Сукцинаты в решении «кислородного парадокса» реперфузии

Действующим стандартом лечения любого критического состояния является своевременное восстановление притока крови к ишемизированной области различных органов, что особенно актуально для расстройств мозгового кровообращения. В то время как реперфузия необходима для спасения зоны ишемии, восстановление кровотока парадоксальным образом повреждает популяцию ранее ишемизированных клеток — явление, которое получило название «смертельное повреждение ишемии-реперфузии».

Реперфузия — парадоксальная реакция тканей, которая проявляется в органах, лишенных кровотока в условиях дефицита кислорода, а после восстановления кровотока и реоксигенации тканей приобретает повреждающий характер и поэтому остается в центре внимания фундаментальных и клинических исследований на протяжении более 40 лет. Сегодня реперфузия рассматривается в контексте концепции трех сочетанных парадоксов: кислородного, кальциевого и водного. Впервые предположение о повреждающем действии реперфузии, в частности на сердечную мышцу, было высказано в середине прошлого века, и в течение продолжительного периода времени являлось предметом споров, главным образом из-за отсутствия обоснованных доказательств, свидетельствующих о прогрессировании повреждения тканей при восстановлении кровотока [1]. Задолго до появления тромболитической терапии было обнаружено, что восстановление кровоснабжения, которое требуется для спасения ранее ишемизированной ткани, может парадоксальным образом усугубить ее повреждение. Впервые такое предложение было озвучено R. Jennings и соавт. [2], но еще долго существование реперфузионного повреждения было предметом интенсивного обсуждения, причем некоторые исследователи предполагали, что реперфузия действует, усугубляя повреждение, уже полученное клетками, подвергшимися ишемии и гипоксии. В этом знаковом исследовании было отмечено, что реперфузия ускоряет развитие некроза миокарда, что, вероятно, в виде общебиологического феномена характерно для любой клеточной ткани и особенно опасно для головного мозга. Это привело к формированию точки зрения о том, что реперфузия не может рассматриваться исключительно как полезное событие, но сама по себе способна вызывать травму за счет включения цепи патофизиологических событий, прямо связанных с восстановлением кровоснабжения, которое не происходит в течение предыдущего ишемического периода. Как показали последующие исследования, гибель клеток может продолжаться до 3 сут после восстановления кровотока в ишемизированных тканях [3].

За последние 40 лет была проведена серия исследований с применением современных сложных экспериментальных методик. Полученные результаты продемонстрировали, что ишемия ухудшает АТФаз-зависимый (энергозависимый) транспорт ионов и нарушает регуляторные механизмы клеточного обмена, что может привести к лизису органелл и плазматических мембран. Кроме того, ряд работ показал множество модальностей клеточной смерти, которое обусловливает ишемия/реперфузия-индуцированную гибель клеток вследствие запрограммированных последовательных событий и может поддаваться фармакологическому вмешательству. Кроме того, реперфузия вызывает парадоксальные тканевые реакции, которые подпитывают синтез активных форм кислорода (АФК), что способствует связыванию провоспалительных иммуноцитов в ишемизированных тканях, эндоплазматическому напряжению ретикулума и развитию постишемического капиллярного стаза, что в свою очередь усиливает повреждение тканей. Существование реперфузионного повреждения тканей было подтверждено большим количеством исследований, и сегодня уже общепризнано, что многие осложнения в течение различных заболеваний неразрывно связаны с реперфузией.

Во-первых, длительность фазы ишемии, так как результат реперфузии будет различен в зависимости от продолжительности ишемии. Так, продемонстрировано, что в начале длительной ишемии повреждение тканей вызвано ею как таковой, но с течением времени все бо`льшую роль играет именно реперфузионное повреждение, обусловленное нарушением порозности сосудистой стенки и формированием периваскулярного отека, вторично вызывающего ишемию тканей [4]. Также показано, что короткий период ишемии (около 5 мин) и реперфузия не только не проходят бесследно, но и оказывают протективное, или тренирующее действие, что подтверждает факт защитного и адаптационного эффектов гипоксии в развитии ишемии. В настоящее время этот феномен известен как ишемическое прекондиционирование [5]. Итак, ответ ткани на реперфузию бимодален и зависит от длительности ишемии, что необходимо учитывать при выборе методов и средств патогенетического лечения.

