Острые нарушения мозгового кровообращения являются ведущей причиной заболеваемости, смертности и инвалидизации. В РФ инсульт ежегодно развивается у 450 тыс. человек, летальный исход в остром периоде заболевания составляет до 35% случаев [1]; 31% выживших после инсульта нуждается в посторонней помощи, 20% — самостоятельно не передвигаются и лишь 8% — возвращаются к прежней работе [2].

Ведущим методом лечения инсульта является реперфузионная терапия, которая, однако, не всегда может быть своевременно применена и имеет ряд противопоказаний [3].

В качестве другого важного вида фармакотерапии рассматривается использование нейропротекторов, но существующие лекарственные средства недостаточно эффективны, их действие в значительной степени зависит от времени начала применения. Поэтому актуальной является проблема создания лекарственных средств с широким терапевтическим окном.

Накоплено большое количество данных, свидетельствующих о патогенетическом значении эндогенного нейропротективного белка — фактора роста нервов (NGF) и о перспективах разработки на его основе новых препаратов для фармакотерапии инсульта. Эффективность полноразмерного NGF при внутримозговом и интраназальном введении была подтверждена с использованием экспериментальных моделей ишемии головного мозга, при этом наиболее важно, что активность выявлена при начале введения как в короткие, до нескольких часов, сроки, так и через 24 ч после возникновения ишемии [4, 5]. Однако нативный NGF не применяется в клинике в связи с неудовлетворительной фармакокинетикой и серьезными побочными эффектами.

В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова создан низкомолекулярный миметик фактора роста нервов — димерный дипептид ГК-2^​1​᠎, активирующий специфические для NGF тирозинкиназные TrkA-рецепторы и избирательно включающий пострецепторный сигнальный путь Akt, преимущественно вовлеченный в нейропротекцию [6].

ГК-2 проявлял выраженные терапевтические эффекты на разных моделях ишемии головного мозга [7]. При этом ГК-2 не обладал побочными эффектами, характерными для полноразмерного белка, а именно не вызывал гипералгезии и потери веса при длительном введении в наиболее эффективной дозе [8]. Кроме того, ГК-2 продемонстрировал нейропротективную активность in vivo в дозах 0,01—5 мг/кг внутрибрюшинно и 5—10 мг/кг перорально на ряде моделей болезней Альцгеймера, Паркинсона и сахарного диабета [6].

Цель данной работы — оценка терапевтических эффектов ГК-2 на модели ишемического инсульта, вызванного транзиторной окклюзией средней мозговой артерии у крыс.

Эксперименты проведены на 33 беспородных крысах-самцах и 81 крысах-самцах линии Вистар, 23 из которых были получены в филиале «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства и 58 в питомнике лабораторных животных «Пущино» при филиале Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Животных содержали в условиях вивария при естественной смене светового режима со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде.

Ишемический инсульт моделировали внутрисосудистым перекрытием среднемозговой артерии [9]. Все хирургические манипуляции осуществляли с помощью титановых микрохирургических инструментов. Крыс вводили в наркоз 5% раствором хлоралгидрата (350 мг/кг внутрибрюшинно). Выполняли срединный разрез в области шеи и выделяли с правой стороны шеи сонный треугольник, образованный сверху двубрюшной, латерально-грудиноключично-сосцевидной и медиально-грудиноподъязычной мышцами. В сонном треугольнике выделяли сонный сосудисто-нервный пучок, образованный общей сонной артерией и блуждающим нервом. Осторожно отделяли блуждающий нерв и накладывали микрохирургическую сосудистую титановую клипсу на общую сонную артерию на 1,5 см ниже ее бифуркации. Аккуратно выделяли из спаек наружную и внутреннюю сонные артерии. На наружную сонную артерию накладывали хлопчато-бумажную нить, плотно затягивали. На внутреннюю — викриловую нить, затягивали неплотно, после чего перерезали наружную сонную артерию проксимальнее наложения нити. Гепаринизированную нейлоновую нить диаметром 0,25 мм вводили через культю наружной сонной артерии во внутреннюю на глубину 19—20 мм (до перекрытия средней мозговой артерии) и фиксировали микрососудистой клипсой. Перекрытие кровотока осуществляли в течение 60 мин, после чего нить извлекали из сосуда, восстанавливая кровоснабжение в бассейне средней мозговой артерии. После извлечения нити культю наружной сонной артерии закрывали коагуляцией электрокаутером до полной герметичности. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением перерезания сосудов и введения нити. Срединный разрез шеи зашивали хлопчатобумажными нитями и обрабатывали стрептоцидом.

