Список сокращений

ГБ — глиобластома

EGFR — рецептор эпидермального фактора роста

Гр — Грей (единица измерения)

МэВ — мегаэлектронвольт (единица измерения)

AV — аннексин V

PI — пропидия йодид

HGG — (high-grade glioma) глиома высокой степени злокачественности

Введение

Глиобластома (ГБ) Grade IV является распространенной первичной злокачественной опухолью головного мозга высокой степени злокачественности (HGG). Возникает у взрослых, прогноз неблагоприятный. Несмотря на современный уровень знаний о генетических характеристиках ГБ, в улучшении лечения пациентов с этим смертельным заболеванием достигнут относительно небольшой прогресс [1]. Средняя выживаемость составляет 12—18 мес [2]. Известные варианты лечения недостаточны, а их побочные эффекты значительно снижают качество жизни [3].

Лучевая терапия определена как важнейший метод лечения ГБ после хирургической резекции, позволяющий улучшить выживаемость. К сожалению, у пациентов с ГБ часто наблюдается резистентность к лучевой терапии, что является основной причиной высокой смертности. Радиорезистентность ГБ часто бывает многофакторной и гетерогенной, связана с рецидивом ГБ после хирургического вмешательства [4]. Основная задача в улучшении диагностики и лечения ГБ заключается в разработке таргетной платформы визуализации и доставки лекарств, способной обходить гематоэнцефалический барьер и специфически воздействовать на опухолевые клетки.

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) считается одним из основных маркеров ГБ, он представляет собой рецепторную тирозинкиназу, обычно активирующуюся при онкологическом заболевании, в частности при ГБ [3]. Связывание лиганда с EGFR запускает каскад реакций, влияющих на клеточный рост, выживаемость, адгезию, миграцию и дифференцировку, поэтому EGFR считается важной мишенью в противоопухолевой терапии [5].

Одним из наиболее эффективных подходов в лечении злокачественных опухолей считается использование молекулярных агентов, способных избирательно подавлять ключевые функции в развитии злокачественных клеток. Поскольку гиперэкспрессия рецептора EGFR характерна для многих типов опухолей, выбор в качестве мишени EGFR и связанных с ним сигнальных путей представляет собой перспективную стратегию терапии. На сегодняшний день идентифицирован ряд специфичных аптамеров, нацеленных на EGFR [5]. Уникальные свойства аптамеров демонстрируют их способность заполнить пробел в разработке успешных вариантов диагностики и лечения, если антитела ранее не помогали. Аптамеры обладают многими характеристиками, которые делают их идеальным новым средством визуализации и лечения ГБ и других злокачественных новообразований головного мозга, и, вероятно, обеспечат пациентам более высокий уровень медицинской помощи и улучшение качества жизни. Селективность, простота модификации и низкая иммуногенность делают их идеальными агентами для доставки лекарств [6]. Все эти качества позволяют надеяться на огромный потенциал аптамеров при лечении ГБ. Первое и единственное на сегодняшний день клиническое исследование с использованием аптамера NOX-A12 у пациентов с ГБ показало многообещающие результаты. Лечение хорошо переносилось участниками исследования, не было токсических эффектов, ограничивающих дозу, или смертельных исходов, связанных с лечением [7].

Поставлена задача разработки нового аптамера, способного специфически распознавать рецептор EGFR, с повышенной аффинностью связывания с мишенью. Такой аптамер представляет интерес для детекции и визуализации клеток, экспрессирующих EGFR, а также для целевой доставки в них лекарственных соединений. С целью получения нового варианта с улучшенными характеристиками ранее создан GR20, укороченный аналог аптамера U31, путем удаления 5’- и 3’-концевых последовательностей (1—10 и 57—76) и замены 16G на 16C. Данная модификация приводит к увеличению длины дуплексного участка с 5 до 8 пар нуклеотидов и его стабилизации, как описано ранее [8, 9]. На его основе сконструирован еще один аптамер, GR200, путем дополнительного добавления двух GC-пар и проведения однонуклеотидной замены в стеблевой области.

