Оценка ассоциированности полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента с выживаемостью новорожденных с экстремально низкой массой тела

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, кининаза II, эндопептидаза EC 3.4.15.1) — цинковая металлопептидаза, которая одновременно катализирует превращение ангиотензина I в вазоконстрикторный пептид ангиотензин II и расщепление брадикинина до неактивных пептидов, является ключевым звеном в поддержании равновесия между факторами вазоконстрикции и вазодилатации [1].

В перинатальном периоде система ренин—ангиотензин находится в состоянии гиперактивности и служит важнейшим фактором обеспечения системного сердечно-сосудистого гомеостаза, в частности, снижения сопротивления легочных сосудов и предотвращения клинически значимой легочной гипертензии [2].

При клонировании гена ACE обнаружено, что в интроне 16 либо присутствует (Insertion — I), либо отсутствует (Deletion — D) фрагмент ДНК, состоящий из 287 пар оснований (I/D-полиморфизм). Отмечается прямая корреляция аллеля D и уровня АПФ в крови, лимфе и тканях. Уровень АПФ в сыворотке у здоровых людей, гомозиготных по генотипу DD (36% наблюдаемых), был почти в 2 раза выше, чем у гомозиготных по II генотипу (17% случаев), и имел среднее значение у гетерозиготных — ID генотип (47%) [3]. Данный полиморфный локус широко изучается при различных сердечно-сосудистых заболеваниях взрослых. D-аллель гена ACE считают фактором риска возникновения инфаркта миокарда, спазма коронарных сосудов, гипертрофии левого желудочка, а также высокого риска развития атеросклероза и артериальной гипертензии [3, 4]. В недавней работе X.M. Dou и соавт. отмечено, что носительство мутантных генотипов гена ACE ассоциировано с более неблагоприятным прогнозом исхода септического шока у взрослых [5].

В плазме новорожденных уровень АПФ повышен и постепенно снижается до стабильных значений взрослого. Однако причина такого явления неизвестна, так же как и онтогенез экспрессии гена ACE в различных тканях [6]. Полиморфные варианты этого гена в ряде исследований рассматриваются как факторы предрасположенности к развитию респираторного дистресс-синдрома новорожденных [7]. Опубликованы исследования о влиянии полиморфизма гена ACE на развитие тяжелой формы бронхолегочной дисплазии у недоношенных новорожденных [8].

Данные некоторых исследователей указывают на взаимосвязь носительства у недоношенных новорожденных генов предрасположенности к артериальной гипертензии с лучшей выживаемостью при артериальной гипотензии, связано это, предположительно, с более значимым ответом индивидуума на введение катехоламинов [9, 10]. В то же время на настоящий момент практически отсутствуют публикации как отечественных, так и зарубежных исследователей, посвященные данной проблеме у новорожденных с экстремально низкой массой тела, но именно данная категория пациентов наиболее часто нуждается как в проведении искусственной вентиляции легких (ИВЛ), так и в инотропной и вазопрессорной поддержке [2].

Цель исследования — оценить связь выживаемости детей с экстремально низкой массой тела, нуждающихся в проведении ИВЛ и в инотропной поддержке, с полиморфизмом гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE (Ins-Del).

Дизайн исследования — контролируемое, проспективное, нерандомизированное, одноцентровое.

Критерии соответствия. Критерии включения — новорожденные с экстремально низкой массой тела, гестационный возраст менее 29 нед, инвазивная ИВЛ более 3 сут. Критерии невключения — множественные пороки развития, гемодинамически значимый врожденный порок сердца, гемодинамически значимый открытый артериальный проток (более 1,5 мм) гестационный возраст менее 25 нед. В работу включено 88 пациентов с массой тела от 990 до 770 г. Умерло 12 детей. Конечная точка — уровень летальности.

Условия проведения. Исследование проводилось на базе неонатального отделения реанимации и интенсивной терапии ГБУЗ РКПЦ МЗ РБ, Уфа.

Продолжительность исследования. Группа пациентов сформирована в период с 01.03.19 по 26.12.19.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено этическим комитетом ГБУЗ «Республиканская детская клиническая больница» Министерства здравоохранения Республики Башкортостан (Протокол №7 от 20.03.19).

