Ишемия головного мозга и запускаемые ею патологические процессы в виде воспаления, эксайтотоксичности, гибели нейронов путем апоптоза или некроза ассоциированы с длительными нарушениями экспрессии генов, что в свою очередь приводит к морфофункциональным изменениям нервной ткани и неврологической дисфункци [1, 2]. При этом отклонения от нормы в экспрессии генов часто связаны с эпигеномными изменениями, которые могут включать изменения уровня и паттерна метилирования ДНК, посттрансляционных модификаций гистонов, некодирующих миРНК, а также степени компактизации хроматина [2, 3].
При исследовании роли эпигенетических механизмов в патогенезе ишемии-реперфузии головного мозга основное внимание уделяется анализу метилирования ДНК как на генном, так и на геномном уровнях, что было ранее описано в ряде работ, где при ишемическом повреждении обнаружено как гипо-, так и гиперметилирование ДНК в зависимости от исследуемого участка генома (гена), варианта молекулярно-генетического анализа и типа экспериментальной модели [4].
Сегодня в клинических исследованиях прямое определение воздействия ишемии-реперфузии на метилирование ДНК в структурах головного мозга пациентов является невыполнимой задачей. Это обусловлено несколькими причинами. Во-первых, данный процесс зависит от продолжительности неблагоприятного воздействия и момента забора материала для анализа. Во-вторых, от типа поврежденных/анализируемых клеток. В-третьих, у пациентов доступным прижизненным биологическим материалом для анализа являются только лейкоциты периферической крови. При этом проводимый в данном случае молекулярный анализ не дает информации об эпигенетических изменениях в нейронах головного мозга. Такого рода исследования позволяют говорить о наличии ассоциации между ишемическим инсультом и конкретным эпигенетическим изменением в лейкоцитах крови как о потенциальном биомаркере ишемического/постишемического повреждения головного мозга [2, 3, 5]. В-четвертых, исследования, проводимые на ткани головного мозга человека post vivo, единичны [6, 7] и имеют свои ограничения, связанные с продолжительностью сохранения эпигенетических меток, ассоциированных с ишемическим, а не некротическим повреждением головного мозга [8]. В связи с этим является актуальным моделирование различных типов церебральной ишемии у лабораторных животных.
К настоящему времени в подавляющем большинстве экспериментальных исследований уровень полногеномного метилирования ДНК оценивали в коре только при моделировании фокальной ишемии, при которой повреждение тканей локализуется лишь в одной области головного мозга [4]. В то же время, учитывая динамический характер эпигенетических модификаций, представляет особый интерес изучение метилирования ДНК в филогенетически и онтогенетически разных областях головного мозга как в норме, так и при моделировании других типов ишемического повреждения.
Цель исследования — количественная оценка полногеномного метилирования ДНК в обонятельных луковицах, лобно-теменной и затылочной областях, мозжечке у самцов крыс линии Wistar в норме и при моделировании неполной ишемии головного мозга, вызванной постоянной билатеральной окклюзией общих сонных артерий.
Материал и методы
Исследование выполнено на соматически здоровых самцах крыс линии Wistar массой тела 287±15 г и одинакового возраста (5 мес) (ФГУП «ПЛЖ «Рапполово», Россия), разделенных на экспериментальные группы: 1) «Ложная операция» (n=7); 2) «Ишемия мозга» (n=16) — крысы, у которых моделировали неполную ишемию головного мозга постоянной билатеральной окклюзией общих сонных артерий (ОСА) (рис. 1, а). Животных наркотизировали хлоралгидратом (450 мг/кг, в/б). При такой модели церебральной ишемии изменение кровотока в головном мозге отмечается от 2,5 ч до 6 мес после окклюзии ОСА. Наибольшее снижение — от 35 до 60% от контрольных значений мозгового кровотока — регистрируется в корковых областях переднего мозга, белом веществе и гиппокампе в острую фазу ишемии, которая длится 5—7 дней, в зависимости от линии, массы, возраста самцов крыс и примененного наркоза [9, 10]. Формирующаяся при этом ишемия приводит к морфологическим изменениям нервной ткани в обонятельных луковицах, лобно-теменной области коры, гиппокампе, белом веществе [9—11]. Поэтому для сравнительного анализа уровня полногеномного метилирования ДНК нами были выбраны 7-е сутки от начала ишемии и исследовались фрагменты из ишемизированнных (обонятельные луковицы, лобно-теменная область), частично ишемизированных (затылочная область) и неишемизированных (мозжечок) участков головного мозга (см. рис. 1).
Рис. 1. Схемы артериального кровоснабжения (а) и межполушарной асимметрии уровня полногеномного метилирования CCGG сайта (б) в головном мозге самцов крыс при моделировании неполной церебральной ишемии (после постоянной перевязки обеих общих сонных артерий).
