В настоящее время важная роль окислительного стресса в патогенезе шизофрении не вызывает сомнения. Во многих работах убедительно показано повышение маркеров системного окислительного стресса [1, 2], в том числе маркера повреждения ДНК в ткани мозга [3], в моче [4] и периферической крови [5]. Однако вопрос о том, является окислительный стресс причиной, следствием или сопутствующим состоянием, долгое время оставался без ответа; также неясно было, почему при ярко выраженном окислительном стрессе антиоксидантная терапия не проявляет ожидаемой эффективности [6]. Ответы на эти вопросы может дать понимание связи окислительного стресса с воспалением и клеточной сигнализацией.

Первые работы по изучнию воспаления при шизофрении были нацелены на поиск маркеров воспаления в крови и ЦСЖ, и было доказано повышение уровня провоспалительных цитокинов и C-реактивного белка [7], в том числе при первом психотическом эпизоде [8]. В настоящее время сформулирована концепция нейровоспаления в ткани мозга [9], основным событием в котором является активация микроглии в ответ на инфекции, травмы, психоэмоциональные стрессы и повышенная продукция активных форм кислорода (АФК) [10]. Среди провоспалительных цитокинов особое значение придают ФНО-альфа, ИЛ-6 и ИЛ-1β, которые связывают с депрессией и коморбидностью [11], к тому же этими цитокинами регулируется метаболизм триптофана/кинуренина и глутаматергическая передача [12]. Согласно модели «уязвимость—стресс—воспаление», типичные изменения, наблюдаемые в дофаминергическом, серотонинергическом, норадренергическом и глутаматергическом нейротрансмитторных звеньях при шизофрении, характерны и для слабовыраженного нейровоспаления, которое, следовательно, может быть причиной соответствующей симптоматики. В пользу этой гипотезы свидетельствует высокая эффективность антипсихотиков, обладающих собственными противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами [13].

Дальнейшее изучение феномена нейровоспаления связано с ролью в нем сигнальных провоспалительных и противовоспалительных путей: NF-κB, HO-1 и Nrf2-ARE. Ядерный фактор транскрипции Nrf2 активирует экспрессию нескольких сотен генов, обеспечивающих резистентность организма в ответ на воздействие факторов, индуцирующих окислительный стресс и воспаление. В физиологических условиях он находится в основном в цитоплазме, но в ответ на окислительный стресс транслоцируется в ядро и связывается с определенными сайтами ДНК, инициируя транскрипцию цитопротективных генов. Была выдвинута гипотеза о ключевой роли Nrf2 в развитии шизофрении [14]. В качестве обоснования авторы указали на дизрегуляцию активации Nrf2 для нейровоспалительных заболеваний, ключевым звеном патогенеза которых являются окислительный стресс, снижение уровня глутатиона в ликворе и префронтальной коре больных шизофренией, эффективность приема сульфорафана — природного соединения, являющегося активатором пути Nrf2 [15], однако прямых доказательств этой гипотезы пока не получено. Актуальность исследования Nfr2 при шизофрении обусловлена также перспективами создания принципиально нового класса лекарственных препаратов — регуляторов сигнальных путей [16].

При алкогольном делирии окислительный стресс вызван интоксикацией этанолом и продуктами его метаболизма [17]. Он выражается в активации перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков, окислительном повреждении ДНК [18]. В настоящее время активно ведутся исследования, посвященные использованию роли и защитных возможностей систем Nrf2 и HO-1 при алкогольном повреждении мозга, печени и поджелудочной железы, а также эмбрионов. При приеме алкоголя происходит активация Nrf2, хотя этот эффект снижается одновременным подавлением экспрессии тиоредоксина 1 [19]. Доказана гепатопротекторная роль индукторов Nrf2 ресвератрола и фукоксантина при алкогольной интоксикации [20, 21].

Цель данной работы — выявление связи между показателями антиоксидантного профиля периферической крови с транскрипционной активностью гена Nrf2 при остром психозе у пациентов с шизофренией и алкогольным делирием.

Материал и методы

В исследование были включены 90 мужчин 19—65 лет, которые были госпитализированы с острым психозом в московскую психиатрическую больницу №14 (филиал психиатрической клинической больницы №1 им. Алексеева).

