Список сокращений

CD133 — трансмембранный белок, поверхностный антиген

ОСК — опухолевые стволовые клетки

ГБ — глиобластома

CHO-K1 — линия клеток яичника китайского хомячка.

Cy2 — цианин-2, флуоресцентный краситель

FAM — амидит флуоресцентного красителя, карбоксифлуоресцеина

FBS — Fetal Bovine Serum, эмбриональная бычья сыворотка

DMEM/F12 — среда DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) с добавлением среды F12 в соотношении 1:1

PBS — фосфатный буферный раствор, pH=7,4

DAPI — 4’,6-диамидино-2-фенилиндол, флуоресцентный краситель синей области спектра, окрашивающий ядерную ДНК

Введение

Впервые белок CD133 был идентифицирован четверть века назад в двух независимых исследованиях нейроэпителиальных клеток мыши и гемопоэтических стволовых клеток человека [1, 2]. Показано, что CD133 обнаруживается в нейроэпителии, локализован в микроворсинках на апикальной поверхности различных эпителиальных клеток, в том числе эпендимального слоя мозга [1]. Второе исследование позволило идентифицировать CD133 в качестве маркера гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток костного мозга и крови [2]. Хотя функции CD133 все еще не определены, присутствие этого мембранного белка на плазматических мембранных выступах и выявление мутации в гене CD133 человека, которая препятствует его появлению на поверхности клеток, привело к предположению, что CD133 является организатором плазматических мембранных выступов [3].

Известно, что ген CD133 человека расположен на хромосоме 4 и содержит не менее 37 экзонов [4]. Транскрипция гена определяется пятью тканеспецифичными альтернативными промоторами, что приводит к образованию различных сплайсинг-изоформ мРНК [5]. Идентифицировано несколько сплайсинг-вариантов CD133 с альтернативными цитоплазматическими C-концами [6]. Белок CD133 содержит пять трансмембранных доменов, два больших гликозилированных внеклеточных домена размером 250 аминокислотных остатков и две внутриклеточные петли размером 30 аминокислотных остатков [7].

Согласно одному из предположений, CD133 может быть маркером нормальных стволовых клеток [8]. CD133 экспрессируется в различных типах стволовых клеток, однако его роль неизвестна. Предполагается, что он может участвовать в ключевых функциях стволовых клеток: способности к самообновлению и мультипотентной дифференцировке. Хотя роль белка до конца не ясна, связь CD133 с сигнальными путями Wnt и Notch предполагает его способность вызывать пролиферацию клеток [9, 10]. Известно, что в опухоли присутствуют клетки, подобные стволовым, — так называемые опухолевые стволовые клетки (ОСК). Предполагается, что CD133 можно использовать как кандидат-биомаркер ОСК [11]. ОСК представляют особый интерес, поскольку способны инициировать опухолевый рост. В последние два десятилетия было показано, что ОСК присутствуют во многих солидных опухолях, в том числе в глиобластоме (ГБ) [12]. Считается, что химиотерапевтические препараты и лучевая терапия неэффективны для уничтожения ОСК. Поэтому обнаружение и направленное подавление ОСК могут рассматриваться в качестве терапевтической стратегии будущего. CD133 представляется хорошим кандидатом для подобной таргетной эрадикации ОСК.

В настоящее время в качестве молекулярных узнающих элементов маркера CD133 используются антитела. Первые полученные антитела к CD133 — AC133 и AC141 (коммерчески доступны как CD133/1 и CD133/2 соответственно) — узнают различные эпитопы, оба антитела узнают гликозилированные эпитопы [13]. Кроме AC133 и AC141, коммерчески доступны антитела, узнающие немодифицированные внеклеточные эпитопы CD133. Предприняты попытки получить антитела к CD133 посредством иммунизации мышей трансфицированными CD133-экспрессирующими клетками человека [14].

Из анализа опубликованных данных по свойствам выделенных CD133-положительных и CD133-отрицательных клеток, выделенных из образцов ГБ пациентов, можно предположить, что существует как минимум два типа ОСК, различающихся по экспрессии CD133 и/или представленности эпитопов CD133. Первый тип популяции ОСК является эпитоп-положительным по CD133; второй — эпитоп-отрицательным по CD133 [15].