Во-вторых, особенности реперфузионного повреждения зависят от ткани, подвергшейся ишемии/реперфузии. В связи с наиболее активным метаболизмом, отсутствием запасов глюкозы и низким уровнем ферментов антиоксидантной системы наиболее чувствительным к ишемии/реперфузии является головной мозг [6]. Сердце — второй наиболее чувствительный к ишемии/реперфузии орган [7]. Третьим по чувствительности органом является почка, в которой изменения, обусловленные ишемией/реперфузией, могут отсутствовать даже после 30-минутной ишемии [8]. Сложнее ситуация с ишемией кишечника, так как верифицировать начало нарушения кровообращения трудно из-за стертой клинической картины. В экспериментах на животных было установлено, что изменения в стенке кишечника начинают регистрировать примерно с 30-й минуты ишемии [9]. Важно отметить, что интестинальная ишемия протекает на фоне активного участия микроорганизмов в воспалительном ответе на реперфузию (транслокация бактерий), в то время как в других органах, например в головном мозге, реперфузия связана с асептическим воспалением. Экспериментальные исследования показали, что деконтаминация кишечника уменьшает тяжесть реперфузионного повреждения [10].

В-третьих, на исход ишемии/реперфузии влияет состояние пациента. Например, возраст напрямую коррелирует с частотой возникновения заболеваний, сопряженных с ишемией/реперфузией (инфаркт миокарда, инсульт, остановка сердца и др.) [7].

Другие факторы (сопутствующие заболевания, употребление алкоголя, метаболический синдром и др.) также оказывают влияние на степень выраженности реперфузионного ответа, который зависит от резерва защитных механизмов, прежде всего адаптации организма к гипоксии и активности антиоксидантных систем. Следует отметить, что в эксперименте ишемию/реперфузию, как правило, изучают на молодых здоровых животных, что зачастую ведет к недооценке влияния образа жизни пациента и сопутствующих заболеваний на тяжесть реперфузионного повреждения. Именно поэтому так велик разрыв между многообещающими результатами фундаментальных исследований и неудачами в клинических испытаниях, которые объясняются парадоксами реперфузии.

Результаты экспериментальных исследований показали, что митохондрии синтезируют большую часть АТФ-клетки путем окислительного фосфорилирования. Катаболизм углеводов (гликолиз), липидов (β-окисление жирных кислот) и белков (глюкогенные и кетогенные пути) дают продукты, которые поступают в цикл Кребса в митохондриальном матриксе. Промежуточные продукты, образующиеся в ходе реакций окисления в цикле Кребса, как бы «жертвуют» свои восстановительные эквиваленты (протоны H⁺ и электроны e⁻) NAD и FADH для образования NADH и FADH²⁺. Как видно на рис. 1, в строме (внутреннее пространство) митохондрии постоянно функционирует цикл Кребса. Образующийся при этом восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH) взаимодействует с мембранным первым (I) дыхательным комплексом и окисляется до NAD⁺. Электроны с NADH передаются на плавающий в мембране липидорастворимый переносчик электронов (кофермент Q — убихинон). В ходе реакции из стромы в межмембранное пространство перекачиваются четыре протона H⁺ [11].

Рис. 1. Митохондриальная дыхательная цепь.

Адаптировано по D. Granger и соавт. [11]. Пояснения в тексте.

Второй (II) дыхательный комплекс, который имеет в своей структуре фермент сукцинатдегидрогеназу, окисляет образовавшийся в цикле Кребса сукцинат до фумарата и тоже переносит электроны на убихинон [12]. Третий (III) комплекс переносит электроны с убихинона на водорастворимый переносчик цитохром C (Cyt C), который плавает в межмембранном пространстве и при этом перекачивает из стромы в межмембранное пространство шесть протонов H⁺. Четвертый (IV) комплекс переносит электроны с цитохрома C на кислород. Кислород восстанавливается до воды и в процессе реакции из стромы в межмембранное пространство переносит еще четыре протона H⁺. В результате в строме оказывается мало протонов, а в межмембранном пространстве, наоборот, их оказывается много, т.е. возникает протонный градиент (мембранный потенциал, ΔΨ). Белковый комплекс АТФ-синтаза (часто его рассматривают в качестве пятого дыхательного комплекса) использует энергию этого градиента для синтеза АТФ. В связи с этим потеря ΔΨ имеет серьезные биоэнергетические последствия [12].