Lf — левые отделы мозга; Ri — правые отделы мозга; mC — метилированные CCGG сайты; ↑ или ↓ — повышение или снижение уровня метилирования ДНК по сравнению с контрольными крысами, ≈ — отсутствие различий; x — кратность различий между сравниваемыми группами; p — уровень значимости.
Через 7 сут оценивали летальность, неврологический статус [11, 12] и осуществляли забор головного мозга для определения уровня метилирования ДНК.
Материалом для определения уровня метилирования ДНК служили фрагменты нервной ткани коры головного мозга из 4 отделов, имеющих филогенетически различные пути происхождения: 1) для обонятельных луковиц забор осуществляли на уровне брегмы от 8,00 до 5,64 мм; 2) для лобно-теменной области — от 5,16 до –1,56 мм; 3) для затылочной области — от –4,68 до –6,96 мм; 4) для мозжечка — от –10,08 до –13,56 мм [13].
Геномную ДНК выделяли методом хлороформной экстракции (без фенола) с использованием протеиназы К (BIORON) и РНКазы А (AppliChem). Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически (NanoDrop 2000c, «Thermo Fischer Scientific»). Все исследуемые образцы были стандартизированы по концентрации ДНК (50 нг/мкл).
Уровень полногеномного метилирования ДНК определяли с помощью метилчувствительной рестрикции с использованием программного обеспечения ImageJ для денситрометирического измерения полученных электрофореграмм агарозных гелей [14—17]. Ферментативный гидролиз ДНК проводили метилчувствительными эндонуклеазами MspI и HpaII, следуя рекомендациям производителя («Thermo Fischer Scientific»). Для исследуемых образцов устанавливали относительный уровень метилирования ДНК, выраженный в процентах, используя уравнение квадратичной регрессии, полученное на основе анализа стандартных образцов с известным уровнем полногеномного метилирования ДНК («Zymo Research»). Для каждого исследуемого образца было сделано минимум по 3 повторения. При денситрометрии электорфореграмм агарозных гелей в программе ImageJ делали по 5 измерений на пробу [15—17].
Все эксперименты выполняли в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996 г.) и с требованиями документа «Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 №51 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Животные содержались в стандартных условиях вивария.
Статистическую обработку данных проводили с использованием открытых Интернет-ресурсов. Выборки были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро—Уилка. Сравнение выборок проводили с помощью непараметрических критериев Краскела—Уоллиса (H), Манна—Уитни (U) и критерия Фишера (F). Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Все ложнооперированные крысы к концу 7-х суток эксперимента были живы и не имели выраженных неврологических нарушений, коэффициент неврологического дефицита составил 0,43 (min 0 — max 1). У этих животных не было выявлено статистически значимых межполушарных и межструктурных различий по уровню полногеномного метилирования CCGG сайтов во всех 4 исследованных областях головного мозга. Уровень метилирования ДНК у них находился в пределах 79—85% в зависимости от исследуемого участка головного мозга (рис. 2).
Рис. 2. Относительный уровень полногеномного метилирования CCGG сайтов в различных отделах головного мозга крыс в норме и при неполной ишемии головного мозга.
Данные представлены как медиана (поперечная линия внутри ящика), среднее (точка внутри ящика), 1-й и 3-й квартили, максимальное и минимальное значения (Me, M, Q1, Q3, max, min)
В группе «Ишемия мозга» к концу 7-х суток летальность составила 56,3% (n/N=9/16; 95% ДИ 33,2—76,90) и была статистически значимо выше, чем в группе «Ложная операция» (F=0,01894, p<0,05). У выживших животных отмечались признаки выраженных неврологических нарушений. По сравнению с крысами группы «Ложная операция» коэффициент неврологического дефицита у самцов с неполной церебральной ишемией составил 14 (min 8 — max 15) (U=0, p<0,01), при этом в тканях головного мозга у этих животных были выявлены изменения уровня полногеномного метилирования ДНК во всех исследованных участках головного мозга (p<0,05). Уровень метилирования ДНК находился в пределах 72—88% в зависимости от исследуемого участка головного мозга (см. рис. 1, б, 2). Так, по сравнению с крысами группы «Ложная операция» повышение уровня полногеномного метилирования ДНК у животных группы «Ишемия мозга» было обнаружено в участках левой (U=121, n1=25, n2=25, p<0,001) и правой (U=47, n1=25, n2=21, p<0,001) обонятельных луковиц, коре лобно-теменной области правого полушария (U=226, n1=25, n2=30, p=0,013), коре затылочной области левого полушария головного мозга (U=190, n1=30, n2=21, p=0,031). При этом в коре затылочной области правого полушария (U=398, n1=21, n2=23, p<0,001), а также в левой (U=314, n1=21, n2=21, p=0,002) и правой (U=382, n1=21, n2=21, p<0,001) долях мозжечка, наоборот, наблюдалось снижение уровня метилирования ДНК. В то же время в лобно-теменной области левого полушария не было обнаружено статистически значимых различий по сравнению с группой «Ложная операция» (U=279, n1=25, n2=21, p=0,508) (см. рис. 2). Следует отметить, что в отличие от контрольной группы у крыс с неполной церебральной ишемией были выявлены статистически значимые различия между левым и правым полушариями в уровне метилирования ДНК в лобно-теменной, затылочных областях мозга и коры мозжечка, за исключением обонятельных луковиц.