В исследование не включались пациенты при наличии острого и хронического инфекционого процесса, туберкулеза, онкологического заболевания, декомпенсированного сахарного диабета, сопутствующих психических расстройств, зависимости от наркотиков и психотропных препаратов, умственной отсталости, тяжелых соматических и хронических неврологических заболеваний.

Диагностика психических заболеваний проводилась по МКБ-10.

Включенные в исследование пациенты составили три группы.

В 1-ю группу вошли 40 пациентов с впервые манифестировавшей параноидной шизофренией. Их средний возраст был 40,4±9,8 года. Эти больные ранее не получали психофармакотерапию.

Вторую группу составили 33 пациента с шизофреническим психозом и длительностью заболевания от 1 года до 20 лет. Средний возраст этих больных был 38,5±12,1 года. Больным проводили терапию антипсихотическими препаратами в полном объеме согласно стандартам оказания помощи.

В 3-ю группу были включены 17 пациентов с впервые развившимся острым психозом, вызванным чрезмерным употреблением алкоголя, у которых в течение предыдущего года не выявлено шизофрении или других психических расстройств. Средний возраст пациентов этой группы был 42,2±5,9 года.

В группу контроля для определения Nrf2 в мононуклеарах были включены 25 здоровых мужчин в возрасте от 18 до 63 лет, не имеющие соматической или неврологической патологии, не состоящие в родстве с исследуемыми пациентами, лицами с диагнозом «шизофрения» или пациентами наркологических диспансеров.

От всех обследованных было получено добровольное информированное согласие на проведение исследований. Данное исследование было одобрено Этическим комитетом Медико-генетического научного центра им. Н.П. Бочкова.

Для определения уровня Nrf2 забор крови из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом Li-гепарин у пациентов с острым психозом проводили в 1-й день госпитализации. Образцы крови доставляли в лабораторию в течение 1 ч. Мононуклеары периферической крови (МНК) выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования. Уровень белка Nrf2 в МНК анализировали в фиксированных клетках методом проточной цитофлуориметрии с использованием соответствующих антител. Клетки фиксировали в 3,7% растворе формальдегида 10 мин при 37 °C, пермеабилизовали 0,1% раствором Тритона Х100 («Merck», Германия) в фосфатно-солевом буферном растворе («ПанЭко», Россия) с последующей отмывкой и блокированием 1% раствором альбумина в PBS. Фиксированные клетки инкубировали в течение 2 ч при +18 °C с антителами к NRF2, меченными FITC (BS-1074R-FITC, «Bioss», США) и анализировали на проточном цитофлуориметре PartecCyFlow ML («Partec», Германия).

Регистрацию антиоксидантного профиля методом хемилюминометрии проводили на хемилюминометре «SmartLum 5773» (ООО «ДИСофт»). Использовали реагенты люминол, 2,2’-азо-бис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (АБАП), KH₂PO₄ (все «Sigma»). Смешивали в кювете АБАП и люминол в конечных концентрациях 2,5 мМ и 10 мкМ соответственно, добавляли необходимое количество буферного раствора KH₂PO₄ (100 мМ, pH 7,4) и регистрировали свечение при 37 °C до достижения плато, далее добавляли 10 мкл плазмы крови, предварительно разбавленной буферным раствором в 10 раз. Проводили регистрацию в течение примерно 30 мин до достижения нового стационарного уровня. Из хемилюминограммы определяли величину двух параметров: площадь подавления хемилюминесценции (S), которая характеризует емкость сильного антиоксиданта плазмы крови — мочевой кислоты, и разницу в исходном и конечном стационарных уровнях хемилюминесценции (ΔI), которая характеризует количество неокисленных тиоловых групп альбумина — «тиоловую» антиоксидантную емкость (рис. 1). Референтный интервал для практически здоровых доноров возраста от 18 до 65 лет (n=110) был определен ранее: S [195—405] и ΔI [1,2—2,2]. Состоянию системного и «тиолового» окислительного стресса соответствует снижение S и ΔI соответственно.

Рис. 1. Антиоксидантный профиль плазмы крови практически здорового донора, определенный методом хемилюминометрии, стрелкой указан момент добавления пробы.

Аналитические параметры: S — общая антиоксидантная емкость, обусловленная мочевой кислотой, ΔI — «тиоловая» антиоксидантная емкость.

Статистическую обработку проводили с использованием программы Excel Microsoft Office, Statistica 6.0, StatGraph. При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета U-критерия Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. При проведении корреляционного анализа параметров антиоксидантной защиты рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена.

Результаты

Аантиоксидантный профиль каждой из групп пациентов представлен в табл. 1 по показателям S — антиоксидантная емкость плазмы и ΔI — сохранность тиоловых групп альбумина.

Таблица 1. Описательная статистика параметров антиоксидантного профиля в группах обследуемых пациентов

Антиоксидантная емкость плазмы (параметр S), обеспечиваемая мочевой кислотой, в ¹/₃ случаев снижена у пациентов с первым психотическим эпизодом и алкогольным психозом. У пациентов, находящихся на лечении, этот показатель в целом скомпенсирован. Параметр ΔI характеризует сохранность тиоловых групп альбумина и косвенно — состояние системы глутатиона. «Тиоловый» окислительный стресс в значительной мере выражен у пациентов с первым психотическим эпизодом (78% наблюдений), у пациентов 2-й группы ситуация немного лучше (67%). У пациентов с алкогольным психозом «тиоловый» окислительный стресс выражен примерно в ¹/₂ случаев. На рис. 2 приведены гистограммы распределения по частоте рассчитанных параметров.

Рис. 2. Гистограммы распределения по частоте встречаемости показателя по группам.

а, в, д — общая антиоксидантная емкость S; б, г, е — «тиоловая» антиоксидантная емкость ΔI. Жирной двусторонней стрелкой отмечен референтный интервал.

Сравнительная статистика была рассчитана по критерию Манна—Уитни. Для параметра S между 1-й и 2-й группами было получено значение p-критерия p=0,054; для параметра ΔI — p=0,067. Поскольку один из критериев является пороговым для уровня значимости 0,95, нельзя уверенно подтвердить или опровергнуть нуль-гипотезу, однако можно полагать, что при увеличении размера групп различие станет достоверным. Таким образом, успешное лечение приводит к коррекции показателя общей антиоксидантной емкости у пациентов с шизофренией. Показатель «тиолового» окислительного стресса при лечении имеет тенденцию к улучшению.

Анализ уровня экспрессии белка Nrf2 в МНК пациентов выявил существенное повышение данного показателя у больных алкоголизмом по сравнению с пациентами с первым психотическим эпизодом (рис. 3). Средний уровень экспрессии Nrf2 у этой группы пациентов составил 3,92±0,31 против 1,72±0,07 отн.ед. в группе контроля (p=0,0027), а у пациентов с шизофренией данный параметр статистически значимо снизился по сравнению как с группой контроля, так и с больными алкоголизмом (1,37±0,10 отн.ед.; оба p<0,001).

Рис. 3. Экспрессия белка Nrf2 в мононуклеарах пациентов с острым психозом по сравнению с контрольной группой.

Результаты представлены как среднее ± ошибка среднего. Статистический анализ проводили с использованием критерия U Манна—Уитни. * — p<0,05, по сравнению с контрольной группой. 1-я группа — больные параноидной шизофренией (первый эпизод); 3-я группа — пациенты с психическими и поведенческими расстройствами, вызванными употреблением алкоголя.

В табл. 2 представлены результаты корреляционного анализа между параметрами, характеризующими антиоксидантный статус плазмы крови, и уровнем белка Nrf2 в МНК. Как видно из приведенных данных, у пациентов с алкогольным психозом наблюдалась обратная корреляция средней силы между уровнем Nrf2 и обоими параметрами антиоксидантного профиля, а у пациентов с шизофреническим психозом — корреляция только между Nrf2 и «тиоловой» антиоксидантной емкостью.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции параметров антиоксидантного профиля плазмы и белка Nrf2 в мононуклеарах периферической крови у пациентов с манифестным шизофреническим и алкогольным психозом

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют о различиях корреляции уровня Nrf2 с двумя показателями антиоксидантного профиля при первом психотическом эпизоде параноидной шизофрении и алкогольном делирии. Nrf2 при шизофреническом психозе коррелирует только с тиоловым звеном, при алкогольном — как с емкостью, обусловленной мочевой кислотой, так и с тиоловым звеном антиоксидантной системы.

Тиоловое звено представлено системой глутатиона. Для синтеза восстановленной формы глутатиона наиболее значима глутаматцистеинлигаза, состоящая из каталитической и модифицирующей субъединиц, которые синтезируются отдельно друг от друга генами Gclc и Gclm [22]. Фактор Nrf2 активирует экспрессию гена Gclc, кодирующего синтез каталитической субъединицы [23]. Именно «тиоловый» окислительный стресс является наиболее значимым для активации Nrf2, поскольку определяет модификацию SH-групп цистеинов, входящих в состав белка Keap1.