Точка зрения о том, что ишемия представляет собой пусковой механизм, приводящий к гипоксии, на сегодняшний день общепризнана, поэтому последующие события должны рассматриваться с учетом гипоксии и расстройств, происходящих в дыхательной цепи митохондрий. В ишемической фазе, по мнению ряда исследователей, аноксическое повреждение начинается с уменьшения митохондриальной продукции энергии в виде АТФ [13]. Гипоксия имеет свои временные рамки, и, безусловно, позволяет клетке включить механизмы адаптации, позволяющие обеспечить энергетический баланс в определенный период времени, т.е. выживать в условиях гипоксии. Однако мозг не обладает энергетическим резервом, его хватит на 80 с [14, 15]. В этой ситуации синтез HIF-1 начинается по сигналу от сукцинат-зависимого рецептора GPR91 [16]. Когда клетки находятся в состоянии гипоксии и активируется HIF-1, он распознает специальную последовательность в регуляторном домене генов-мишеней и связывается с ней. HIF-1 активирует набор генов, кодирующих ферменты, ответственные за гликолиз (9 из 12 гликолитических ферментов), и, наоборот, другой набор генов, который подавляет окислительное фосфорилирование для облегчения метаболического перепрограммирования. При этом происходит торможение I участка (НАД⁺) дыхательной цепи митохондрий, активируется ряд шунтов окисления, сопряженных с образованием в цикле Кребса сукцината (из малата, фумарата и α-кетоглутарата), так как более эффективный синтез сукцинатзависимой энергии включается на II участке дыхательной цепи митохондрий и происходит стабилизация HIF-1 [17]. Таким образом, суть «кислородного парадокса» заключается в активной продукции токсичных АФК в период реперфузии и реоксигенации, так как дыхательная цепь митохондрий, обеспечивающая потребление кислорода и синтез АТФ, не может адекватно утилизировать кислород вследствие потери электронов. Поэтому реперфузионное повреждение является комбинацией ишемического и собственно реперфузионного повреждения, проявляющегося митохондриальной дисфункцией [18].

Гипоксия, как и любой стрессогенный фактор, приводит к выбросу адренергических гормонов-медиаторов, которые вызывают мощную активацию дыхательной цепи, но при значительно меньшей потребности в кислороде (это происходит в условиях гипоксии!). Таким образом возникает своеобразная цепная реакция, при которой нейрональный и экстранейрональный выбросы катехоламинов в органы и ткани стимулируют процесс образования янтарной кислоты, которая в свою очередь активирует синтез адреналина и норадреналина [19, 20].

Функционирование механизма метаболического перепрограммирования ограничено во времени. Он представляет собой способ выживания в определенный период в условиях гипоксии при критических состояниях. Переход от обратимого к необратимому повреждению ткани во время ишемии является следствием клеточных событий, инициированных вызванным ишемией несоответствием между поступлением кислорода в клетку и потребностью в нем. Эти вредоносные последствия включают (но не ограничиваются ими) результирующий переход от аэробного метаболизма к анаэробному гликолизу и последующую неспособность генерировать достаточное количество АТФ для поддержания ионного гомеостаза и целостности митохондриальных мембран.

Активацию сукцинатного окисления в этих условиях следует рассматривать как эволюционно сформировавшийся срочный компенсаторный механизм, который встречается во всех тканях (и в головном мозге, в частности), при любой форме недостатка кислорода и обеспечивает сохранение аэробного производства энергии во время ранних нарушений кислородного гомеостаза и в период реперфузии [21, 22]. Накопление сукцината в период ишемии зависит от ее длительности, но окисление сукцината в период реперфузии более быстротечно и обусловлено гипероксией и ускорением работы дыхательной цепи за счет возрастающей активности комплекса II, в котором участвует сукцинатдегидрогеназа [12, 13].

Повышение активности функционирования цикла Кребса с усиленной продукцией α-кетоглутарата, малата и фумарата обеспечивает накопление сукцината, что обеспечивает улучшение энергетического обмена в период после гипоксии [23]. Таким образом, в период ишемии сукцинат как не востребованный в условиях гипоксии субстрат накапливается в тканях (в клетке и внутри митохондрий), запас его может быть использован в период реперфузии и реоксигенации, и в этой ситуации работа цикла Кребса направлена на синтез сукцината (рис. 2).

Рис. 2. Разворот цикла Кребса, или «монополизация» дыхательной цепи митохондрий в период ишемии.

Пояснения в тексте.