Классическим вариантом проведения клинического цитологического анализа является использование антител [16]. Узнавание антителами белка CD133, особенно эпитопа AC133, зависит от функционального состояния клетки (например, альтернативное гликозилирование маскирует этот эпитоп, препятствуя узнаванию антителами) [17], поэтому детекция белка CD133 набором аптамеров для клеток может быть альтернативой применению антител.

Аптамеры — «химические антитела» — представляют собой короткие олигонуклеотиды, высокоаффинно и специфически связывающиеся со своими молекулярными мишенями. К клеткам, экспрессирующим CD133, были отобраны аптамеры, в том числе ДНК-аптамеры AP-1-M [18] и Cs5 [19]. По ряду параметров аптамеры превосходят антитела: аптамеры синтезируют химически, они обладают большей термостабильностью, их качество гораздо проще контролировать, в аптамеры можно эффективно вводить флуоресцентные метки.

Цель исследования — анализ применимости детекции CD133 в клетках перевиваемых культур ГБ пациентов с помощью флуоресцентных аптамеров.

Развитие такого подхода позволит значительно упростить детекцию CD133 для цитологического и в последующем гистологического исследования образцов опухолей ГБ пациентов, и применять его в качестве альтернативы/дополнения стандартному методу иммуноцитохимии, который использует флуоресцентно меченные антитела.

Материал и методы

Реагенты

Нуклеотидные последовательности аптамеров приведены в таблице. Лиофилизованные FAM-модифицированные олигонуклеотиды синтезированы и очищены фирмой АО «ГенТерра» (Россия). Растворы олигонуклеотидов готовили в фосфатно-солевом буфере с добавлением 5 мМ MgCl₂.

В работе использовали мышиные моноклональные антитела к CD133 (MA1-219, «Invitrogen», США). Вторичные антитела к мышиному иммуноглобулину содержали метку Cy2 («Jackson ImmunoResearch», Великобритания).

Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов

Примечание. NADO — неаптамерный олигонуклеотид.

Культивирование перевиваемых культур клеток ГБ

В работе использовали клетки перевиваемых культур, полученные из тканей ГБ пациентов после резекции опухоли. Образцы культур получены в лаборатории молекулярно-клеточной нейрогенетики ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России и закодированы номерами 1548, 1721, 1793. Клетки культивировали во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, при 37 °C в среде DMEM/F12 («ПанЭко», Россия), содержащей 1% L-глутамина, 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки) и 0,1% антибиотика-антимикотика («Biowest», Франция).

Флуоресцентная микроскопия

Культуры клеток высевали в лунки 6-луночных планшетов (10 000 клеток на 1 лунку) и инкубировали в ростовой среде в 5% CO₂ в течение 1 сут при 37°C. К клеткам добавляли раствор аптамера в концентрации 1 мкМ в 50% фосфатном буфере с добавлением 5 мМ MgCl₂ и 50% ростовой среды и инкубировали 30 мин при 4 °C, промывали, фиксировали 4% формальдегидом. Ядра клеток окрашивали раствором DAPI. Готовый препарат клеток хранили в буфере PBS при +4 °C.

Для тестирования культур клеток ГБ человека антителами клетки предварительно фиксировали 4% формальдегидом, мембрану клеток пермеализовали раствором 0,1% Triton X-100. К клеткам добавляли раствор 3% BSA и инкубировали 2 ч при +4 °C. Клетки выдерживали в растворе антител к CD133 MA1-219 (разбавление 1:50) в течение ночи при +4 °C, промывали, после чего инкубировали со вторичными антителами с флуоресцентной меткой Cy2 в разведении 1:100. Ядра клеток окрашивали раствором DAPI.

Визуализацию образцов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа NIB 920 («NexCope», Китай) с использованием фильтров 485 и 365 нм для детекции флуоресценции зеленого свечения FAM-метки аптамера или Cy2-метки антител и флуоресцентного свечения DAPI. Обработку сигналов проводили с помощью ImageJ (NIH, США).