Подобно исходному аптамеру GR20, GR200 демонстрирует вторичные структуры: одну с минимальной энергией и другую, содержащую развернутую короткую шпильку с тремя разорванными AT-парами [8].

Важным моментом проводимого нами исследования является использование не линейных клеток (клеточных линий), а клеточных культур, полученных непосредственно из опухолевой ткани ГБ человека, G22 и Sus\fP2 [10—12], что позволяет получать результаты, приближенные к реальной картине воздействия на опухоль.

Цель исследования — выполнить анализ жизнеспособности клеточных культур ГБ человека G22 и Sus\fP2 при воздействии аптамеров U31, GR20 и GR200 и комбинированного влияния этих аптамеров в сочетании с лучевой терапией (20 Гр).

Материал и методы

Клеточные культуры

В эксперименте использованы перевиваемые культуры клеток ГБ мозга человека G22 и Sus\fP2, полученные из образцов опухолевой ткани пациентов, предоставленных ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России [10—12].

Получение перевиваемых культур клеток

Образец опухоли, полученный от пациента, помещали в чашку Петри с холодным раствором Хенкса (Gibko, Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США) для очистки от кровеносных сосудов, оболочек, областей некроза при их наличии. Затем его измельчали и переносили в 15-миллилитровую пробирку, убирали раствор Хенкса и добавляли 0,25% раствор трипсина (Gibko, Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США). После повторного отмывания помещали на шейкер при 37 оС на 20 мин до размягчения ткани. Далее добавляли среду DMEM/F12 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibko, Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США) в соотношении 1:1, после чего осаждали центрифугированием и удаляли жидкость. Диссоциацию ткани проводили в холодном растворе Хенкса, добавляя его в пробирку и ресуспендируя ткань стеклянной пипеткой. Взвесь образовавшихся клеток переносили в чистую пробирку. К оставшейся ткани вновь добавляли раствор Хенкса. Взвесь клеток процеживали через нейлоновое ситечко для клеток с размером ячеек 40 мкм (Corning Inc., США) в 50-миллилитровую пробирку и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Отбирали жидкость, добавляли культуральную среду и рассевали на флаконы для дальнейшей культивации.

Культивирование клеток

Культивацию клеток проводили в ростовой среде DMEM/F12 с пируватом натрия с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibko, Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США), 1% раствора HEPES (Sigma-Aldrich, США), 1% раствора GlutaMAX и 1% раствора пенициллина/стрептомицина/амфотерицина (Gibko, Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США). При пересеве клетки снимали 0,25% раствором трипсина, после отмывки фосфатно-солевым буфером PBS (Gibko, Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США). Реакцию трипсина останавливали добавлением 1 мл ростовой среды. Клетки центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Жидкость убирали, добавляли свежей среды и в зависимости от задачи клетки пересевали в новые флаконы для дальнейшего культивирования или использовали в эксперименте.

Облучение клеточных культур и протокол добавления аптамеров

Для проведения эксперимента на флаконы с площадью культивирования 25 см² рассевали клетки в количестве 1,5⋅10⁵. Для радиологического воздействия на клетки использовали вертикальное тормозное излучение на приборе TrueBeam STx (Varian Medical Systems, Inc., США) в режиме: номинальная энергия 6 МэВ, мощность 600 доз/мин. Клеточные культуры были однократно облучены дозой 20 Гр. Через 72 ч после облучения в культуральную среду добавлены аптамеры U31, GR20, GR200 в конечной концентрации 10 мкМ. После добавления флаконы с клетками инкубировали еще 72 ч в СО₂-инкубаторе CB 150 (Binder, Германия) при 5% СО₂ и 37°C. В контрольные флаконы добавляли аптамеры без предварительного облучения. В качестве полного контроля использовали клетки, не подвергавшиеся никаким воздействиям.