Описание медицинского вмешательства. В исследовании оценены исходы лечения новорожденных с экстремально низкой массой тела в зависимости от носительства мутантного гена ангиотензинпревращающего фермента (аллель D).

Характеристика выборки. Критериям включения и исключения соответствовало 88 новорожденных с экстремально низкой массой тела (от 990 до 670 г, в среднем 812,3±47,1 г). Основную группу составили 35 пациентов, которым проводили инотропную поддержку добутамином (10 мкг на 1 кг массы тела в минуту) продолжительностью более 24 ч, группу сравнения — 53 новорожденных с кратковременной инотропной поддержкой добутамином. Наличие артериальной гипотензии у исследуемых недоношенных новорожденных диагностировали при значениях среднего артериального давления менее, чем гестационный возраст в неделях [11]. У всех исследуемых имелась симптоматика респираторного дистресс-синдрома новорожденных. Всем пациентам с первых суток жизни проводили инвазивную ИВЛ в режиме периодической принудительной вентиляции с пиковым давлением не более 20 см вод.ст., давление в конце выдоха (РЕЕР) составляло 5 см вод.ст., FiO₂ >0,4, время вдоха 0,4 с, выдоха, 1,1 с [12]. Высокочастотную ИВЛ проводили 3 пациентам основной группы. Новорожденным выполняли инотропную поддержку добутамином. Умерло 12 детей, в том числе 6 новорожденных основной группы и 6 — группы сравнения. Клиническая и демографическая характеристика исследуемых пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-демографическая характеристика исследуемых детей

Примечание. * — различия в группах статистически значимы — p<0,05; РДСН — респираторный дистресс-синдром новорожденных; ИВЛ — искусственная вентиляция легких.

Обе группы исследуемых сопоставимы по анализируемым демографическим параметрам, но различались по изучаемым клиническим признакам.

Основной исход исследования — летальность в 28-дневный срок от момента рождения.

Генетические исследования. Молекулярно-генетические методы исследования (анализ полиморфизма ДНК гена ангиотензинпревращающего фермента — ACE (Ins-Del) выполнены в Центре молекулярной медицины ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет», Уфа. Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови исследуемых новорожденных с экстремально низкой массой тела. Для молекулярно-генетического исследования в первые трое суток госпитализации осуществляли забор цельной венозной крови в количестве 1—2 мл в пробирку с консервантом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), после чего образцы направляли в лабораторию.

Качество и количество выделенной геномной ДНК исследовали с помощью флуориметра Qubit 3.0 («Invitrogen», США). Критерием качества ДНК служило отношение поглощения при длинах волн 260 и 280 нм, лежащее в диапазоне значений 1,8—2,0. Необходимое суммарное количество ДНК для исследования составляло 500 нг. ДНК необходимого качества и количества получена от всех субъектов исследования. Амплификацию проводили с использованием наборов реагентов НПФ «Синтол», Россия. Амплификация ДНК, последующие регистрация и учет результатов ПЦР проведены на детектирующем амплификаторе Gene Amp 2700 («Applied Biosystems», США). Дизайн набора праймеров и подбор рестриктазы проводили с помощью пакетов программ Vector NTI, Primer3Plus и PrimerSelect.

Статистический анализ. Размер выборки предварительно не рассчитывали. Статистическую обработку результатов проводили в операционной среде Windows 7 с использованием статистической программы Statistica 6.0 v. 10.0 («StatSoft Inc.», США). Непрерывные переменные оценены с помощью U-теста Манна—Уитни, категорированные переменные — с помощью c²-теста.

Нами проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей инсерционно-делеционного полиморфизма гена ACE у исследуемых новорожденных с экстремально низкой массой тела (табл. 2). Статистически значимых межгрупповых различий по исследуемым критериям мы не получили. Межгрупповые различия в частоте выявления генотипа DD практически отсутствовали (c²=0,614, p=0,434). Частоты генотипа II также статистически значимо не различались (c²=0,125, p=0,724). Самым распространенным у пациентов обеих групп оказался генотип ID: у 51,42% детей основной группы и у 56,60% — группы сравнения. Распределение аллелей также не продемонстрировало существенной разницы, поскольку частоты аллелей были практически идентичны.

