Регуляция митофагии и митохондриального биогенеза монокарбонильными аналогами куркумина в коре больших полушарий головного мозга крыс в условиях экспериментальной болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) — хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, представляющее собой терминальную форму деменции с высоким риском летального исхода. По данным ВОЗ, БА занимает 6-е место в перечне ведущих причин смертности населения, при этом отмечается, что пик заболеваемости и, соответственно, летальности приходится на возраст старше 60 лет [1]. В то же время в последнее десятилетие наблюдается резкое омоложение БА. Например, J. Jia и соавт. [2] продемонстрировали, что БА может отмечаться в достаточно раннем возрасте (в данном исследовании — 19 лет), причем диагноз был не только основан на характерной симптоматике заболевания, но и подтверждался результатами МРТ с ¹⁸F-фтордезоксиглюкозой и исследованием цереброспинальной жидкости. Учитывая растущие эпидемиологические показатели, омоложение заболевания и социально-экономическую составляющую профилактики и лечения, неудивительно, что БА является одной из главных проблем современной медицины, особенно в экономически развитых странах с высокой относительной долей населения старческого возраста [3]. Данные факты побуждают медицинское сообщество к разработке новых и усовершенствованию уже имеющихся тактик лечения БА. При этом, в отличие от первоначального терапевтического подхода, который основывался, прежде всего, на коррекции когнитивного дефицита и других сопутствующих нарушений, большинство современных исследований ставит вот главу угла изучение новых средств патогенетической терапии БА [1]. За последнее десятилетие в данной области был достигнут определенный прогресс, в частности несколько антиамилоидных моноклональных антител (донанемаб и леканемаб), а также препаратов малых молекул — ингибиторов нейровоспаления (маситиниб) проходят клинические испытания и демонстрируют многообещающие результаты в исследованиях II/III фазы [4].

В то же время одним из звеньев патогенеза БА, на который можно воздействовать фармакологически, является митохондриальная дисфункция [5]. Концепция митохондриального каскада при БА подразумевает, что дисбаланс в функциональной активности митохондрий приводит к снижению энергопродукции в клетке, активации апоптоза и окислительного стресса, кальциевой перегрузке клеток и накоплению C-концевого β-амилоида 1—42 (Aβ_1—42) [6]. Являясь динамичными структурами, митохондрии постоянно подвержены воздействию ряда негативных факторов, например тау-белка или Aβ_1—42, замыкая «порочный круг» БА. Как правило, в ходе взаимодействия митохондрий клетки с патологическими формами белков отмечается нарушение процессов митофагии и митохондриального биогенеза, приводящее к кумуляции в клетке аномальных митохондрий с развитием нейровоспаления и синаптической дисфункции [7]. При этом, как отмечают E. Fang и соавт. [8], характерным признаком БА является то, что процессы лизосомальной деградации дефектных митохондрий при БА подавляются преимущественно в гиппокампе и коре больших полушарий, способствуя формированию когнитивных нарушений.

Поскольку митохондриальная дисфункция является основным связующим звеном между всеми предполагаемыми патофизиологическими механизмами БА, воздействие на митохондрии клетки может быть актуальным направлением разработки новых средств для патогенетической терапии БА. При этом вектор фармакологического вмешательства может быть смещен с «классических» подходов митохондриальной медицины (восстановление синтеза АТФ, коррекция окислительного стресса, шунтирование метаболических путей) на нормализацию процессов митохондриальной динамики и баланса митофагия/митохондриальный биогенез [9].

Перспективными молекулами-корректорами митохондриальной дисфункции могут являться монокарбонильные производные куркумина, оказывающие выраженное антиоксидантное действие [10]. Кроме того, в ранее проведенном исследовании было показано, что курсовое введение двух новых моноенольных производных куркумина животным с β-амилоид-индуцированной БА приводило к восстановлению дыхательной функции митохондрий гиппокампа, что и послужило основанием для выбора данных соединений в качестве анализируемых веществ [11].

Цель работы — в условиях экспериментальной БА оценить влияние монокарбонильных производных куркумина на изменение реакций митофагии и митохондриального биогенеза в клетках коры больших полушарий.

