксическую терапию, среди мужчин достоверно чаще встречается экспрессия CXCR7 в клетках стромы метастатических очагов по сравнению с группой не получавших предоперационную терапию (p<0,05). При сравнении экспрессии у мужчин из группы пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию, и группы нелеченых пациентов различия не достигли статистической значимости (р=0,1; табл. 2).

Таблица 2. Экспрессия VEGF-A в метастазах колоректального рака в печени

Сопоставление экспрессии CXCR7 в эндотелиоцитах сосудов метастатических очагов достоверных различий между группами не показало. Близкие к достоверным различия выявлены лишь среди мужчин. В группах пациентов, получавших предоперационную лекарственную терапию, среди мужчин экспрессию CXCR7 наблюдали чаще, чем в группе сравнения (р=0,08 для группы пациентов, получавших цитотоксическую терапию; р=0,1 для группы пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию).

При оценке экспрессии SDF1α в опухолевых клетках (см. рисунок, г, д) статистически значимые различия выявлены лишь между мужчинами из группы пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию, и группы нелеченых пациентов: в 1-й группе достоверно чаще наблюдалась экспрессия SDF1α (p<0,05). Среди мужчин, получавших терапию бевацизумабом, экспрессию SDF1α в опухолевых клетках наблюдали в 33% (3 из 9) случаев, в то время как в группе сравнения экспрессия данного белка не выявлена.

Экспрессия SDF1α в эндотелиоцитах сосудов и в клетках стромы метастатических очагов не показала значимых различий между группами.

Полученные данные отчасти соответствуют результатам других похожих исследований. В нашей работе добавление к цитотоксической терапии таргетного анти-VEGF-препарата приводило к статистически значимому усилению экспрессии SDF1α в опухолевых клетках и его рецептора CXCR4 в строме метастазов КРР у мужчин. Согласно одному из исследований (L. Xu и соавт., 2009), применение бевацизумаба в монотерапии КРР приводило к повышению экспрессии мРНК белка SDF1α и мРНК рецептора CXCR4 в биоптатах КРР, взятых из первичных опухолей [17]. В другом исследовании (K. Tamas и соавт., 2015) получены данные об усилении экспрессии SDF1α в первичных опухолях у пациентов, больных раком прямой кишки IV стадии, под воздействием сочетанной цитотоксической (капецитабин и оксалиплатин) и таргетной анти-VEGF-терапии [18]. В данных исследованиях не было отмечено различий в результатах между мужчинами и женщинами.

Кроме того, в нашем исследовании отмечено достоверно более частое наличие экспрессии CXCR7 в опухолевых клетках и строме метастазов КРР у мужчин, получавших цитотоксическую предоперационную терапию, по сравнению с нелечеными пациентами, что позволяет предполагать некоторую активацию данного пути образования сосудов и при использовании стандартных схем химиотерапии.

По нашим данным, экспрессия VEGF (см. рисунок, е) в строме метастатических очагов достоверно различалась у пациентов, леченных цитотоксическими препаратами в сочетании с бевацизумабом, и пациентов, не получавших лекарственную терапию. Экспрессия данного белка выявлена у 56% (9 из 16) пациентов, получавших терапию (5 из 9 мужчин и 4 из 7 женщин), а в группе сравнения — у всех пациентов, т. е. экспрессия VEGF в клетках стромы достоверно реже наблюдалась у пациентов, получавших сочетанную терапию, чем у пациентов, не получавших лекарственную терапию, как среди мужчин, так и среди женщин (p<0,05). При этом не отмечено влияния бевацизумаба на экспрессию VEGF в опухолевых клетках и в эндотелиоцитах сосудов (табл. 2).

Найдено несколько исследований, в которых отражено воздействие бевацизумаба на экспрессию VEGF. Например, в одной из работ показано снижение экспрессии VEGF в клетках костного мозга у больных острым миелолейкозом под влиянием терапии бевацизумабом после предшествующей химиотерапии [19]. При этом в исследовании S. Wedam и соавт. (2006) получены данные, что добавление бевацизумаба к предоперационной терапии рака молочной железы не влияет на экспрессию VEGF в клетках опухоли [20]. В работе C. Willett и соавт. (2009) показано, что добавление бевацизумаба к комбинированной химиолучевой терапии приводит к повышению концентрации VEGF в плазме крови при раке прямой кишки [21], а в работе J. Baar и соавт. (2009) сообщается о повышении концентрации VEGF в плазме крови у больных раком молочной железы пациентов при добавлении бевацизумаба к предоперационной цитотоксической терапии [22]. По нашим данным, экспрессия VEGF достоверно чаще отсутствовала в строме метастатических опухолей КРР после проведенной сочетанной терапии цитотоксическими и таргетным анти-VEGF-препаратом. По данным, полученным H. Baba и соавт. (2015), экспрессия мРНК VEGF-A в опухолевых клетках метастазов КРР в печени, напротив, выше в группе пациентов, получавших цитотоксическую терапию в сочетании с бевацизумабом, по сравнению с группой пациентов, не получавших предоперационной противоопухолевой терапии [23]. В целом количество подобных исследований невелико, они различаются как по материалам, так и по методам исследования, а их результаты остаются противоречивыми.

Заключение

Согласно полученным данным, у пациентов с метастазами колоректальных аденокарцином в печени применение в предоперационной терапии не только схемы FOLFOX6 в сочетании с бевацизумабом, но и изолированно цитотоксических схем достоверно влияет на экспрессию маркеров ангиогенеза. Так, сочетанная цитотоксическая и таргетная анти-VEGF-терапия приводит к некоторому подавлению образования новых сосудов по альтернативному пути SDF1/CXCR4/CXCR7 за счет снижения экспрессии CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов и экспрессии VEGF в клетках стромы метастатических очагов. У мужчин такая терапия приводит одновременно к повышению экспрессии SDF1α в опухолевых клетках и CXCR4 в строме. При этом данная терапия не влияет на экспрессию CXCR7 в метастатических очагах. Предоперационная терапия FOLFOX6 приводит к достоверному повышению экспрессии CXCR7 в опухолевых и стромальных клетках у мужчин, что, возможно, свидетельствует об активации данного пути формирования сосудов. Таким образом, изменение экспрессии маркеров ангиогенеза в метастазах КРР под действием лекарственной терапии нуждается в дальнейшем изучении.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: О.Г.С., А.В.В.

Сбор и обработка материала: А.В.В., Е.М.П., М.И.С., Д.Н.Ф., О.Г.С.

Статистическая обработка материала: А.В.В.

Написание текста статьи: А.В.В., Е.М.П., М.И.С.

Редактирование: Е.М.П.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail