Одной из гипотез патогенеза шизофрении является аутоиммунная гипотеза, которая была предложена в середине XX века [1] и активно разрабатывается в настоящее время. Более того, интерес к ней повысился в связи с появлением данных о наличии при шизофрении воспаления в ткани мозга [2—4]. В последнее время много внимания уделяется хроническому «низкоуровневому» нейровоспалению, в котором активно участвуют глиальные клетки (астроглия, микроглия) [5], сосудистая стенка и сами нейроны, продуцирующие каскад провоспалительных цитокинов [6, 7]. Допускают, что к процессу нейровоспаления может подключаться неспецифическое периферическое иммунное звено, активируемое этими цитокинами [8]. Речь идет, в частности, о нейтрофилах в периферической крови, об участии которых в патогенезе шизофрении свидетельствует ряд публикаций [8—10]. Показаны повышенная продукция активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами и их корреляция с негативной симптоматикой [9], повышение нейтрофильно/лимфоцитарного индекса [10, 11], увеличение активности эластазы нейтрофилов [12]. Имеются данные и о том, что лечение больных антипсихотическими препаратами может приводить к появлению в кровотоке незрелых нейтрофилов [13]. Но в целом функция нейтрофилов при шизофрении изучена недостаточно.
В иммунологическом аспекте изучается и патогенез такого нейродегенеративного заболевания, как болезнь Альцгеймера (БА). При этой форме психической патологии отмечена значимая роль нейтрофилов [14], и высказано предположение, что они могут способствовать как повреждению нейронов (за счет продукции АФК), так и устранению амилоидных бляшек (за счет действия специфических белков). Было установлено, что при БА повышается количество CD11 [15], CD14 и CD16 нейтрофилов, в то время как продукция CD88 падает [16], страдает функция фагоцитоза [16], повышена продукция АФК и имеется склонность к образованию внеклеточных нейтрофильных образований [17].
Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучение функциональной активности нейтрофилов при психической патологии заслуживает пристального внимания, в том числе в аспекте разработки противовоспалительной терапии.
Цель исследования — при помощи новой оригинальной методики хемилюминометрии с двустадийной стимуляцией нейтрофилов оценить их радикал-продуцирующую активность при параноидной шизофрении и БА.
Материал и методы
В проспективное исследование были включены 40 больных с параноидной формой шизофрении и 22 больных с БА, которых наблюдали в Психиатрическом стационаре им. В.А. Гиляровского (филиал Московской психиатрической клинической больницы №4). В период проведения исследования больным проводили терапию антипсихотиками в полном объеме согласно стандартам оказания помощи.
Медиана возраста пациентов с шизофренией составила 34 года (от 21 года до 65 лет), медиана возраста пациентов с БА — 83 года (от 64 до 88 лет).
В качестве группы контроля были обследованы 12 здоровых — медиана возраста 80 лет (от 75 до 86 лет). Референтный интервал для показателей, характеризующих радикал-продуцирующую активность нейтрофилов практически здоровых (возраст от 18 до 55 лет), был определен ранее [18].
Критериями невключения в исследование были острый и хронический инфекционный процессы, туберкулез, онкологические заболевания, декомпенсированный сахарный диабет.
Исследование радикал-продуцирующей активности нейтрофилов крови проводили по оригинальной методике люминол-активированной кинетической хемилюминометрии с двустадийной стимуляцией [18] на 12-канальном хемилюминометре Lum-1200 («ДИСофт», Россия). В кювету, содержащую раствор Хенкса (рН 7,4), стабилизированный HEPES (все реагенты «Sigma-Aldrich», США) и люминол (45 мкМ), помещали 25 мкл цельной крови, отобранной в вакутейнеры с гепарином, и регистрировали спонтанную хемилюминесценцию в течение 10 мин, затем вносили праймирующий стимул форбол-12-миристат-13-ацетат — ФМА (50 нг/мл). После 15 мин инкубации вносили второй стимул N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин — фМЛФ (10 мкМ), регистрировали хемилюминесцентный ответ в течение не менее 60 мин.
Референтный интервал для показателей, характеризующих радикал-продуцирующую активность нейтрофилов у здоровых (возраст от 18 до 55 лет), был определен ранее [18].
Пример хемилюминограммы отклика нейтрофилов здорового человека на стимул приведен на рис. 1.
Статистическую обработку данных проводили, используя программный пакет STATISTICA («StatSoft», США). Достоверность различия между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни.
Результаты и обсуждение
Радикал-продуцирующую активность нейтрофилов характеризовали следующими показателями: 1) удельная спонтанная активность нейтрофилов А*сп — уровень нестимулированной хемилюминесценции, измеренный на 10-й минуте регистрации, приведенный к количеству нейтрофилов; 2) удельная стимулированная активность нейтрофилов А*фМЛФ — максимальная амплитуда дважды стимулированной хемилюминесценции, приведенная к количеству нейтрофилов; 3) коэффициент затухания Kd, условная характеристика крутизны спадания ответа нейтрофилов, равная отношению уровня стимулированной хемилюминесценции на 23-й минуте после добавления второго стимула к максимальной амплитуде ответа. Косвенно характеризует наличие в пуле «медленных» активных нейтрофилов [19]. Полученные результаты и описательная статистика приведены в таблице.
Использованный в этой работе метод имеет несколько преимуществ перед методами с одностадийной стимуляцией. На первом этапе осуществляется праймирование фагоцитов за счет ФМА, на втором — после воздействия рецепторного стимула происходит ответ, в котором вырабатывается максимально возможный ресурс нейтрофила. Это позволяет унифицировать форму кривых и достичь существенно лучших аналитических характеристик методики. В отличие от стандартных тестов активность нейтрофилов характеризуется несколькими показателями: базальная активность, активность нейтрофила в ответ на два стимула и скорость затухания ответа, свидетельствующая о наличии в пуле активных нейтрофилов.
Из полученных данных следует, что радикал-продуцирующая активность нейтрофилов при БА не отличается значимо от показателей группы контроля (по критерию Манна—Уитни p>0,10 для всех трех показателей активности нейтрофилов). В группе параноидной шизофрении показатели активности нейтрофилов соответствовали референтному интервалу. Однако, при качественной визуализации кривых нейтрофильного ответа, в группах при параноидной шизофрении и БА были выявлены различия. Так, вариант развития реакции нейтрофилов на стимуляцию в группе БА не отличался от кривых развития хемилюминесценции, характерных для здоровых (см. рис. 1). Что касается больных шизофренией, то из 40 хемилюминограмм пациентов в 5 случаях наблюдали медленную вспышку, свидетельствующую о напряженности нейтрофильного иммунитета (рис. 2, а), а в 10 случаях хемилюминограммы были специфического, «треугольного» вида (см. рис. 2, б).
Ранее было доказано, что медленная вспышка отражает продукцию внутриклеточных АФК. Ее наблюдали при сепсисе, преэклампсии, тяжелой ожоговой болезни [20]. Так как у пациентов с шизофренией не было выявлено сопутствующей острой или хронической патологии, можно предположить, что подобная активация нейтрофильной функции связана с основным заболеванием.
«Треугольный» вид хемилюминограмм ранее не наблюдали (в этом случае мы можем привести примеры предшествующих исследований системной красной волчанки, системных васкулитов, привычного невынашивания беременности, преэклампсии, ожоговой болезни, сахарного диабета 2-го типа, миелодиспластического синдрома и субарахноидального кровоизлияния). Для выяснения механизма активации нейтрофилов и значимости этого феномена требуются дополнительные исследования.
Таким образом, можно утверждать, что у значимой части пациентов с параноидной шизофренией (15 из 40) на качественном уровне изменена радикал-продуцирующая активность нейтрофилов.
В свете полученных результатов представляло интерес оценить возможное действие нейролептиков на активность нейтрофилов. В мировой литературе этому вопросу посвящено ограниченное количество исследований, а полученные данные являются отрывочными: в экспериментах in vitro на крови здоровых доноров показано, что инкубация с галоперидолом и хлорпромазином приводит к усилению продукции полиаминов нейтрофилами [21], клозапин и галоперидол в экспериментах in vitro усиливали фагоцитарную активность нейтрофилов здоровых доноров, активность миелопероксидазы и продукцию ИЛ-8 [22], в экспериментах in vitro с нейтрофилами здоровых доноров инкубация с клозапином снижала хемотаксис нейтрофилов к ИЛ-8 [23].
В данной работе был проведен эксперимент, в котором цельную кровь практически здоровых лиц (4 мужчины в возрасте от 25 до 40 лет) инкубировали в течение 15 мин с галоперидолом или хлорпромазином (конечные концентрации 1 мкг/мл и 0,1 мг/мл соответственно). У инкубированных с этими препаратами нейтрофилов снижалась стимулированная активность в 1,5—1,9 раза, однако праймированная активность усиливалась примерно в 8—12 раз (рис. 3). По-видмому, антипсихотические препараты модулируют активность нейтрофилов сложным образом. С одной стороны, усиливается готовность нейтрофилов к ответу на стимулы, но на стимуляцию рецепторов формилпептидов (часть бактериальных белков) нейтрофилы отвечают хуже. Эти данные следует рассматривать как ориентировочные. В дальнейшем целесообразно провести аналогичные эксперименты с нейтрофилами больных, не получавших медикаментозного лечения.
По результатам работы можно сделать следующие выводы: 1) радикал-продуцирующая активность нейтрофилов у пациентов с БА соответствует как по количественным показателям, так и по форме реакции (кривой) на стимулы таковой в группе контроля; 2) в группе параноидной шизофрении почти у 1/3 пациентов качественно изменен радикал-продуцирующий профиль нейтрофилов, при этом количественные показатели соответствуют возрастной норме; 3) инкубация нейтрофилов здоровых с галоперидолом и аминазином модулирует активность нейтрофилов — снижается отклик на рецепторный стимул фМЛФ, но повышается отклик на праймирующий стимул ФМА.
В целом можно констатировать в ряде случаев параноидной шизофрении вовлечение нейтрофильного звена иммунитета в патогенез заболевания. Для выяснения конкретных механизмов требуются дополнительные исследования.
Работа поддержана грантом РФФИ №18-00-01511.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.