Формирование сосудов является важной составной частью развития большинства тканей, в том числе опухолевых. Однако в сравнении с нормальными тканями сосуды опухолей имеют ряд особенностей. В частности, в них нарушено соотношение артериол, вен и капилляров, между эндотелиоцитами формируются широкие щели, через которые возможно пропотевание плазмы в ткань опухоли с повышением внутритканевого давления. Перициты в сосудах опухоли очень слабо связаны с эндотелиоцитами и базальной мембраной. Кроме того, имеет место сдавление сосудов опухолевой тканью. Все эти факторы приводят к нарушению кровоснабжения опухоли с развитием тканевой гипоксии и ацидоза [1]. В метастазах колоректального рака (КРР) в печени, как и в ткани первичных опухолей, имеются участки, находящиеся в состоянии гипоксии, в ответ на которую происходит синтез соответствующих факторов, в частности индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF1α). Показано, что экспрессия HIF1α значительно выражена в метастазах колоректальных карцином в печени. Под влиянием данного белка происходит каскад событий, в том числе индукция транскрипции VEGF-А — важного фактора ангиогенеза и опухолевой прогрессии [2]. Ангиогенез представляет собой способ формирования сосудов, при котором происходит ветвление существующих сосудов по мере развития ткани [3]. Известно, что секретируемый эндотелиальными клетками VEGF-A поддерживает сосудистый гомеостаз [4], в то время как синтезируемый опухолевыми или стромальными клетками VEGF-A играет роль в формировании аномально разветвленных опухолевых сосудов [5]. Экспрессия VEGF-A определяется в нормальной ткани толстой кишки и значительно усиливается в толстокишечных аденомах и еще более — в аденокарциномах. Также обнаружена прямая зависимость степени экспрессии данного фактора со степенью дифференцировки опухоли и ее прогрессии [6].

В предоперационной терапии метастазов КРР в печени применяют различные химиотерапевтические схемы, одной из наиболее широко применяемых является FOLFOX, в состав которой входят 5-фторурацил, лейковорин и оксалиплатин. Для повышения эффективности в комбинации со стандартной цитотоксической химиотерапией применяются таргетные препараты, направленно воздействующие на молекулы, участвующие в канцерогенезе. Одним из таких препаратов, используемых при КРР, является бевацизумаб, представляющий собой моноклональное антитело к VEGF-A. При применении бевацизумаба уменьшается плотность сосудов, повышается доля покрытых перицитами сосудов, что приводит к уменьшению интерстициального давления жидкости. В целом, согласно современным представлениям, воздействие бевацизумаба приводит к временной «нормализации» сосудистого русла опухоли, сопровождающейся общим улучшением ее кровоснабжения, снижением гипоксии и повышением чувствительности к химио- и лучевой терапии [7].

В то же время при проведении анти-VEGF-терапии может возникнуть дефицит сосудов в ткани опухоли с повторным возникновением гипоксии и активацией иных механизмов формирования сосудов. Один из таких механизмов может быть активирован белком SDF1α (CXCL12) [8]. Данный белок представляет собой хемокин, активация экспрессии которого, как и VEGF, происходит под влиянием HIF1α [9]. Роль данного белка в формировании сосудов определяется тем, что SDF1α участвует в мобилизации CD45-положительных клеток-модуляторов неоваскулогенеза моноцитарного ряда. Также функцией данного белка является обеспечение последующего «удерживания» данных клеток в ткани опухоли [10].

Рецепторами SDF1α являются трансмембранные белки CXCR4 и CXCR7 [11]. Показано, что экспрессия CXCR4 и SDF-1α в норме определяется в некоторых тканях, в том числе в эпителиоцитах толстой кишки [12]. В тканях многих злокачественных опухолей, в том числе КРР, также определяется экспрессия CXCR4. Система SDF1α/CXCR4 задействована в метастазировании клеток КРР в печень [13], а повышенная экспрессия CXCR4 и VEGF является предиктором раннего появления отдаленных метастазов при II и III стадиях заболевания. Формирование сосудов по пути SDF1α/CXCR4 происходит по механизмам коопции и васкулогенеза [14]. Коопция — механизм, при котором, строго говоря, не происходит формирования новых сосудов, опухоль поглощает уже имеющиеся в ткани сосуды, используя их в дальнейшем для собственного развития. При васкулогенезе происходит дифференцировка костномозговых эндотелиальных клеток-предшественников с формированием впоследствии сосудистой сети [3].

Рецептор CXCR7 имеет сродство к SDF1α в 10 раз большее, чем CXCR4 [11]. Известно, что экспрессия данного рецептора в клетках многих злокачественных опухолей, в том числе КРР, существенно выше, чем в нормальных клетках. Кроме того, обнаружена связь между степенью экспрессии CXCR7 при КРР и развитием регионарных и отдаленных метастазов [15]. Показано также, что CXCR7 может быть обнаружен в эндотелиоцитах при неоваскуляризации, при этом вне данного процесса экспрессия CXCR7 в эндотелиоцитах не наблюдается [16]. Однако остается неизученной роль системы SDF1/CXCR4/CXCR7 в индукции альтернативного пути формирования сосудов при лечении метастатического КРР анти-VEGF-препаратами.

Цель данной работы — исследование экспрессии маркеров ангио- и васкулогенеза в метастазах колоректальных аденокарцином в печени под влиянием сочетанной цитотоксической и таргетной анти-VEGF-терапии в сравнении с воздействием только цитотоксических препаратов.

Исследование проведено на операционном материале метастазов колоректальных аденокарцином в печени, полученном от 96 пациентов. В 1-ю группу вошли 16 пациентов (мужчин — 9, женщин — 7; возраст от 47 до 73 лет, медиана возраста 58 лет), получавшие комбинированную предоперационную терапию FOLFOX6 (оксалиплатин, лейковорин, 5-фторурацил) и бевацизумабом. 2-ю группу составил 41 пациент (мужчин — 18, женщин — 23; возраст от 27 до 78 лет, медиана возраста 59 лет), получавший предоперационную химиотерапию в качестве первой линии в режиме FOLFOX6. Группу сравнения составили 39 пациентов с метастазами в печени (мужчин — 17, женщин — 22; возраст от 39 до 76 лет, медиана возраста 60 лет), которым химиотерапию не проводили.

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), осуществляли проводку на гистопроцессоре и заливали в парафин. Для гистологического и ИГХ-исследования изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм. Депарафинирование и ИГХ-окрашивание проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica») c первичными антителами к CXCR4 («GeneTex», кроличьи, клон UMB2; разведение 1:400), CXCR7 («GeneTex», кроличьи, поликлональные; разведение 1:200), VEGF-A («GeneTex», кроличьи, клон EP1176Y; разведение 1:50), SDF-1 («Santa Cruz Biotechnology», кроличьи, поликлональные; разведение 1:200).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Экспрессию SDF1α, VEGF-A определяли в цитоплазме опухолевых клеток, стромальных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов опухоли и оценивали полуколичественным методом как выраженную «+++», умеренную «++», слабую «+», отсутствие окрашивания «–». Экспрессию CXCR7 определяли в мембране данных клеток и оценивали аналогичным образом. Экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов также определяли в цитоплазме и оценивали по указанной градации. Однако в клетках опухоли и стромы экспрессию CXCR4 выявляли в ядрах и оценивали как выраженную «++» (при окраске более чем 50% ядер) либо как слабую «+» (при окраске 10—50% ядер). Окрашивание менее чем 10% клеток оценивали как отсутствие экспрессии «–». Экспрессию белков CXCR4, CXCR7, SDF1α оценивали во всех группах пациентов. Экспрессию VEGF-A определяли в группе получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Результаты исследования проанализированы с использованием программы Statistica 8.0. Сравнительный анализ выполнен методом Пирсона χ², точным методом Фишера. Статистическая значимость принималась при p<0,05.

При анализе экспрессии белка CXCR4 в клетках опухоли не было выявлено достоверных различий между тремя группами ни среди мужчин, ни среди женщин.

При сравнении экспрессии CXCR4 в клетках стромы (рисунок, а, б) метастатических опухолей у мужчин обнаружено, то в группе пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию, выраженную экспрессию наблюдали у 78% (7 из 9 человек), при этом у остальных 22% (2 человека) имелась слабая экспрессия. В группе пациентов, получавших только цитотоксическую терапию, у 5% (1 из 18 мужчин) экспрессия CXCR4 в клетках стромы отсутствовала, у 67% (12 человек) отмечали слабую экспрессию, у 28% (5 человек) — выраженную. В группе нелеченых пациентов в 12% (2 из 17 случаев) экспрессия отсутствовала, в 47% (8 случаев) была слабая экспрессия, в 41% (7 случаев) — выраженная экспрессия. Таким образом, выраженную экспрессию CXCR4 в клетках стромы достоверно более часто наблюдали у мужчин в группе пациентов, леченных цитотоксическими и анти-VEGF-препаратами, по сравнению с мужчинами из группы леченных только цитотоксическими препаратами (р<0,05). Однако при сопоставлении данных групп с группой сравнения статистически значимых различий выявлено не было. Среди женщин статистически значимых различий в экспрессии CXCR4 в клетках стромы между группами тоже выявлено не было (табл. 1).