Проточная цитофлуориметрия

После окончания культивирования клетки снимали раствором трипсина, промывали PBS и ресуспендировали в 500 мкл 1× связывающего буфера. Клетки окрашивали 5 мкл антител против аннексина V-FITC (AV) и 5 мкл йодида пропидия (PI) при комнатной температуре в темноте 15 мин. Полученные образцы анализировали методом проточной цитофлуориметрии (CytoFLEX S, Beckman Coulter, Inc., США).

Результаты

Культуры клеток глиобластомы, полученные из опухолей человека

Эксперименты проводились на двух клеточных культурах, полученных от пациентов с супратенториальной ГБ человека G22 и Sus\fP2 [10—12] (таблица).

Культуры клеток глиобластомы человека, полученные от пациентов после резекции опухоли

Перевиваемая культура клеток ГБ человека Sus\fP2 (рис. 1) получена из опухоли пациентки 60 лет. Головная боль и амнестические расстройства у нее появились и прогрессировали в течение 2 нед, при проведении круговой магнитно-резонансной томографии (МРТ) в левой височной доле обнаружено обширное поражение, после чего было выполнено субтотальное удаление опухоли. Секвенирование по Сэнгеру выявило дикий тип IDH1/2 [12].

Рис. 1. Клетки культуры глиобластомы человека Sus\fP2.

Перевиваемая культура клеток ГБ человека G22 [10, 11] (рис. 2) получена из опухоли пациентки 36 лет с диагнозом продолженного роста опухоли левой лобной доли, распространяющейся в мозолистое тело и межжелудочковую перегородку, обнаружена при проведении круговой МРТ, после чего выполнено субтотальное удаление опухоли. Секвенирование по Сэнгеру выявило дикий тип IDH1/2.

Рис. 2. Клетки культуры глиобластомы человека G22.

Оценка влияния аптамеров U31, GR20 и GR200 на жизнеспособность клеточных культур глиобластомы человека G22 и Sus\fP2

В клеточной культуре ГБ G22 в зависимости от типа аптамера, который добавлен в культуральную среду (U31, GR20, GR200), наблюдалось снижение доли живых клеток (U31 — 31,2%, GR20 — 41,3%, GR200 — 25,7%) по сравнению с состоянием контрольных клеток (G22 без воздействия). При анализе типа гибели опухолевых клеток глиобластомы с использованием проточной цитофлуориметрии обнаружено, что при использовании аптамеров GR20 и GR200 в клетках G22 наблюдается усиление двух типов гибели: апоптоза и некроза. Число клеток, перешедших в состояние некроза после использования аптамеров: GR20 — 88,7%, GR200 — 55,7%; при этом также наблюдается усиление апоптотической гибели. Использование аптамера U31 повышает некротический тип гибели опухолевых клеток на 67,5%, но при этом существенно снижает способность клеток глиобластомы к апоптозу — на 45,8%, что является негативной характеристикой (рис. 3).

Рис. 3. Анализ жизнеспособности клеточной культуры глиобластомы человека G22 при воздействии аптамеров U31, GR20 и GR200.

В клеточной культуре глиобластомы человека Sus\fP2 при использовании всех трех аптамеров выявлено значительное увеличение количества клеток в состоянии апоптоза при одновременном снижении доли некроза (рис. 4). Наиболее значительное снижение числа некротизированных клеток наблюдали при добавлении аптамера U31 — на 77,7% от контрольного уровня.

Рис. 4. Анализ жизнеспособности культуры глиобластомы человека Sus\fP2 при воздействии аптамеров U31, GR20 и GR200.

Наиболее привлекательным в качестве антипролиферативного агента оказался аптамер GR20, так как при его воздействии на клетки культуры G22 наблюдается увеличение двух видов гибели — и апоптоза, и некроза, а при воздействии на клетки Sus\fP2 обнаруживается существенное повышение интенсивности апоптоза (на 650%) и снижение интенсивности некроза (на 24,7%).

Аптамер GR200 оказывает наименьшее действие на культуру G22 по сравнению с другими исследованными аптамерами. При его добавлении к культуре наблюдается усиление некроза, а в культуре Sus\fP2 — резкое усиление апоптоза (более чем в 10 раз) и снижение числа клеток в состоянии некроза (на 33,1%).

