Введение

Риск нежелательных явлений, прежде всего со стороны желудочно-кишечного тракта и сердечно-сосудистой системы, при назначении нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) в таблетированной лекарственной форме и капсулах акцентировал значимость их использования в лекарственной форме для наружного применения с целью уменьшения системного действия препаратов за счет снижения их доз при пероральном приеме в комбинации с местными НПВП [1, 2]. Однако и в этом случае необходимо учитывать, что большинство НПВП усиливают дегенерацию хряща, поэтому, оказывая симптоматическое действие при остеоартрозе, негативно влияют на патогенез заболевания [3]. НПВП в лекарственной форме для наружного применения эффективны прежде всего за счет ингибирования циклооксигеназы (ЦОГ) и, как следствие, снижения образования простагландинов в зоне повреждения. Альтернативной мишенью для создания противовоспалительных и противоболевых средств в лекарственной форме для наружного применения могут быть ионотропные глутаматные рецепторы (ИГлуР), на периферии локализованные на аксонах, число которых с ИГлуР возрастает при воспалении [4], и экспрессируемые иммунными клетками, прежде всего Т-клетками [5].

В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова как противопаркинсонический препарат с поликомпонентным механизмом действия синтезирован и изучен N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид (гимантан) [6, 7], являющийся низкоаффинным неконкурентным канальным блокатором глутаматного NMDA (N-метил-D-аспартат)-рецептора [8]. Установлено, что гимантан при наружном применении в виде геля снижает выраженность острой ноцицептивной боли [9], острого экссудативного воспаления [10] и вызванного введением полного адъюванта Фрейнда патологического процесса у крыс, включая воспалительную гипералгезию [11].

В продолжение изучения активности гимантана целью настоящего исследования явилась оценка действия гимантана в лекарственной форме для наружного применения, гимантана при внутрибрюшинном введении (раствора субстанции) и при комбинированном применении наружно и внутрибрюшинно на модели послеоперационной боли у крыс. Эффективность гимантана сравнивали с эффективностью широко назначаемого НПВП диклофенака в лекарственной форме для наружного применения, при внутрибрюшинном введении и при его комбинированном применении наружно и внутрибрюшинно.

Материал и методы

Исследование выполнено на самцах крыс из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России». Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к корму и воде при 12-часовом световом режиме. Организацию и проведение работ осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами», ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, и правилами, утвержденными комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова».

Модель послеоперационной боли [12]. На обработанной асептически подошвенной поверхности задней лапы наркотизированных этаминалом натрия (45 мг/кг, внутрибрюшинно) крыс разрезали кожу в длину на 1 см, затем выделяли короткий сгибатель пальцев и разрезали его в продольном направлении, оставляя связки неповрежденными. После надреза мышцу возвращали в исходное положение и разрез кожи зашивали горизонтальным матрасным швом (нитью 5-0 Polyglactin 910, Ethicon, Somerville, NJ). Место разреза обрабатывали стрептоцидом и раствором бриллиантового зеленого.

Изучаемые средства: субстанция гимантана (синтезирован и предоставлен для исследований химико-технологической лабораторией ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова»), 5% гель гимантана серии 190219 (состав: гимантан 2,5 г, гидроксипропилметилцеллюлоза 1,00 г, нипагин 0,075 г, нипазол 0,025 г, диметилсульфоксид 5,00 г, вода очищенная до 50,00 г; разработан и предоставлен для исследований лабораторией готовых лекарственных форм ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова»); диклофенак натрия, раствор для инъекций 25 мг/мл (Hemofarm, Сербия), 1% гель диклофенака (Hemofarm, Сербия). Гимантан вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг, диклофенак натрия — в дозе 5 мг/кг в объеме 2 мл/кг. В качестве растворителя использовали физиологический раствор (натрия хлорид, раствор для инфузий 0,9%; производитель: ОАО НПК «ЭСКОМ»). Гели наносили на прооперированные лапы животных в количестве 0,1 мл.

Изучаемые средства наносили на прооперированную лапу (гели) и вводили внутрибрюшинно (в виде растворов) дважды в сутки (в 9:00 и 16:00) начиная со дня операции (0-е сутки) и в течение 3 дней после нее. Животным, получавшим комбинированную терапию изучаемыми средствами при их введении внутрибрюшинно и при их наружном применении, в утренний сеанс наружно наносили гели, в вечерний сеанс средства в виде растворов вводили внутрибрюшинно. Болевую чувствительность крыс оценивали за сутки до операции, в 1-е, на 2-е, 3-и и 4-е сутки после операции. В эти же дни фиксировали массу тела крыс.

