Острый период при моделировании черепно-мозговой травмы у крыс: немедленные судороги, повреждение функциональных зон новой коры и нарушения поведения

Ранний период ЧТМ у пациента может сопровождаться развитием острых судорожных приступов и неврологического дефицита, а в отдаленном периоде возможно появление эмоциональных, когнитивных расстройств и посттравматической эпилепсии [1], однако механизмы этих нарушений до конца не установлены [2]. Немедленные и острые судорожные приступы являются значимым фактором риска посттравматической эпилепсии в клинике [3], однако детальный анализ их семиологии и установление связи с острым повреждением определенных зон неокортекса у больных затруднены. В связи с этим для понимания механизмов последствий ЧМТ используют модель дозированного латерального гидродинамического удара на животных [4—6], которая в контролируемых условиях позволяет провести детальный анализ немедленных судорожных приступов и последующих поведенческих и патоморфологических нарушений [7—8]. Для установления повреждения конкретных анатомических и функциональных областей головного мозга крысы в результате ЧМТ возможно использование «плоских карт» [9]. На настоящий момент сопоставление семиологии острых судорог и в целом поведенческих особенностей острого периода с морфологическими изменениями в неокортексе у грызунов в раннем периоде ЧМТ проведено не в полной мере. Одной из причин является нанесение ЧМТ животным под наркозом, обладающим нейропротективным эффектом [10], что может оказывать существенное влияние как на судорожную активность, так и на ее последствия. До сих пор в остром периоде ЧМТ не был проведен патоморфологический анализ методом, учитывающим постепенное формирование зоны глиоза и некроза в новой коре [11].

Цель исследования — качественная и количественная оценка острых судорожных приступов, анализ поведенческих нарушений в остром периоде ЧМТ и сопоставление их с повреждением функциональных областей в неокортексе крыс.

В работе использовали 48 самцов крыс линии Wistar массой 400—500 г в возрасте 6 мес.

ЧМТ моделировали у 20 животных (группа ЧМТ) при помощи нанесения латерального гидродинамического удара в область правой сенсомоторной коры силой около 3 атм [7—8]. Проводили видеозапись в момент травмы и в течение 5 мин острого посттравматического периода. По видеозаписям анализировали семиологию судорожного приступа (прыжок, побежку, шагательные движения, тоническую и клоническую фазы приступа, судороги хвоста и движения вибрисс) и длительность каждого проявления. Ложную операцию (ЛО) осуществляли также у 20 животных (группа ЛО) без нанесения ЧМТ; 8 крысам группы чистого контроля (ЧК) применяли только поведенческие тесты.

Первую серию животных (11 крыс— ЛО, 8 — ЧМТ) выводили из эксперимента на 3-и сутки после ЧМТ без проведения поведенческих тестов. У крыс второй серии (9 крыс — ЛО, 12 — ЧМТ) и крыс группы ЧК оценивали поведение в тестах «темная—светлая камера» и «открытое поле» на 5-е сутки, в тесте «крестообразный приподнятый лабиринт» — на 6-е сутки после ЧМТ. Животных выводили из эксперимента на 7-е сутки.

Всем животным для последующего гистологического анализа проводили прижизненную внутрисердечную перфузию 4% раствором формальдегида в фосфатном буфере (pH 7,4). Анализировали срезы мозга толщиной 50 мкм от 1 до 7 мм каудальнее брегмы с расстоянием 600 мкм между ними, окрашенные по методу Ниссля. Микрофотографии делали на микроскопе Keyence BZ-X700. Дальнейшие расчеты площади производили с помощью программы ImageJ. По полученным микрофотографиям (8—9 срезов от каждой крысы) определяли координаты границ области повреждения в коре и с помощью «плоских карт» головного мозга крысы выявляли анатомические области повреждения для каждого животного, а также рассчитывали площадь повреждения на «плоской карте», среднюю степень повреждения на анализируемых срезах и максимальную степень повреждения на всех срезах для каждой крысы. Степень повреждения коры определяли качественно на каждом срезе: 1 балл — глиоз 6-го слоя коры и прилежащего белого вещества; 2 балла — некроз 6-го слоя коры и прилежащего белого вещества и глиоз 3—6-го слоев коры; 3 балла — некроз 3—6-го слоев коры и глиоз 1—6-го слоев коры; 4 балла — некроз всех слоев коры.

Достоверность изменений при сравнении групп определяли с помощью теста Манна—Уитни, для оценки связи элементов острых судорог и повреждения определенных зон неокортекса использовали бинарную логистическую регрессию. Данные представлены в виде M±SEM.