По некоторым данным, сукцинат образуется во время катаболизма аспартата и глутамата, и этот путь может продуцировать некоторое количество АТФ через сукцинаттиокиназу, обеспечивая фосфорилирование субстрата [24]. Восстановление фумарата до сукцината, опосредованное окислением NADH через комплекс I, убихинон и комплекс II, может помочь поддерживать ΔΨ во время ишемии. Следует также отметить резкое снижение уровня сукцината, наблюдаемое во время ранней реперфузии [22], что связано с его быстрым вымыванием из тканей в течение 1—2 мин реперфузии.

Таким образом, клетки реагируют и на снижение уровня кислорода путем активации стресс-ответного сигнала от сукцинатзависимого рецептора GPR91, который активирует HIF-1 для адаптации и последующего выживания в условиях гипоксии. Клетки, находящиеся в условиях отсутствия кислорода, в отличие от пребывающих в состоянии гипоксии, характеризуются значительным снижением потребления кислорода и синтеза АТФ и погибают в течение 48 ч, в то время как в условиях гипоксии клетки продолжают выживать и делиться, так как дисфункция митохондриального комплекса I снижает поток электронов через дыхательную цепь, смещает метаболизм в сторону гликолиза, вызывает накопление лактата и ограничивает выработку АТФ. Показано, что ²/₃ накопленного в период ишемии сукцината локализуются внеклеточно, а оставшаяся ¹/₃ — метаболизируется во время ранней реперфузии, что и является защитным эффектом в период реоксигенации [23].

Что же происходит при реперфузии и в бо`льшей степени при реоксигенации и в чем суть происходящих событий? Митохондрии являются как источниками, так и мишенями для АФК. Они участвуют в инициации и прогрессировании ишемии и последующего реперфузионного повреждения, связывающего окислительный стресс, воспаление и гибель клеток. Генерация АФК начинается еще во время ишемии, и в этих условиях HIF-1 опосредует переход от окислительного метаболизма к гликолизу, уменьшая тем самым выработку митохондриальных окислителей. При этом ослабляется митохондриальный путь синтеза АФК, что позволяет избежать гибели клеток. Нарушение переноса электронов и энергетического обмена, а также изменение клеточного окислительно-восстановительного потенциала вследствие образования АФК инициируют события, приводящие к апоптозу [12, 13, 22].

Значительное количество АФК образуется на I и III комплексах дыхательной цепи именно во время реперфузии, и чрезмерное накопление АФК в клетках является одним из основных повреждающих механизмов, связанных с окислительной модификацией белков, липидов и митохондриальной ДНК. В период поступления большого количества кислорода в дыхательную цепь митохондрий включается новый адаптационный механизм, исключающий активный синтез АФК путем быстрого окисления сукцината на II комплексе дыхательной цепи митохондрий. Таким образом, устранение избыточного АФК из клеток и подавление окислительного стресса могут способствовать выживанию клеток и улучшению исхода реперфузионного периода [12, 13, 22].

В нескольких точках (рис. 3) дыхательной цепи (особенно в комплексах I и III) существует потенциал для утечки электронов и уменьшения потребления O₂ из-за синтеза супероксида (O^2–), который утилизируется супероксиддисмутазой до перекиси водорода (H₂O₂), в свою очередь устраняемой каталазой, миелопероксидазой и глутатионпероксидазой. В условиях гипероксии и реоксигенации комплекс II возвращает избыток электронов через комплекс I путем обратного переноса электронов (RET), обеспечивая энергией расщепление продуктов (O^2– и H₂O₂) одноэлектронного окисления O₂. RET — энергетический процесс, посредством которого электроны, входящие в комплекс II (путем окисления сукцината), достигают коэнзима Q и могут двигаться вперед к комплексу III обычным путем. Рост концентрации кислорода в период реоксигенации потенцирует активность сукцинатдегидрогеназы, потребляющей сукцинат. При этом накопленный в период ишемии сукцинат быстро, в течение нескольких минут, окисляется в условиях избытка кислорода, но при этом сукцинатдегидрогеназа активно пропускает поток протонов и электронов на дыхательную цепь, минуя NAD-зависимое звено (I комплекс дыхательной цепи митохондрий) (см. рис. 3) [12].

Рис. 3. Производство АФК электронной транспортной цепью митохондрий: роль ∆ψ.

Пунктиром показан реверсный путь электронов при реоксигенации, сплошной линией — привычный путь электронов при нормоксии.

Адаптировано по D. Granger и соавт. [11].