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей гена ACE у исследуемых новорожденных

При сравнении значений выживаемости пациентов основной группы в зависимости от носительства генотипов и аллелей гена АСЕ(табл. 3) нами выявлено, что ни обладание генотипом DD (ответственного за развитие артериальной гипертензии и кардиоваскулярных заболеваний взрослых), ни даже носительство аллелей этого гена статистически значимо не ассоциированы с выживаемостью.

Таблица 3. Распределение генотипов и аллелей гена ACE у новорожденных основной группы в зависимости от выживаемости

При анализе распределения мутантного генотипа DD у умерших детей сравниваемых групп новорожденных нами выявлено по одному пациенту в каждой из них. Частота выявления аллели D гена ACE у новорожденных основной группы составила 41,6% (5 случаев) и 50,0% (6 случаев) — у новорожденных группы сравнения. Эти данные не позволяют нам полагать, что имеются какие-либо различия в частоте выявления аллели D гена ACE у умерших новорожденных обеих групп (c²=0,168 p=0,683).

Основной вывод нашего исследования заключается в том, что у недоношенных младенцев с экстремально низкой массой тела, длительной ИВЛ и инотропной поддержкой не имеется явных преимуществ в выживаемости в зависимости от носительства мутантной аллели D гена ACE (Ins-Del). Хотя, как мы ранее отмечали, в одной из недавних работ отмечена ассоциированность носительства генотипа DD гена ACE со сниженной выживаемостью при септическом шоке у взрослых [5]. Это подтверждает мнение некоторых авторов, указывающих, что наследственная предрасположенность к повышенному артериальному давлению обусловлена взаимодействием множества генетических факторов [10, 13]. Недавно W. Göpel и соавт. в большом массиве данных смогли количественно оценить совокупное воздействие генетических составляющих предрасположенности к артериальной гипертензии у взрослых на выживаемость недоношенных новорожденных с артериальной гипотензией и связано это, по мнению авторов, с более выраженным ответом организма индивидуума на введение катехоламинов [9]. Это подтверждает мнение ряда авторов о том, что генетическая предрасположенность к высокому уровню артериального давления оказывает лишь умеренное влияние на артериальное давление покоя, но может быть спасительной в опасных для жизни ситуациях вследствие повышения реакции на катехоламиновую терапию [9, 14, 15].

Таким образом, современные концепции неонатальной интенсивной терапии основаны на предположении, что генетический фон склонности к артериальной гипертензии является нейтральным фактором при рождении и в раннем детстве, но позже, во взрослой жизни и особенно в пожилом возрасте, он способствует повышенной частоте смерти от сердечно-сосудистых причин [14—17].

Следует отметить, что наша работа имела некоторые ограничения. В числе основных недостатков исследования — то, что оно было одноцентровым, отсутствовала рандомизация выборки пациентов, и исследован всего лишь один из значительного количества генетических предикторов артериальной гипертензии взрослых. Выявленные результаты невозможно экстраполировать на всю популяцию новорожденных ввиду относительной малочисленности исследуемой выборки. Кроме того, необходимо также помнить, что могут иметь место различия в индивидуальных клинических особенностях развития артериальной гипотензии у исследуемых пациентов.

Полученные нами результаты нуждаются в подтверждении путем исследования на большей популяции больных. Вероятно, в будущих рандомизированных контролируемых исследованиях выбор тактики лечения глубоко недоношенных детей будет оцениваться и на основании данных о генетической предрасположенности пациентов к артериальной гипотензии, обеспечивая концепцию «персонифицированной» интенсивной терапии.

Носительство мутантной аллели гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE (Ins-Del) не связано с выживаемостью новорожденных с экстремально низкой массой тела, нуждающихся в проведении искусственной вентиляции легких и в инотропной поддержке.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Миронов П.И.

Сбор и обработка материала — Миронов П.И., Мингазов Н.Н.

Статистический анализ данных — Миронов П.И., Мингазов Н.Н.

Написание текста — Миронов П.И., Мингазов Н.Н.

Редактирование — Миронов П.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.