Механическую гипералгезию регистрировали с помощью волосков фон Фрея (Aesthesio Ugo Basile, Италия). Крыс помещали в пластиковые камеры (20×10×14 см) на возвышенной решетчатой платформе с перфорациями размером 1 см². После их адаптации к установке (15 мин) волосок фон Фрея с калиброванной силой на сгибание, равной 10 г, предъявляли перпендикулярно в разных местах подошвенной поверхности задней лапы, исключая область пальцев и скакательного сустава, 10 раз (длительность воздействия 1 с). Регистрировали число отдергиваний задних лап в ответ на их стимуляцию [13].

Тепловую гипералгезию оценивали в подошвенном тесте на установке Plantar Test (Hargreave’s Method, Ugo Basile, Италия). Крыс помещали в пластиковые камеры (20×10×14 см) на стеклянной платформе аппарата и в течение 15 мин адаптировали к условиям установки. Луч инфракрасного света предъявляли перпендикулярно и фокусировали на середине подошвенной поверхности задних лап животных. Интенсивность воздействия соответствовала повышению температуры от 40 °C до 50 °C в течение 10 с. Регистрировали латентный период (ЛП) отдергивания задних лап в ответ на подачу сфокусированного луча инфракрасного света в секундах.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью языка программирования R версии 3.5.1. Нормальность распределения данных проверяли при помощи критерия Шапиро—Уилка с последующей оценкой межгруппового равенства дисперсий критерием Бартлетта. Так как распределение данных отличалось от нормального, то для дальнейшего анализа использовали непараметрические методы: критерий Краскела—Уоллиса, критерий Манна—Уитни, парный критерий Уилкоксона. Результаты в таблицах представлены как медиана, 1-й и 3-й квартили. Различия между группами считали статистически значимыми при p≤0,05.

Результаты

Чувствительность задних лап крыс к механической и тепловой стимуляции, зарегистрированная за сутки до операции, была сопоставима во всех группах. Число отдергиваний задних лап животными в ответ на 10-кратное воздействие волоском фон Фрея с калиброванной силой на сгибание, равной 10 г, соответствовало 0—2; ЛП отдергивания задних лап в ответ на тепловое воздействие составил 9,0—10,6 с.

Модель послеоперационной боли у крыс, вызванной разрезом кожи, фасций и короткого сгибателя пальцев задней лапы, воспроизводит острую ноцицептивную боль при хирургических разрезах. У крыс с этой моделью на протяжении нескольких дней после хирургической манипуляции наблюдается механическая гипералгезия, что свидетельствует о подобии регистрируемых в эксперименте проявлений клинической картине в послеоперационном периоде у людей [12].

Начиная с 1-х суток после операции у крыс контрольной группы, не получавших изучаемых средств, регистрировали механическую и тепловую гипералгезию (табл. 1, 2). Так, число отдергиваний прооперированной задней лапы в ответ на раздражение ее подошвенной поверхности нитью фон Фрея силой на сгибание, равной 10 г, в 1-е сутки после операции повысилось со значения медианы, за день до операции равного 0, до 7,5. На 2-е, 3-и и 4-е сутки после хирургической манипуляции механическая чувствительность этой задней лапы не уменьшалась по сравнению с 1-ми сутками и характеризовалась значениями медианы числа ее отдергиваний в ответ на стимуляцию, соответственно равными 8,5, 8,0 и 8,0 (см. табл. 1).

Таблица 1. Влияние гимантана и диклофенака при внутрибрюшинном введении, наружном и комбинированном применении (накожное нанесение гелей и введение внутрибрюшинно) на механическую гипералгезию у крыс с моделью послеоперационной боли

Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей; n — число крыс в группе; * — p<0,05 по сравнению с группой контроля, критерий Манна—Уитни; ^# — p<0,05 по сравнению с показателем в группе до операции, парный критерий Уилкоксона.

Таблица 2. Влияние гимантана и диклофенака при внутрибрюшинном введении, наружном и комбинированном применении (накожное нанесение гелей и введение внутрибрюшинно) на тепловую гипералгезию у крыс с моделью послеоперационной боли

Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей; n — число крыс в группе; * — p<0,05 по сравнению с группой контроля, критерий Манна—Уитни; ^# — p<0,05 по сравнению с показателем в группе до операции, парный критерий Уилкоксона

Тепловая гипералгезия в контрольной группе крыс проявлялась снижением ЛП отдергивания прооперированной лапы в ответ на подачу сфокусированного луча инфракрасного света на ее подошвенную поверхность в 2,1 раза в 1-е сутки после операции по сравнению со значением за сутки до нее. На 2-е, 3-и и 4-е сутки после операции в этой группе ЛП отдергивания поврежденной задней лапы постепенно повышался соответственно до значений медианы, равных 5,9 с, 6,5 с и 7,3 с, при этом значимая разница со значением до операции сохранялась на 2-е и 3-и сутки после операции (см. табл. 2).