При анализе экспрессии рецептора CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов опухоли (см. рисунок, б) получены противоречивые результаты. В 1-й группе среди мужчин экспрессию данного белка в сосудах определяли у 44% (4 из 9) пациентов, из них у 33% (3 случая) выраженную, у 11% (1 случай) умеренную, у остальных 56% (5 из 9) экспрессия отсутствовала. Среди женщин данной группы CXCR4 в эндотелиоцитах определяли у 57% (4 из 7 человек), из них у 14% (1 случай) отмечена слабая экспрессия, у 14% (1 случай) — умеренная и у 29% (2) — выраженная. Во 2-й группе экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов у мужчин выявляли у 83% (15 из 18) пациентов, из них у 17% (3 случая) слабая, у 38% (7 случаев) умеренная, у 28% (5 случаев) выраженная. Среди женщин данной группы экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов опухоли определяли в 78% (18 из 23) случаев, причем количество случаев с низким, умеренным и высоким содержанием данного рецептора составило по 6 для каждой степени. В группе сравнения у мужчин экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов определяли в 94% (16 из 17) случаев, из них в 24% (4 случая) выявлена слабая экспрессия, в 6% (1 случай) — умеренная, в 64% (11 случаев) — выраженная. Из 22 женщин данной группы CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов опухоли определяли у 100% пациентов, из них в 23% (5 пациентов) слабая экспрессия, в 14% (3) умеренная, в 63% (14 пациентов) выраженная. Таким образом, экспрессию CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов достоверно реже определяли в группе пациентов, у которых использовали сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию, чем в группе пациентов, не получавших лекарственную терапию, как среди мужчин, так и женщин (p<0,05). Аналогичные результаты получены при сопоставлении группы пациентов, леченных цитотоксическими препаратами и группы нелеченых пациентов среди женщин (p<0,05), однако среди мужчин изменения были статистически незначимы (р=0,6; см. табл. 1).

При исследовании экспрессии CXCR7 в опухолевых клетках (см. рисунок, в) было выявлено, что в группах пациентов, получавших предоперационную лекарственную терапию, среди мужчин наличие данного белка определяли в большинстве случаев: при сочетанной терапии в 89% (8 случаях из 9), при цитотоксической терапии в 100% случаев. В группе, не получавшей лекарственную терапию, у мужчин экспрессию наблюдали в 59% (10 из 17) случаев. Таким образом, достоверно чаще наличие экспрессии CXCR7 в опухолевых клетках у мужчин определяли в группе пациентов, леченных цитотоксическими препаратами по схеме FOLFOX6, по сравнению с группой пациентов, не получавших лекарственную терапию (p<0,05). Других достоверных различий в экспрессии белка CXCR7 между группами выявлено не было.

Анализ экспрессии CXCR7 в клетках стромы метастатических очагов выявил различия экспрессии данного белка у мужчин. Так, среди мужчин в 1-й группе экспрессию CXCR7 в строме наблюдали у 89% (8 из 9) пациентов, во 2-й группе — у 89% (16 из 18 мужчин). Среди мужчин из группы сравнения экспрессию CXCR7 в клетках стромы наблюдали у 53% (9 из 17) пациентов. Согласно полученным данным, выявлено, что в группе пациентов, получавших цитотоксическую терапию, среди мужчин достоверно чаще встречается экспрессия CXCR7 в клетках стромы метастатических очагов по сравнению с группой не получавших предоперационную терапию (p<0,05). При сравнении экспрессии у мужчин из группы пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию, и группы нелеченых пациентов различия не достигли статистической значимости (р=0,1; табл. 2).

Сопоставление экспрессии CXCR7 в эндотелиоцитах сосудов метастатических очагов достоверных различий между группами не показало. Близкие к достоверным различия выявлены лишь среди мужчин. В группах пациентов, получавших предоперационную лекарственную терапию, среди мужчин экспрессию CXCR7 наблюдали чаще, чем в группе сравнения (р=0,08 для группы пациентов, получавших цитотоксическую терапию; р=0,1 для группы пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию).

При оценке экспрессии SDF1α в опухолевых клетках (см. рисунок, г, д) статистически значимые различия выявлены лишь между мужчинами из группы пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и таргетную анти-VEGF-терапию, и группы нелеченых пациентов: в 1-й группе достоверно чаще наблюдалась экспрессия SDF1α (p<0,05). Среди мужчин, получавших терапию бевацизумабом, экспрессию SDF1α в опухолевых клетках наблюдали в 33% (3 из 9) случаев, в то время как в группе сравнения экспрессия данного белка не выявлена.

Экспрессия SDF1α в эндотелиоцитах сосудов и в клетках стромы метастатических очагов не показала значимых различий между группами.