Исследование выполнено на 100 половозрелых крысах линии Wistar (50 самок и 50 самцов) с массой тела 200—220 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Россия). Во время эксперимента животные содержались в стандартных условиях в полипропиленовых клетках по 5 особей. Полнорационный корм и воду животные получали ad libitum. Подстил (гранулированная фракция твердых пород древесины) меняли не реже чем 1 раз в 3 дня. Условия содержания исключали стрессирование животных: температура окружающего воздуха 22±2 °C, относительная влажность 55—65% при 12-часовом цикле день/ночь. БА воспроизводили у крыс путем прямого введения фрагментов Aβ_1—42 в CA1 фрагмент гиппокампа (стереотаксические координаты: передне-задняя — 3,8 мм, медиально-латеральная — 2 мм, дорсально-вентральная — 2,6 мм от брегмы). Агрегаты Aβ_1—42 («Sigma-Aldrich», Германия) получали путем растворения Aβ_1—42 в смеси диметилсульфоксида («Вектон», Россия) и фосфатно-солевого буферного раствора в соотношении 1:10 при температуре 4 °C и pH=7,4. Агрегаты Aβ_1—42 вводили анестезированным хлоралгидратом животным (350 мг/кг, внутрибрюшинно) в конечной концентрации 1 ммоль/л и объеме 5 мкл. Игла оставалась в месте инъекции в течение 5 мин, после чего ее извлекали. Рану ушивали и обрабатывали 10% раствором повидон-йода [12].

Все животные были рандомизированы в 5 равных групп по 20 особей в каждой (10 самцов и 10 самок). Первая группа — ложнооперированные животные (ЛО), к которой применялись все последовательные процедуры, исключая введение агрегатов Aβ_1—42; вторая группа — негативный контроль (НК), группа животных с воспроизведенной БА, но не получавшая терапию. Остальным группам также моделировали БА: 3-я группа получала референсный препарат — донепезил в дозе 50 мг/кг перорально; 4-й и 5-й группам вводили анализируемые соединения: (1E, 4E)-1,5-бис (3,4,5-триметоксифенил) пента-1,4-диен-3-он (шифр AZBAX4) и (1E, 4E)-1,5-бис (2,4,6-триметоксифенил) пента-1,4-диен-3-он (шифр AZBAX6) в дозе 20 мг/кг перорально [11]. Продолжительность введения составила 30 дней с момента воспроизведения БА.

После указанного времени крыс декапитировали под хлоралгидратной анестезией, извлекали головной мозг, выделяя кору больших полушарий (масса навески 300 мг), которую гомогенизировали в буферной системе, состоящей из 0,1% раствора бычьего сывороточного альбумина («Sigma-Aldrich», Германия), 215 ммоль маннита («Sigma-Aldrich», Германия), 1 ммоль этиленгликольтетраацетата натрия («Sigma-Aldrich», Германия), 75 ммоль сахарозы («Sigma-Aldrich», Германия), 20 ммоль 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты («Sigma-Aldrich», Германия). Гомогенат центрифугировали в течение 2 мин при 1100 g. Полученный супернатант в количестве 700 мкл переносили в пробирки Эппендорфа и наслаивали 75 мкл 10% перколла («Sigma-Aldrich», Германия). Полученную смесь центрифугировали в течение 10 мин при 18 000 g. Осадок ресуспендировали в 1 мл изолирующей среды и повторно центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 g. Во вторичном супернатанте оценивали изменение активности ферментативных маркеров митохондриального биогенеза — сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и цитохром-с-оксидазы (CoX) [13], а также митофагии — активности цитратсинтазы (ЦС) [14].

Активность СДГ оценивали спектрофотометрически в реакции сукцинатзависимого восстановления дихлорфенолиндофенола при добавлении в анализируемую среду ротенона при 600 нм [15]. Активность CoX определяли спектрофотометрически в ходе реакции окисления цитохрома C (II) в присутствии цианида калия при 500 нм [16]. Активность ЦС оценивали спектрофотометрическим методом, основанным на определении окрашенных продуктов реакции деградации 5,5’-ди-тиобис-(2-нитробензойной кислоты) в присутствии ацетил-КоА и оксалоацетата при 412 нм [17]. Активность выражали в единицах действия (Ед) в пересчете на концентрацию белка в образце (мг/мин), которую определяли по методу Бредфорда.

Работа была одобрена локальным Этическим комитетом ПМФИ (протокол №8 от 07.07.23). Исследование соответствовало положениям Директивы ЕС 2010/63.

Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с применением возможностей программного комплекса StatPlus 7.0 («AnalystSoft Inc.», США, лицензия 16887385). Полученные данные были проверены на нормальность распределения согласно критерию Шапиро—Уилка. Для сравнения групп средних применяли параметрические методы ANOVA с пост-тестом Ньюмена—Кейлса и непараметрические методы статического анализа — тест Краскела—Уоллиса. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

В ходе исследования было показано, что у НК группы животных наблюдалось уменьшение активности СДГ (рис. 1), CoX и ЦС по отношению к ЛО группе крыс на 67,6 (p=0,012); 75,1 (p=0,028) и 57,3% (p=0,039) соответственно. На фоне введения животным донепезила отмечено достоверное увеличение активности CoX и ЦС в сравнении с показателями ЛО группы крыс на 76,5 (p=0,001) и 77,9% (p=0,001) соответственно, тогда как активность СДГ статистически значимо не изменилась.

Рис. 1. Влияние монокарбонильных куркуминоидов и донепезила на активность анализируемых ферментов в гомогенате коры больших полушарий у крыс-самок с экспериментальной болезнью Альцгеймера (M±SD).

Здесь и на рис. 2: Донепезил — животные, получавшие донепезил; AZBAX4 — животные, получавшие AZBAX4 ((1E, 4E)-1,5-бис (3,4,5-триметоксифенил) пента-1,4-диен-3-он); AZBAX6 — животные, получавшие AZBAX6 ((1E, 4E)-1,5-бис (2,4,6-триметоксифенил) пента-1,4-диен-3-он); # — достоверно относительно ЛО группы; * — достоверно относительно НК группы; Δ — достоверно относительно группы, получавшей донепезил.

У группы животных, которым вводили изучаемое соединение AZBAX4, наблюдалось увеличение активности СДГ, CoX и ЦС по отношению к НК группе крыс на 93,4% (p=0,021); 125,1% (p=0,0017) и 115,3% (p=0,01) соответственно. В то же время у крыс при применении AZBAX4 отмечено повышение активности анализируемых ферментов относительно группы животных, которым вводили донепезил: СДГ — на 66,9% (p=0,016); CoX — на 27,5% (p=0,019) и ЦС — на 21,0% (p=0,001).

При введении животным соединения AZBAX6 активность СДГ увеличилась относительно НК группы крыс — на 78,0% (p=0,014), тогда как активность CoX и ЦС повысилась на 116,0 (p=0,024) и 97,5% (p=0,032) соответственно. Стоит отметить, что у крыс, получавших AZBAX6, активность СДГ, CoX и ЦС была выше аналогичной у группы животных, которым вводили донепезил, на 53,7 (p=0,026); 22,4 (p=0,037) и 11,0% (p=0,042) соответственно. При этом статистически значимых отличий между группами животных, получавших AZBAX4 и AZBAX6, установлено не было.

В ходе исследования было показано, что у крыс-самцов НК группы отмечено достоверное уменьшение активности СДГ, CoX и ЦС (рис. 2) по отношению к ЛО животным на 81,7 (p=0,023); 65,6 (p=0,001) и 61,4% (p=0,017) соответственно. В то же время у животных, получавших донепезил, наблюдалось повышение активности CoX и ЦС в сравнении с группой нелеченых животных на 50,9 (p=0,041) и 112,5% (p=0,045) соответственно, тогда как активность СДГ у крыс-самцов, получавших донепезил, достоверно не отличалась от таковой у НК группы животных.

Рис. 2. Влияние монокарбонильных куркуминоидов и донепезила на активность анализируемых ферментов в гомогенате коры больших полушарий у крыс-самцов с экспериментальной болезнью Альцгеймера (M±SD).

На фоне введения AZBAX4 отмечено увеличение активности СДГ, CoX и ЦС относительно НК группы крыс на 52,9 (p=0,013); 70,4 (p=0,029) и 137,5% (p=0,022) соответственно. В то же время активность СДГ, CoX и ЦС у крыс-самцов, получавших AZBAX4, была выше аналогичной у животных, которым вводили донепезил, на 34,4 (p=0,041); 12,9 (p=0,04) и 11,8% (p=0,037) соответственно. При применении AZBAX6 наблюдалось повышение (по отношению к нелеченым животным) активности СДГ на 66,7% (p=0,001); CoX на 79,8% (p=0,019) и ЦС на 143,3% (p=0,001). Также стоит отметить, что у крыс-самцов, получавших AZBAX6, активность СДГ, CoX и ЦС была выше аналогичной у группы животных, которой вводили донепезил, на 46,5 (p=0,039); 19,1 (p=0,048) и 14,4% (p=0,03) соответственно.