Гимантан при двукратном ежедневном применении в виде лекарственной формы для наружного применения, двукратном ежедневном внутрибрюшинном введении в дозе 10 мг/кг и при комбинированном использовании геля и внутрибрюшинного введения значимо снижал выраженность механической послеоперационной гипералгезии у крыс во все дни регистрации по сравнению с выраженностью механической послеоперационной гипералгезии в контрольной группе. Наиболее низкие значения числа отдергиваний прооперированной задней лапы в ответ на механическое воздействие были зарегистрированы при ежедневном двукратном нанесении на поврежденную заднюю конечность 5% геля гимантана: они не превышали значения медианы, равного 1,0 (см. табл. 1). Препарат сравнения диклофенак наиболее выраженно снижал механическую послеоперационную гипералгезию у крыс также при его двукратном наружном нанесении. Значения медианы числа отдергиваний поврежденной задней лапы в ответ на раздражение нитью фон Фрея при применении 1% геля диклофенака соответствовали 1,0—2,0 во все дни регистрации чувствительности крыс. Выраженность действия на механическую гипералгезию 5% геля гимантана при ежедневном двукратном нанесении значимо не отличалась от эффекта 1% геля диклофенака. Однако эффективность гимантана в дозе 10 мг/кг при ежедневном двукратном внутрибрюшинном введении значимо превосходила анальгетический эффект диклофенака в дозе 5 мг/кг при ежедневном двукратном внутрибрюшинном введении на 2-е, 3-и и 4-е сутки после операции (p<0,05, критерий Манна—Уитни) (см. табл. 1). Выраженность действия комбинированной терапии гимантаном значимо превышала выраженность анальгетического действия комбинированной терапии диклофенаком в 1-е сутки после операции (p<0,05, критерий Манна—Уитни) (см. табл. 1).

Значимое снижение тепловой послеоперационной гипералгезии у крыс зарегистрировано только при комбинированном применении изучаемых средств. Так, использование гимантана при наружном нанесении в виде 5% геля и при внутрибрюшинном введении в дозе 10 мг/кг снижало тепловую гипералгезию у животных на 2-е сутки после операции на 46,6% по сравнению в контрольной группой. Диклофенак натрия значимо уменьшал тепловую гипералгезию по сравнению с контрольной группой на 69,6% и 44,1%, соответственно в 1-е и на 2-е сутки после операции (см. табл. 2). При этом чувствительность контралатеральной прооперированной задней лапы (правой) крыс к механическому и тепловому воздействию значимо не изменялась по сравнению с соответствующими значениями за сутки до операции во всех опытных группах во все дни регистрации (табл. 3, 4). Однако следует отметить, что в контрольной группе значения медианы числа отдергиваний правой задней лапы при ее механической стимуляции на 1—4-е сутки после операции соответствовали 0,5—1,5, а в группах крыс, получавших гимантан при всех изучаемых схемах и диклофенак при наружном и комбинированном применении, они были равны 0.

Таблица 3. Влияние гимантана и диклофенака при внутрибрюшинном введении, наружном и комбинированном применении (накожное нанесение гелей и введение внутрибрюшинно) на механическую чувствительность контралатеральной прооперированной задней лапы крыс с моделью послеоперационной боли

Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей; n — число крыс в группе. * — p<0,05 по сравнению с группой контроля, критерий Манна—Уитни.

Таблица 4. Влияние гимантана и диклофенака при внутрибрюшинном введении, наружном и комбинированном применении (накожное нанесение гелей и введение внутрибрюшинно) на тепловую чувствительность контралатеральной прооперированной задней лапы крыс с моделью послеоперационной боли

Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей; n — количество животных в группе

Масса крыс с моделью послеоперационной боли на 1—4-е сутки после операции во всех опытных группах значимо не отличалась от соответствующих значений, зафиксированных за сутки до нее (значения медианы массы животных за сутки до операции в группах соответствовали 289—316 г). Это характеризует развившуюся послеоперационную боль у животных как боль слабой выраженности, при которой не снижается потребление ими пищи и воды, что наблюдается при более болезненных хирургических манипуляциях, например при лапаротомии, после которой масса тела животных снижается [14].