При сравнении результатов показано, что культуры по-разному отвечают на воздействие и, независимо от аптамера, в культуре G22 усиливается некроз, а в культуре Sus\fP2 преобладает апоптоз. Так как аптамер рассматривается в качестве дополнительного терапевтического агента, повышающего эффективность основной терапии, то в следующем эксперименте решено оценить влияние на жизнеспособность клеток ГБ человека воздействия аптамеров в сочетании с однократным облучением дозой 20 Гр.

Оценка влияния аптамеров U31, GR20 и GR200 на жизнеспособность клеточных культур глиобластомы человека G22 и Sus\fP2 после однократного облучения дозой 20 Гр

Монослой клеток глиобластомы облучали дозой 20 Гр с последующим воздействием одного из аптамеров (U31, GR20, GR200). После однократного облучения дозой 20 Гр и при добавлении в культуральную среду аптамера U31 в клеточной культуре глиобластомы G22 наблюдали усиление апоптоза и некроза на 59,4% и 57,7% соответственно. Добавление аптамера GR20 не привело к изменению состояния апоптоза, при этом на 28,3% увеличилось число клеток в состоянии некроза. Под действием аптамера GR200 выявлено увеличение апоптоза более чем в 2 раза и некроза на 38,1% (рис. 5).

Рис. 5. Анализ жизнеспособности клеточной культуры глиобластомы человека G22 при облучении дозой 20 Гр с последующим добавлением U31, GR20 и GR200.

При аналогичном воздействии на клеточную культуру ГБ Sus\fP2 аптамера U31 после облучения дозой 20 Гр происходит увеличение доли апоптоза на 132,9% и некроза на 52,9%. При добавлении аптамера GR20 выявлено увеличение числа клеток в состоянии апоптоза на 125,4% и снижение количества клеток в состоянии некроза на 17,7%. После добавлении аптамера GR200 в культуре Sus\fP2 наблюдается усиление апоптоза и некроза на 27,4% и 30,6% соответственно (рис. 6).

Рис. 6. Анализ жизнеспособности клеточной культуры глиобластомы человека Sus\fP2 при облучении дозой 20 Гр с последующим добавлением U31, GR20 и GR200.

Обсуждение

Лучевая терапия по-прежнему является наиболее распространенным методом лечения многих типов опухолей. Около 50% всех больных получают лучевую терапию, что составляет 40% всех методов лечения рака [13]. Однако после лучевой терапии остаются устойчивые опухолевые клетки, дающие начало агрессивному рецидиву. Очевидно, что необходим поиск наименее токсичных для непатологических клеток организма молекул, которые будут повышать эффективность воздействия на опухолевые клетки. Комбинированное воздействие становится достаточно популярным. Аптамеры представляют собой идеального кандидата для воздействия на глиобластому благодаря легко структурированной природе, малому размеру и способности легко проникать через гематоэнцефалический барьер и таргетно достигать опухоли в головном мозге [14]. Мы использовали линейку аптамеров, специфичных к рецептору EGFR: U31, GR20 и GR200 [8, 9].

При сравнении полученных данных с помощью проточной цитофлуориметрии выявлены дифференцированные воздействия аптамеров U31, GR20 и GR200 на жизнеспособность клеток ГБ человека G22 и Sus\fP2. Такие же различия обнаружены и при комбинированном воздействии аптамеров после однократного облучения клеток дозой 20 Гр. В клеточной культуре ГБ человека G22 добавление аптамера U31 привело к снижению доли живых клеток и уровня апоптоза, однако увеличило количество клеток, перешедших в состояние некроза. В отличие от U31 аптамеры GR20 и GR200 повышают и некротические, и апоптотические процессы. В клеточной культуре ГБ человека Sus\fP2 после добавления аптамеров U31, GR20 и GR200 во всех образцах наблюдалось значительное увеличение количества клеток, перешедших в состояние апоптоза при одновременном снижении доли некроза. Наиболее значительное снижение числа некротизированных клеток наблюдали при добавлении аптамера U31. Вместе с тем аптамеры GR20 и GR200 оказывали оптимальное воздействие на стимулирование гибели клеток благоприятным апоптотическим путем.