Обсуждение
Полученные данные по уровню летальности и показателям неврологической дисфункции у крыс группы «Ишемия мозга», доказывающим факт наличия церебральной ишемии, согласуются с таковыми других исследований, проведенных с использованием этой модели [9—11]. Нами было установлено, что у самцов крыс линии Wistar в норме нет межполушарной асимметрии и межструктурных различий в полногеномном метилировании CCGG сайтов в исследованных фрагментах нервной ткани коры головного мозга (обонятельные луковицы, лобно-теменная и затылочная области, мозжечок). Отсутствие различий по уровню полногеномного метилирования ДНК в тканях головного мозга с различной цитоархитектоникой и морфофункциональными особенностями у контрольных крыс может быть связано с тем, что при нормальном функциональном состоянии для мозга крысы (как целого органа) физиологически выгодно в различных структурах сохранять одинаковый уровень полногеномного метилирования ДНК, но при этом продолжать поддерживать ген/локус- и клетко-специфичные паттерны метилирования ДНК. Следует отметить, что в настоящее время роль полногеномного метилирования ДНК в механизмах функциональной межполушарной асимметрии головного мозга у грызунов остается малоизученной.
Полученные нами результаты по увеличению уровня полногеномного метилирования ДНК в ишемизированных областях головного мозга крыс при неполной ишемии головного мозга согласуются с данными исследований, проведенных ранее на другой экспериментальной модели: при моделировании фокальной ишемии у крыс и мышей [4]. Опубликованных аналогичных работ при моделировании неполной ишемии головного мозга у крыс и мышей в настоящее время нет.
Обнаруженное увеличение уровня полногеномного метилирования ДНК в ишемизированной нервной ткани обонятельных луковиц и коры лобно-теменной области может быть обусловлено de novo метилированием. Последнее может инициироваться образующимися при ишемическом повреждении 8-гидроксигуанином [18] и/или 5-хлорцитозином, который подобен по своей структуре 5-метилцитозину и тем самым индуцирует неправильное метилирование нуклеотидной последовательности ДНК-метилтрансферазами (DNMTs) [19]. Кроме того, DNMTs могут быть вовлечены в метилирование вновь включенного цитозина после репарации повреждений ДНК, возникших при ишемии-реперфузии головного мозга [20].
Известно, что при гипоксии увеличивается экспрессия ДНК-метилтрансфераз, что в свою очередь также приводит к повышению уровня метилирования ДНК [21]. Одновременно с этим гипоксия через изменение паттерна метилирования промотора гена HIF-1α (индуцируемый гипоксией фактор 1-альфа) индуцирует экспрессию этого транскрипционного фактора, который через HIF-чувствительные элементы (HRE) регулирует экспрессию более 100 генов-мишеней, участвующих в энергетическом метаболизме, ангиогенезе, клеточной пролиферации, миграции и инвазии, эритропоэзе, вазомоторных реакциях [22]. В то же время «неправильное» метилирование CpG-островков в HRE может мешать действию HIF-1α. Например, было показано, что гипоксия приводит к увеличению уровня полногеномного метилирования ДНК и связана с повреждением нейронов в области CA1 гиппокампа у крыс [3]. В любом случае, какой бы молекулярный механизм не лежал в основе повышения уровня метилирования ДНК, это приводит к изменению экспрессии генов, что было обнаружено у крыс и мышей при моделировании фокальной ишемии головного мозга [4].
В настоящее время показано, что ишемическое повреждение головного мозга активирует стволовые и глиальные клетки в обонятельных луковицах и гиппокампе, стимулирует клеточное деление, миграцию и дифференцировку клеток [23]. Можно предположить, что этот процесс непосредственно связан с эпигеномными изменениями, в том числе с изменениями уровня метилирования ДНК. Не исключено, что в обонятельных луковицах только в стволовых клетках наблюдается гипометилирование, чтобы активировать гены, участвующие в пролиферации, миграции, дифференцировке и ангиогенезе [22], тогда как в других клетках в ответ на гипоксию, наоборот, преимущественно происходит повышение уровня полногеномного метилирования [21] (что нами и было обнаружено) с целью инактивации генов, активность которых в условиях ишемии может повредить клеткам, способствовать апоптозу и/или некрозу. Кроме того, гипоксия и связанное с ней генспецифическое гиперметилирование стимулируют ангиогенез, например в опухолевых клетках [24], и, по-видимому, аналогичная ситуация имеет место в случае ишемического повреждения головного мозга. Данные предположения требуют дальнейших исследований.