В настоящее время лечение нейродегенеративных заболеваний, в частности БА, представляет собой одну из главных задач медицины. Наряду с классическими средствами симптоматической терапии, постоянно ведется разработка новых лекарственных средств, влияющих на патогенез заболевания. В данном исследовании было показано, что курсовое введение монокарбонильных производных куркумина под шифрами AZBAX4 и AZBAX6 способствовало повышению активности ЦС в коре больших полушарий у крыс с амилоид-индуцированной экспериментальной БА, как у самок, так и у самцов. Подобные изменения могут отражать значимое воздействие анализируемых соединений на митохондриальную функцию, прежде всего митофагию. Известно, что поддержание равновесия в системе образования митохондрий de novo и элиминации поврежденных митохондрий играет ведущую роль в обеспечении сохранения целостности клеток, предотвращении цитотоксичности Aβ и обеспечении нейропротективного эффекта [18]. Возможность регуляции митофагии и митохондриального биогенеза была описана для многих соединений, в том числе для куркумина. Так, A. Moustapha и соавт. [19] продемонстрировали, что куркумин способствовал образованию митофагических вакуолей, активируя LC-3-зависимую митофагию в культуре клеток гепатомы человека Huh-7. В исследовании, проведенным S. Cao и соавт. [20], показано, что введение куркумина приводило к повышению элиминации окислительно поврежденных митохондрий за счет повышения активности PARKIN-зависимого пути митофагии.

Альтернативно митофагии, об активности которой свидетельствуют каталитические свойства ЦС, при применении веществ AZBAX4 и AZBAX6 отмечено повышение активности СДГ и CoX (при отсутствии гендерных отличий), что может являться свидетельством увеличения интенсивности процессов митохондриального биогенеза. Митохондриальный биогенез является относительно новой мишенью в терапии БА, но, несмотря на это, были достигнуты определенные успехи в понимании фармакологической коррекции данного процесса. Известно, что Aβ подавляет митохондриальный биогенез посредством блокады сигнального пути АМФК-SIRT-1 и PGC-1α, в связи с чем активность подавляющего большинства соединений, восстанавливающих митохондриальный биогенез, рассматривалась в контексте регуляции данного каскадного сигнала. Было показано, что несколько соединений, в частности, мелатонин [21], ресвератрол [22] и берберин [23], оказывают нейропротективное действие за счет повышения PGC-1α-зависимого митохондриального биогенеза. В свою очередь куркумин и некоторые его аналоги также увеличивали интенсивность митохондриального биогенеза за счет активации пути цАМФ-АМФК. Так, показано, что введение куркумина дозозависимо повышало митохондриальный биогенез в ткани головного мозга крыс [24].

Стоит отметить, что донепезил оказывал несколько меньшее влияние на изменение анализируемых параметров, нежели исследуемые соединения AZBAX4 и AZBAX6. Данный факт может объясняться особенностями митохондриально-ориентированного действия донепезила, которые представлены в работе J. Wang и соавт. [25]. Авторами было показано, что донепезил повышает интенсивность клеточного дыхания в неповрежденных митохондриях, о чем может свидетельствовать увеличение активности CoX и ЦС, но не оказывает влияния на процессы элиминации дефектных митохондрий.

Таким образом, можно предположить, что соединения AZBAX4 и AZBAX6, являясь структурными аналогами куркумина, способны воздействовать на процесс митохондриального биогенеза и митофагии на уровне регуляции внутриклеточных сигнальных путей, превосходя при этом донепезил, что, однако, требует дальнейшего изучения.

На основании полученных данных можно предполагать, что применение новых монокарбонильных аналогов куркумина AZBAX4 и AZBAX6 способствует повышению митохондриального биогенеза и митофагии в коре больших полушарий у крыс обоих полов с экспериментальной БА. В совокупности результаты данного исследования демонстрируют актуальность дальнейшего изучения соединений AZBAX4 и AZBAX6 как нейропротективных соединений, используемых в терапии БА.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.