Полученные данные отчасти соответствуют результатам других похожих исследований. В нашей работе добавление к цитотоксической терапии таргетного анти-VEGF-препарата приводило к статистически значимому усилению экспрессии SDF1α в опухолевых клетках и его рецептора CXCR4 в строме метастазов КРР у мужчин. Согласно одному из исследований (L. Xu и соавт., 2009), применение бевацизумаба в монотерапии КРР приводило к повышению экспрессии мРНК белка SDF1α и мРНК рецептора CXCR4 в биоптатах КРР, взятых из первичных опухолей [17]. В другом исследовании (K. Tamas и соавт., 2015) получены данные об усилении экспрессии SDF1α в первичных опухолях у пациентов, больных раком прямой кишки IV стадии, под воздействием сочетанной цитотоксической (капецитабин и оксалиплатин) и таргетной анти-VEGF-терапии [18]. В данных исследованиях не было отмечено различий в результатах между мужчинами и женщинами.

Кроме того, в нашем исследовании отмечено достоверно более частое наличие экспрессии CXCR7 в опухолевых клетках и строме метастазов КРР у мужчин, получавших цитотоксическую предоперационную терапию, по сравнению с нелечеными пациентами, что позволяет предполагать некоторую активацию данного пути образования сосудов и при использовании стандартных схем химиотерапии.

По нашим данным, экспрессия VEGF (см. рисунок, е) в строме метастатических очагов достоверно различалась у пациентов, леченных цитотоксическими препаратами в сочетании с бевацизумабом, и пациентов, не получавших лекарственную терапию. Экспрессия данного белка выявлена у 56% (9 из 16) пациентов, получавших терапию (5 из 9 мужчин и 4 из 7 женщин), а в группе сравнения — у всех пациентов, т. е. экспрессия VEGF в клетках стромы достоверно реже наблюдалась у пациентов, получавших сочетанную терапию, чем у пациентов, не получавших лекарственную терапию, как среди мужчин, так и среди женщин (p<0,05). При этом не отмечено влияния бевацизумаба на экспрессию VEGF в опухолевых клетках и в эндотелиоцитах сосудов (табл. 2).

Найдено несколько исследований, в которых отражено воздействие бевацизумаба на экспрессию VEGF. Например, в одной из работ показано снижение экспрессии VEGF в клетках костного мозга у больных острым миелолейкозом под влиянием терапии бевацизумабом после предшествующей химиотерапии [19]. При этом в исследовании S. Wedam и соавт. (2006) получены данные, что добавление бевацизумаба к предоперационной терапии рака молочной железы не влияет на экспрессию VEGF в клетках опухоли [20]. В работе C. Willett и соавт. (2009) показано, что добавление бевацизумаба к комбинированной химиолучевой терапии приводит к повышению концентрации VEGF в плазме крови при раке прямой кишки [21], а в работе J. Baar и соавт. (2009) сообщается о повышении концентрации VEGF в плазме крови у больных раком молочной железы пациентов при добавлении бевацизумаба к предоперационной цитотоксической терапии [22]. По нашим данным, экспрессия VEGF достоверно чаще отсутствовала в строме метастатических опухолей КРР после проведенной сочетанной терапии цитотоксическими и таргетным анти-VEGF-препаратом. По данным, полученным H. Baba и соавт. (2015), экспрессия мРНК VEGF-A в опухолевых клетках метастазов КРР в печени, напротив, выше в группе пациентов, получавших цитотоксическую терапию в сочетании с бевацизумабом, по сравнению с группой пациентов, не получавших предоперационной противоопухолевой терапии [23]. В целом количество подобных исследований невелико, они различаются как по материалам, так и по методам исследования, а их результаты остаются противоречивыми.

Согласно полученным данным, у пациентов с метастазами колоректальных аденокарцином в печени применение в предоперационной терапии не только схемы FOLFOX6 в сочетании с бевацизумабом, но и изолированно цитотоксических схем достоверно влияет на экспрессию маркеров ангиогенеза. Так, сочетанная цитотоксическая и таргетная анти-VEGF-терапия приводит к некоторому подавлению образования новых сосудов по альтернативному пути SDF1/CXCR4/CXCR7 за счет снижения экспрессии CXCR4 в эндотелиоцитах сосудов и экспрессии VEGF в клетках стромы метастатических очагов. У мужчин такая терапия приводит одновременно к повышению экспрессии SDF1α в опухолевых клетках и CXCR4 в строме. При этом данная терапия не влияет на экспрессию CXCR7 в метастатических очагах. Предоперационная терапия FOLFOX6 приводит к достоверному повышению экспрессии CXCR7 в опухолевых и стромальных клетках у мужчин, что, возможно, свидетельствует об активации данного пути формирования сосудов. Таким образом, изменение экспрессии маркеров ангиогенеза в метастазах КРР под действием лекарственной терапии нуждается в дальнейшем изучении.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: О.Г.С., А.В.В.

Сбор и обработка материала: А.В.В., Е.М.П., М.И.С., Д.Н.Ф., О.Г.С.

Статистическая обработка материала: А.В.В.

Написание текста статьи: А.В.В., Е.М.П., М.И.С.

Редактирование: Е.М.П.

Конфликт интересов отсутствует.