Одним из возможных объяснений межполушарной асимметрии эпигеномной реакции (а именно повышение метилирования в правом полушарии и отсутствие различий в левом полушарии по сравнению с крысами группы «Ложная операция») в ишемизированнной лобно-теменной области является факт существования компенсаторных изменений в ответ на равное ишемическое воздействие для обоих полушарий. Многие функции, свойственные доминантному и субдоминантному полушариям, могут трансформироваться из-за формирования компенсаторных изменений, которые определяются комплементарным механизмом межполушарного взаимодействия, что предполагает определенный вклад каждого полушария в выполняемую функцию [25].
В основе межполушарной (разнонаправленной) асимметрии метилирования ДНК (а именно повышение метилирования ДНК в левом полушарии и снижение — в правом) в случае частично ишемизированной коры затылочной области, которая не подверглась значимому снижению церебрального кровотока, могут лежать межполушарные взаимодействия и механизмы функционального дефицита [9, 10]. Функциональным дефицитом может объясняться и снижение уровня метилирования ДНК в коре полушарий мозжечка, кровообращение которого при моделировании церебральной ишемии путем билатеральной окклюзии ОСА не нарушается. Вероятно, в коре затылочной области при реализации механизмов функционального дефицита происходит (как и в случае лобно-теменной области) трансформация функций, свойственных доминантному и субдоминантному полушариям, из-за компенсаторных изменений.
Повышение уровня метилирования ДНК левого полушария в затылочной области согласуется с результатами исследования, проведенного на модели фокальной ишемии, где было показано повышение уровня полногеномного метилирования ДНК в области коры контралатерального полушария [26]. Реорганизация нейронной сети является основным механизмом, который используется для поддержания функции головного мозга после повреждения. При этом реорганизация нейронной сети после инсульта приводит к возникновению функционального дефицита в остальных областях. Неповрежденная сторона или области могут иметь дополнительную функцию, которая может частично компенсировать утраченные функции, что может отразиться на уровне полногеномного метилирования ДНК. Известно, что после инсультов наблюдаются пластические изменения со стороны непораженной коры к подкорковым эфферентным проекциям корково-спинномозгового пути, отмечается процесс усиленного прорастания и роста аксонов, что способствует функциональному восстановлению [27].
Механизмы адаптивного ответа нервной ткани головного мозга на повреждающие воздействия сложны и до конца не расшифрованы. На фоне гипоксии одни участки генома гиперметилируются, тогда как другие — гипометилируются, что в какой-то мере может определяться уровнем кровотока [21]. Таким образом, различные эпигенетические механизмы совместно организуют процесс эпигеномной реакции клеток на ишемически-реперфузионное повреждение головного мозга, обеспечивая повышенную восприимчивость или, наоборот, устойчивость/резистентность.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют, что в норме у 5-месячных самцов крыс линии Wistar уровень полногеномного метилирования ДНК в обонятельных луковицах, коре лобно-теменной и затылочной областей, а также в мозжечке находится в пределах 79—85%. При этом в исследованных областях головного мозга нет межполушарной асимметрии в уровне полногеномного метилирования ДНК. В то же время у самцов крыс с неполной ишемией переднего мозга на 7-е сутки выявлены как межполушарные, так и межструктурные различия в уровне полногеномного метилирования ДНК в ишемизированных, частично ишемизированных и неишимизированных участках.
При ишемическом и реперфузионном повреждении динамичные процессы метилирования и деметилирования ДНК с учетом межполушарной эпигеномной асимметрии принимают активное участие в компенсаторной регуляции транскрипции генов в поврежденном мозге, что необходимо для восстановления его нормального функционирования. Очевидно, что эпигенетическое перепрограммирование паттернов экспрессии генов непосредственным участием метилирования ДНК играет центральную роль в определении функционального (фенотипического) выхода информации в ответ на ишемический стресс и имеет решающее значение в формировании тяжести и прогрессирования ишемического повреждения, а также в процессах восстановления неврологических функций, поскольку именно динамичная природа процесса метилирования ДНК в ткани мозга придает пластичность нейронной функции.
Дальнейшие исследования с использованием различных моделей ишемии головного мозга и методов анализа эпигенетических модификаций на животных разных видов, линий, возрастов и полов позволят лучше понять роль эпигенетических механизмов в ишемическом и реперфузионном повреждении и будут способствовать разработке новых лекарств и терапевтических подходов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.