Результаты

Клетки опухоли инкубировали 30 мин при 4 °C, чтобы избежать интернализации комплексов аптамер-CD133 внутрь клетки. В качестве контроля CD133-независимого взаимодействия с клетками использовали неаптамерный ДНК-олигонуклеотид NADO длиной 18 нуклеотидов. На рисунке представлены микрофотографии, полученные после инкубации перевиваемых культур клеток ГБ пациентов с флуоресцентно меченными антителами и олигонуклеотидами.

Окрашивание клеток культур ГБ пациентов 1548 (а, г, ж, к), 1721 (б, д, з, л) и 1793 (в, е, и, м) флуоресцентно меченными антителами и аптамерами.

Зеленый — свечение метки Cy2 или FAM, синий — ядра клеток, окрашенные красителем DAPI. а, б, в — взаимодействие анти-CD133 антител; г, д, е — взаимодействие аптамера AP-1-M-FAM; ж, з, и — взаимодействие аптамера Cs5-FAM; к, л, м — взаимодействие неаптамерного олигонуклеотида NADO-FAM. Масштабная линейка =20 мкм.

Инкубация клеток культур ГБ пациентов 1548, 1721 и 1793 с антителами к CD133 (к фрагменту рекомбинантного белка, аминокислоты 20-208) и последующая инкубация со вторичными антителами с флуоресцентной меткой Cy2 приводит к интенсивному окрашиванию клеток всех исследуемых культур клеток ГБ (см. рисунок, а—в). Наиболее интенсивное свечение метки наблюдается на клетках культуры ГБ пациента 1548.

ДНК-аптамер Cs5-FAM при взаимодействии с клетками перевиваемых культур ГБ продемонстрировал результаты, схожие с данными, полученными для антител. После окраски культуры клеток ГБ 1548 аптамером Cs5-FAM наложение микрофотографий, полученных в каналах флуоресцентного свечения метки аптамера и DAPI, позволяет отметить, что сигнал флюоресценции аптамера Cs5-FAM совпадает с сигналом для ядер клеток (см. рисунок, г). В случае аптамера Cs5-FAM и культуры клеток 1721 зеленый сигнал более слабый (см. рисунок, д). Для культуры клеток 1793 сигнал еще слабее (см. рисунок, е), окраска аптамером Cs5 не имеет четких границ.

ДНК-аптамер AP-1-M-FAM не взаимодействует с клетками культур 1548 и 1721, о чем свидетельствует отсутствие зеленого окрашивания клеток (см. рисунок, ж и з). При наложении сигналов, полученных в каналах флюоресценции аптамера FAM-AP-1-M и DAPI для клеток культуры 1793, отсутствуют четкие границы окрашивания клеток, что может быть связано с низкой представленностью CD133 на поверхности клеток или интернализацией аптамера AP-1-M-FAM внутрь клетки (см. рисунок, и).

Неаптамерный ДНК-олигонуклеотид NADO-FAM не окрашивал перевиваемую культуру клеток ГБ пациента 1548 (см. рисунок, к). Для культуры клеток 1721 уже наблюдается зеленый сигнал флуоресценции NADO-FAM (см. рисунок, л). Наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдалась при окраске NADO-FAM первичной культуры клеток ГБ пациента 1793 (см. рисунок, м), при этом на микрофотографиях нет четких границ окраски клеток.

Обсуждение

Важным этапом постоперационной диагностики ГБ пациентов является анализ образцов опухоли, полученный в результате биопсии. Точная постановка диагноза ГБ невозможна без проведения цитологических и гистологических исследований. Исследование биоптатов на представленность различных маркеров определяет использование той или иной таргетной терапии. Чрезвычайно сложно детектировать мало представленные маркеры и/или редко встречающиеся клетки. Именно такой случай представляют собой ОСК и их возможный маркер CD133 [20]. Первым шагом трансляции применения аптамеров для диагностики маркеров на биоптатах является тестирование перевиваемых опухолевых культур с разным уровнем экспрессии CD133.

Мы исследовали возможность применения флуоресцентных аптамеров к CD133 для детекции опухолевого маркера на клетках перевиваемых культур ГБ пациентов.