Таким образом, в результате активности сукцинатдегидрогеназы и продукции сукцината за счет разворота цикла Кребса в сторону синтеза сукцината (см. рис. 2) на внутренней мембране оказывается много протонов, а в межмембранном пространстве их, наоборот, мало. Это и позволяет восстановить достаточный уровень ΔΨ, потерянный при гипоксии, но необходимый для ресинтеза АТФ в условиях реоксигенации [25]. В данном случае это природный механизм, заложенный в процессе эволюции для устранения реоксигенации после периода дефицита кислорода. Достижение равновесия, аналогичного таковому в период нормоксии, может быть обеспечено увеличением количества сукцината за счет его дополнительного введения в период реперфузии (рис. 4).

Рис. 4. Разница в соотношении кислорода и сукцината в различные периоды ишемии/реперфузии.

Несомненно, необходимы дальнейшие фундаментальные исследования для выявления потенциальных синергетических подходов и описания основных молекулярных механизмов действия сукцината, но тем не менее всем знакомо выражение «улучшение через ухудшение», что можно отнести к синдрому ишемии/реперфузии.

Подтверждение этой гипотезы можно найти в литературе, из которой можно сделать вывод, что механизм действия сукцината характерен для всех тканей и клеток, и это можно рассматривать как общебиологический феномен. Например, фокальное введение сукцината пациентам с черепно-мозговой травмой улучшило энергетический метаболизм, о чем свидетельствует снижение соотношения лактат/пируват. Авторы отмечают, что сукцинат заслуживает дальнейшего изучения при терапии черепно-мозговой травмы [26]. Недавно впервые было показано, что введение сукцината после ишемии задних конечностей у мышей приводит к более раннему восстановлению перфузии крови и самое главное к лучшему и более раннему функциональному восстановлению предварительно ишемизированной конечности [24]. На фоне введения сукцината ангиогенная активация достигла своего пика уже на 4-й день после острой ишемии у мышей, получавших сукцинат, и не ранее 8-го дня у мышей, не получавших сукцинат. Это привело к более ранней реваскуляризации конечностей, что, как известно, в значительной степени связано с восстановлением сократительной функции мышц [24]. Таким образом, использование сукцината может представлять перспективный новый подход к профилактике реперфузионных повреждений в условиях широкого спектра патологии.

Сегодня можно констатировать, что произошел рост интереса к сигнальной способности энергетических метаболитов. Ярким примером является сукцинат, субстрат цикла Кребса, архетипический дыхательный субстрат, функции которого выходят далеко за рамки производства энергии, обладающий свойствами внутриклеточной и внеклеточной сигнальной молекулы. Новые данные подтверждают ключевую роль сукцината в метаболических процессах, связанных с управлением продукции энергии. Сукцинат среди всех метаболитов цикла Кребса выделяется вследствие вовлечения в многочисленные метаболические процессы, резких изменений концентрации и избирательного высвобождения в клетках. Сукцинат эволюционировал как сигнальная молекула, потому что его концентрация отражает окислительно-восстановительный потенциал и состояние внутренней мембраны митохондрий и объединяет три биоэнергетических параметра: митохондриальное поступление электронов, напряжение кислорода и потребность в АТФ. Безусловно, его синтез и потребление играют ведущую роль в кислородном гомеостазе, так как сукцинат обеспечивает кислородное равновесие в условиях гипоксии и гипероксии при реперфузии. Это позволяет рассматривать его в качестве центрального биоэнергетического вектора от митохондрий к остальной части клетки.

Результаты анализа приведенных публикаций позволяют сделать ряд выводов. Реперфузионное повреждение, индуцируемое активацией синтеза АФК, является результатом процесса реоксигенации в условиях снижения эффективности механизма адаптации к гипоксии в раннем периоде ишемии. Реперфузионные повреждения клеточных структур, в первую очередь митохондриальная дисфункция эндотелиоцитов, могут рассматриваться как метаболический энергетический кризис, разрешение которого может быть достигнуто путем использования сукцинатов, позволяющих реализовать восстановление митохондриальных комплексов эндотелиоцитов за счет стимулирования метаболических процессов и ангиогенеза капиллярного русла.

Использование сукцинатов в раннем периоде реперфузии свидетельствует о перспективе их широкого применения практически при всех критических состояниях, протекающих в условиях ишемии и последующего восстановления микроциркуляции. Реперфузия и реоксигенация могут быть рассмотрены как общебиологический феномен, характеризующий единый механизм поддержания кислородного гомеостаза в различных клеточных структурах и тканях в период восстановления кровотока в микроциркуляторном русле.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.