Обсуждение

Острая послеоперационная боль у крыс вызвана сенситизацией ноцицепторов при нарушении целостности тканей. На первичных афферентных нейронах экспрессируется TRPV1 (transient receptor potential cation channel subfamily V member 1), ионный канал, который рассматривается интегратором болевых стимулов. Его стимуляция агонистами, теплом и протонами приводит к выделению провоспалительных нейропептидов, в том числе вещества P и кальцитонин-ген-связанного пептида, что запускает каскад нейрогенного воспаления [15]. Медиаторы, выделяемые поврежденными тканями и участвующими в развитии воспаления клетками, снижают порог чувствительности ионного канала TRPV1 путем разных посттрансляционных механизмов, и за счет этого усиливают боль [16].

На периферии глутаматный NMDA-рецептор способен взаимодействовать с ионным каналом TRPV1 в каскадах кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы типа II (CaMKII) и протеинкиназы C (PKC), а введение AMG9810, антагониста ионного канала TRPV1, подавляет вызванную NMDA (N-метил-D-аспарагиновой кислотой) механическую гипералгезию у крыс [17]. Известно, что блокаторы NMDA-рецептора гимантан и МК-801 при накожной аппликации, системном (внутрибрюшинном для гимантана и подкожном для МК-801) и подкожном интраплантарном введении снижают длительность реакции у мышей, вызванной стимуляцией ионного канала TRPV1 подкожным введением его экзогенного агониста капсаицина [18]. Блокаторы ионотропных NMDA и AMPA (α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты) и метаботропных mGluR1 глутаматных рецепторов при введении в плантарную область крыс снижают вызванную капсаицином термическую гипералгезию [19]. Однако в отсутствие действия экзогенного агониста ионного канала TRPV1 неконкурентный блокатор NMDA-рецептора MK-801 и конкурентыный блокатор NMDA-рецептора AP-5 при интратекальном введении крысам оказывают дозозависимый анальгетический эффект в отношении механической гипералгезии (метод Randall-Selitto), и только AP-5 способен снижать выраженность термической гипералгезии, вызванной введением полного адъюванта Фрейнда в заднюю лапу крыс [20]; блокатор NMDA-рецептора [Ser¹]histogranin подавляет механическую гипералгезию (метод Randall—Selitto), но не термическую гипералгезию при вызванном полным адъювантом Фрейнда воспалении [21].

Диклофенак натрия при пероральном введении в дозе 10 мг/кг, но не 1 мг/кг способен подавлять формалиновую боль у крыс в обусловленную действием альгогена на ионный канал TRPA1 острую фазу [22] за счет влияния на ионный канал TRPV1, так как известно, что данный НПВП снижает выраженность механической и тепловой гипералгезии, вызванной активацией этого канала [23]. Ионный канал TRPA1 соэкспрессирован с ионным каналом TRPV1 [24], и антагонисты ионного канала TRPV1 могут угнетать выраженность болевого поведения крыс в острую фазу формалиновой боли [25].

Диклофенак натрия ингибирует ЦОГ-1 и ЦОГ-2, экспрессия которой возрастает при воспалении, за счет чего снижает продукцию простагландинов в очаге воспаления и вызываемую ими сенситизацию ноцицепторов. Гимантан при остром экссудативном воспалении не влияет на повышенную экспрессию ЦОГ-2, но снижает повышенную активность фосфолипазы А2 [26], а следовательно, продукцию субстрата ЦОГ, арахидоновой кислоты, и, соответственно, обеспечивающих развитие воспалительной реакции простагландинов и лейкотриенов [27].

В проведенном нами исследовании гимантан и диклофенак при применении только в виде гелей или только при внутрибрюшинном введении значимо снижали выраженность механической гипералгезии, развившейся за счет стимуляции низкопороговых механорецепторов кожи, но не тепловой гипералгезии. Возможно, для проявления анальгетического эффекта гимантана и диклофенака при их использовании в виде гелей или при введении внутрибрюшинно в подошвенном тесте у крыс с моделью послеоперационной боли требуется их большая концентрация в поврежденных тканях. Подобные результаты описаны для НПВП мелоксикама с замедленным высвобождением при подкожном введении и капрофена при наружном применении в виде геля на этой же модели послеоперационной боли у крыс [13]. В проведенном исследовании способность влиять на тепловую гипералгезию зафиксирована только при комбинированном использовании гимантана и диклофенака при их наружном применении и внутрибрюшинном введении. Вероятно, этот эффект при комбинированном применении средств развивается за счет их комплексного воздействия, локализованного как в зоне повреждения тканей, так и в вышележащей области.

Заключение

Низкоаффинный неконкурентный блокатор глутаматного NMDA-рецептора гимантан снижает механическую послеоперационную гипералгезию у крыс при наружном применении (5% гель), внутрибрюшинном введении (10 мг/кг) и комбинированном применении наружно (5% гель) и внутрибрюшинно (10 мг/кг), по эффективности он не уступает диклофенаку (5 мг/кг, 1% гель).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.