При комбинированном воздействии на клеточную культуру ГБ человека G22 облучения и аптамеров наблюдались следующие эффекты: сочетание радиации с U31 или GR200 вызывало рост интенсивности апоптоза и некроза, в то же время комбинация облучения с GR20 не оказывала существенного влияния на содержание апоптотических клеток, но повышала долю некротических клеток.

При комбинированном воздействии на клеточную культуру ГБ человека Sus\fP2 облучения и аптамеров наибольшая эффективность выявлена при добавлении аптамера GR20, он не только усиливал апоптоз более чем в 2 раза, но и снижал уровень некроза по сравнению с другими аптамерами.

Различия ответной реакции опухолевых клеток ГБ разных пациентов говорит о важности разработки терапевтических препаратов именно на основе клеточных культур опухолей заданной нозологии, прошедших небольшое количество пассирований и имеющих схожий гетерогенный профиль с исходной опухолью. Использование однообразных клеточных линий, подобных U87 или U251, для поиска новых способов терапевтического воздействия может показывать оптимистические результаты in vitro и in vivo, но приводить к неудаче на стадии II фазы клинических испытаний ввиду существенного отличия собственно опухолей от линейных клеток.

Не менее важным результатом можно считать то, что необходим индивидуальный подход к каждой опухоли пациента. Персонализированная медицина позволит существенно улучшить терапевтическое воздействие на опухоль. Например, в нашем случае очевидно, что на опухоль Sus\fP2 оптимальным является воздействие лучевой терапии в сочетании с введением аптамера GR20, а на опухоль G22 — либо единичное воздействие аптамера U31, либо комбинированное с использованием лучевой терапии и аптамера GR200.

Заключение

В результате эксперимента обнаружили, что аптамеры по-разному влияют на клеточные культуры глиобластомы человека G22 и Sus\fP2, полученные из опухолевой ткани пациентов. Для опухоли Sus\fP2 оптимальным является воздействие лучевой терапии в сочетании с введением аптамера GR20, а для опухоли G22 — либо единичное воздействие аптамера U31, либо комбинированное воздействие с использованием лучевой терапии и аптамера GR200. Полученный результат показывает важность разработки комбинированного воздействия с использованием аптамера и лучевой терапии, а также важность предварительных исследований на клеточных культурах опухолей пациентов для разработки индивидуального подхода к каждой опухоли центральной нервной системы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Павлова Г.В., Савченко Е.А., Голанов А.В.

Сбор и обработка материала — Слиман Я.А., Павлова С.А., Савченко Е.А., Самойленкова Н.С., Овечкина А.В., Демьянович А.В., Усачев Д.Ю., Павлова Г.В.

Статистическая обработка — Слиман Я.А., Павлова С.А., Антипина Н.А.

Написание текста — Слиман Я.А., Павлова С.А., Павлова Г.В.

Редактирование — Павлова Г.В.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2024-561).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

В статье приводятся важные данные об анализе изменений в клеточных культурах глиобластомы человека. Показана перспективность воздействия на клетки глиобластомы новых препаратов — ДНК-аптамеров U31, GR20, GR200 и их комбинации с лучевой терапией. Данное экспериментальное исследование имеет большое значение для разработки новых методов лечения опаснейшего заболевания. Особенно ценным является использование в исследовании культур клеток, полученных из тканей опухолей пациентов. Дизайн исследования адекватен поставленной задаче и позволяет сделать хорошо обоснованные выводы касательно возможности применения испытанных комбинаций воздействий для терапии глиобластомы. Список литературы отражает современное состояние проблемы и позволяет судить о значимости результатов. Резюме имеет четкую структуру и достаточно полно отражает существо проделанной работы. В качестве рекомендации могу посоветовать авторам указать в методике примерное количество клеток, используемых при анализе на проточном флуориметре.

А.В. Ревищин (Москва)