В случае психоза при шизофрении уровень экспрессии белка Nrf2 в МНК не только не повышен, но и снижен по сравнению с нормой. Возможно, это связано с влиянием провоспалительного сигнального пути NF-kB, конкурентного по отношению к сигнальному пути Nrf2. Взаимодействие между этими путями и их роль по отношению друг к другу была выявлена впервые у мышей с нейродегенеративным фенотипом [24]. Кроме того, взаимодействие между сигнальными путями Keap1/Nrf2 и IkB/NF-κB меняется под действием внеклеточной ДНК [25]. Можно предположить, что снижение белка Nrf2 в МНК связано с нарастающим процессом воспаления у пациентов с первым психотическим эпизодом, что в конечном итоге приводит к более выраженному «тиоловому» стрессу, чем у пациентов с алкогольным психозом.

В активации Nrf2 отмечена роль и мочевой кислоты — конечного продукта пуринового обмена и основного антиоксиданта плазмы крови [26]. На модели паркинсонизма мышей показано, что мочевая кислота за счет Nrf2 усиливала экспрессию трех генов, включая каталитическую единицу глутаматцистеинлигазы, гемоксигеназу (HO-1) и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазу типа 1 (NQO1), при этом в черной субстанции повышался уровень супроксиддисмутазы, каталазы, глутатиона и снижался уровень малонового диальдегида, маркера липидного повреждения [27, 28].

В литературе есть данные, подтверждающие дисфункцию пуринового обмена у пациентов с шизофренией, для которых характерен повышенный уровень мочевой кислоты, по сравнению со здоровыми индивидами, хотя и не связанный с тяжестью психотического эпизода [29]. По всей видимости, особенности протекающих патофизиологических процессов при шизофрении не позволяют повысить экспрессию Nrf2 за счет мочевой кислоты, и в данном случае корреляция между ее антиоксидантной емкостью и уровнем экспрессии Nrf2 не прослеживается.

Повышенный уровень экспрессии Nrf2 в МНК при алкогольном психозе показывает масштабное включение этого белка в активацию антиоксидантной защиты с целью компенсации нарушенного окислительного равновесия. Этиология и патогенез алкогольного делирия подразумевают системный и быстрый ответ организма. Это объясняет выявленную повышенную более чем в 2 раза экспрессию белка Nrf2 в МНК, а также снижение «тиоловой» антиоксидантной емкости у меньшего числа пациентов с алкогольным психозом по сравнению с шизофренией.

По результатам работы можно сделать следующие выводы: 1) при острых психозах шизофренического и алкогольного генеза развивается системный окислительный стресс, отражающийся в снижении общей антиоксидантной емкости плазмы крови, обусловленной мочевой кислотой, и «тиоловой» антиоксидантной емкости, обусловленной меркаптоальбумином; «тиоловый» окислительный стресс при шизофренических психозах проявляется в большем количестве случаев, чем при алкогольных, что может свидетельствовать о нарушенных механизмах ответа на окислительный стресс при шизофрении; 2) терапия антипсихотическими препаратами приводит к компенсации системного окислительного стресса в основном за счет антиоксидантной емкости, обусловленной мочевой кислотой; «тиоловый» окислительный стресс компенсируется в меньшей мере; 3) уровень экспрессии белка Nrf2 в мононуклеарах периферической крови у пациентов с шизофренией значимо ниже, чем у больных алкоголизмом, и ниже, чем в группе контроля, что свидетельствует о нарушениях при шизофрении активации пути Nrf2; 4) в случае алкогольного делирия снижение как общей, так и «тиоловой» антиоксидантной емкости находится в обратной связи средней силы с уровнем белка Nrf2 в мононуклеарах, в случае первично выявленного шизофренического психоза показана обратная корреляция средней силы только с «тиоловой» антиоксидантной емкостью, из чего можно предположить нарушения активации Nrf2 при шизофрении, связанные с участием мочевой кислоты.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов №18-00-01511-КОМФИ (хемилюминесцентный анализ) и 17-29-06017 офи_м (эксперименты по проточной цитофлуориметрии).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.