Острая летальность при моделировании ЧМТ составила 15%. Судороги той или иной степени выраженности наблюдались у 100% животных сразу после нанесения ЧМТ, что оказалось выше по сравнению с ранее опубликованными данными [5]. Разница объясняется тем, что гидродинамический удар крысам наносили после полного выхода из наркоза, что более адекватно моделирует ЧМТ у пациента. Первой реакцией на травму был прыжок (у 69% крыс), после которого у крысы развивались билатеральные клонические (94%) и тонические (63%) судороги, пробежка (19%), судороги вибрисс (32%) и хвоста (32%). Длительность судорог в среднем составила 10,4±1,5 с. Последовательность судорожных проявлений широко варьировала, несмотря на одинаковую локализацию и силу травмы. Чтобы выяснить, объясняется ли вариабельность семиологии немедленных судорог вовлечением различных функциональных зон коры, было проведено подробное патоморфологическое исследование головного мозга крыс через 3 и 7 сут после ЧМТ (в период активного формирования очага повреждения).

Средняя площадь очага повреждения в коре при проецировании на «плоскую карту» на 3-и сутки составляла 9,44 мм², на 7-е сутки — 12,41 мм² (см. рисунок

Далее были проанализированы особенности поведения животных в различных тестах и сопоставлены с повреждением в неокортексе. Анализ поведения выявил изменения в поведении крыс группы ЧМТ при сравнении с крысами группы ЛО: уменьшение числа стоек, уменьшение числа умываний в тесте «открытое поле», уменьшение числа стоек в тесте «темная-светлая камера» (p<0,05). Латентность достижения периферической части открытого поля (концентрическое поле с границей 10 см от стенки поля (см. рисунок д, е) была выше у крыс после ЧМТ (p<0,05). Длительность нахождения носа крысы и число пересечений носом промежуточной части открытого поля (концентрическое поле — 10—20 см от стенки поля) были меньше у крыс с ЧМТ при сравнении с крысами группы ЛО (p<0,05) (рисунок д, е), при этом туловище крысы не выходило за пределы периферической части открытого поля. Оба этих параметра коррелировали со степенью повреждения неокортекса (p<0,05): вышеописанные изменения проявлялись в большей степени у крыс с массивным некрозом коры. С учетом вовлечения преимущественно сенсорных областей коры эти изменения могли носить характер сенсорного дефицита при ориентировании и активном обследовании новой территории (обнюхивание, ощупывание вибриссами, вертикальная активность), однако эти проявления могли сочетаться и с ранними когнитивными нарушениями (уменьшение исследовательской активности в целом).

На основании настоящего исследования были сделаны следующие выводы:

— немедленные судорожные приступы после ЧСМВ возникают у 100% животных;

— впервые проведенный детальный анализ повреждения функциональных зон неокортекса в остром периоде ЧМТ при помощи «плоских карт» позволил установить формирование зоны некроза в остром периоде ЧМТ и образование в коре очага повреждения сложной формы, выходящего далеко за пределы области прямого воздействия;

— при детальном анализе семиологии судорог и сопоставлении с вовлечением функциональных зон новой коры закономерностей, которые могли бы объяснить вариабельность судорожных проявлений повреждением определенных областей коры, выявлено не было;

— изменения поведения крыс в открытом поле в остром периоде ЧМТ, вероятно, связаны с сенсорными нарушениями, что соответствует повреждению преимущественно сенсорных областей коры, подтверждающемуся зависимостью поведенческих нарушений от степени соответствующих повреждений.

Исследование поддержано грантами РФФИ № 18−315−00146 и 19−015−00258

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Комольцев И.Г. —https://orcid.org/0000-0002-4918-6411; e-mail: komoltsev.ilia@gmail.com

Франкевич С.О. — https://orcid.org/0000-0003-2203-5418; e-mail: stepan.frankevich@yandex.ru

Широбокова Н.И. — https://orcid.org/0000-0002-9016-912X; e-mail: mr.brightside144@mail.ru

Волкова А.А. — https://orcid.org/0000-0002-0028-3763; e-mail: kitemmman@gmail.com

Новикова М.Р. — https://orcid.org/0000-0002-5349-1793; e-mail:mrnovikova.ihna@mail.ru

Гуляева Н.В. — https://orcid.org/0000-0002-5380-7954; e-mail: nata_gul@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Комольцев Илья Геральдович — e-mail: komoltsev.ilia@gmail.com