Антитела MA1-219 представляют собой клон мышиных антител 2F8C5, антигеном для которых служил экспрессированный в бактериях фрагмент белка CD133 без гликозилирования, вследствие чего их использование может приводить к неадекватным результатам на клетках человека. Окрашивание антителами проводят на фиксированных и пермеабилизованных/проницаемых клетках, чтобы сделать доступными все молекулы белка CD133.

Аптамеры, используемые в настоящей работе, были отобраны к CD133-экспрессирующим клеткам эукариот. Аптамер AP-1-M — укороченный вариант аптамера AP-1, отобранного к CD133-экспрессирующим трансфицированным клеткам HEK293T [19]. Интересно, что аптамер AP-1-M демонстрировал более высокую аффинность связывания с CD133-экспрессирующими клетками анапластического рака щитовидной железы FRO, чем его аптамер-предшественник AP-1: константа диссоциации при сокращении нуклеотидной последовательности Ap-1—AP-1-M уменьшается примерно в 3 раза: 288 нМ против 101 нМ, хотя в случае клеток более корректно употреблять не термин «константа диссоциации», а термин «концентрация полунасыщения».

Другой научной группой была проведена селекция ДНК-аптамеров к трансфицированным клеткам китайского хомячка CHO-K1, экспрессирующим человеческий белок CD133 [20]. В этой работе аптамер Cs5 получен путем укорочения аптамера C5. Взаимодействие Cs5 с трансфицированными клетками CHO-K1-CD133+ характеризовалось константой диссоциации 16,3±6,8 нМ. Методом проточной цитометрии для аптамера Cs5 было показано взаимодействие с различными клетками, экспрессирующими CD133: клетками линии колоректальной карциномы человека HCT116, колоректальной карциномы HT29, аденокарциномы прямой кишки HCT8, карциномы легких A549, и отсутствие связывания с контрольными CD133-минус клетками CHO-K1 [20].

В нашем исследовании антитела MA1-219 окрашивают все исследуемые клетки перевиваемых культур ГБ пациентов.

Аптамеры по-разному окрашивают образцы. Аптамер Cs5-FAM окрашивает клетки аналогично антителам, но заметно слабее. Аптамер Cs5-FAM5 интернализуется в клетки культуры 1548, при этом сигнал метки совпадает с локализацией ядер клеток. Аптамер AP-1-M практически не окрашивает клетки, что согласуется с его высокими концентрациями полунасыщения приведенными ранее. Неаптамерный олигонуклеотид NADO диффузно окрашивал клетки 1793, аналогично антителам и аптамеру Cs5. Можно предположить, что при отсутствии мишени для NADO окрашивание может быть обусловлено взаимодействием NADO с мембраной рассматриваемых клеток, как это наблюдалось нами ранее для других отдельных образцов клеток культур ГБ пациентов [21].

Заключение

Флуоресцентные FAM-ДНК-аптамеры к CD133 способны окрашивать перевиваемые культуры клеток из опухоли пациентов с ГБ, что можно детектировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Перевиваемые культуры клеток ГБ способны интернализовать аптамеры, по-видимому, путем эндоцитоза. Обнаружение особых свойств клеток перевиваемой культуры 1793 — особый случай, по-видимому, активного эндоцитоза, поскольку клетки 1793 способны захватывать как антитела, так и любые олигонуклеотиды, включая нецелевые.

Таким образом, для положительного заключения аптадиагностики с помощью флуоресцентных аптамеров тестируемая культура клеток ГБ пациента должна давать флуоресцентный сигнал только с аптамерным олигонуклеотидом, сигнал с неаптамерным олигонуклеотидом должен отсутствовать.

Поскольку флуоресцентный ДНК-аптамер Cs5 отвечает заданным критериям, на его основе возможна разработка диагностики ГБ с использованием аптацитохимии по антигену CD133.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Копылов А.М., Павлова Г.В.

Сбор и обработка материала — Моисеенко В.Л., Антипова О.М., Павлова С.А.

Написание текста — Моисеенко В.Л., Антипова О.М.

Редактирование — Моисеенко В.Л., Антипова О.М., Копылов А.М.

Администрирование проекта — Павлова Г.В., Пронин И.Н., Копылов А.М.

Работа выполнена при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования РФ (соглашение №075-15-2021-1343 от 4 октября 2021 г.).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.