Дипептид ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) был синтезирован в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова. Хлоралгидрат получен в фирме «Merck KgaA» (Германия); фосфатно-солевой буфер и 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) — в компании «Sigma-Aldrich» (США). Использовали титановые микрохирургические инструменты фирмы ООО «Титан серджикл» (Россия).

Дизайн исследования. Фармакологическая активность ГК-2 в условиях временно́го окна 4, 6, 8 и 24 ч была изучена в разных экспериментах.

Эксперимент 1 (изучение фармакологической активности ГК-2 при первом введении через 4 ч после операции) — 33 беспородные крысы-самца массой 300—340 г на момент начала эксперимента.

Эксперимент 2 (изучение фармакологической активности ГК-2 при первом введении через 6 ч после операции) — 28 крыс-самцов линии Вистар массой 240—290 г на момент начала эксперимента (питомник «Пущино»).

Эксперимент 3 (изучение фармакологической активности ГК-2 при первом введении через 8 ч после операции) — 23 крысы-самца линии Вистар массой 250—300 г на момент начала эксперимента (питомник «Столбовая»).

Эксперимент 4 (изучение фармакологической активности ГК-2 при первом введении через 24 ч после операции) — 30 крыс-самцов линии Вистар массой 235—265 г на момент начала эксперимента (питомник «Пущино»).

В каждом эксперименте оперированных животных случайным образом делили на две группы — «инсульт» (оперированные нелеченые животные) и получавшие ГК-2. ГК-2 в дозе 1 мг/кг (внутрибрюшинно), разведенный в воде для инъекций, вводили животным через 4, 6, 8 или 24 ч после операции и затем 1 раз в сутки, окончание введения — на 6-е сутки после операции. Крысы из групп «инсульт» и «ложная операция» получали в том же режиме воду для инъекций. Массу тела крыс измеряли перед операцией, а также на 3-и и 6-е сутки после операции. Неврологический дефицит оценивали в тесте стимулирования конечностей [10] на 3-и и 6-е сутки после операции. На 7-е сутки животных декапитировали и определяли объем инфаркта с помощью анализа отсканированных изображений срезов мозга, окрашенных ТТХ [11].

Тест стимулирования конечностей. Данный тест заключается в оценке ответа задних и передних конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию. До начала эксперимента крыс приучали к рукам. Тест состоял из семи различных испытаний для левой и правой стороны тела: 1. Крысу передними конечностями размещали на краю стола, придерживая туловище животного. Каждую переднюю лапу поочередно аккуратно сталкивали с края стола, контролируя ее возвращение и размещение. В норме крыса сразу же возвращала свою конечность на место. 2. Выполнялось так же, как первое испытание, но голову крысы отводили вверх под углом 45°, таким образом не давая ей возможность видеть поверхность стола или контактировать с ней вибриссами. 3. Крысу размещали параллельно краю стола и переднюю лапу отводили вбок. В норме крыса сразу же возвращает свою конечность на место. 4. Так же, как и в 3-м испытании, но только для задней конечности. 5. Крысу со стороны хвоста ставили на край стола и каждую заднюю лапу поочередно отводили вниз. 6. Крысу размещали передними лапами у края стола и аккуратно подталкивали за туловище по направлению к краю стола. В норме крыса сопротивляется толканию, перебирая и упираясь передними лапами, но у крыс с ишемией мозга поврежденная конечность соскальзывает. 7. Крысу держали за основание хвоста и медленно опускали на поверхность стола. В норме крыса вытягивает вперед передние конечности за 10 см от поверхности стола.

Для оценки нарушений в работе конечностей использовали следующую систему подсчета: 2 балла — крыса полностью выполнила испытание; 1 балл — крыса выполнила испытание с задержкой в более чем 2 с и/или неполностью; 0 баллов — крыса не отвечала на стимулирование конечности. Максимально возможное суммарное количество баллов равно 14 для каждой стороны тела.

Оценка объема инфаркта мозга. На 7-е сутки животных декапитировали под глубоким наркозом (хлоралгидрат, 350 мг/кг, внутрибрюшинно). Головной мозг извлекали и помещали, чтобы отмыть от крови, на 1 мин в емкость с физиологическим раствором. Затем мозг замораживали при –20 °С в течение 12 мин и с помощью специальной формы с пазами для точной резки и микротомных лезвий разрезали на 5 фронтальных срезов толщиной 1,7 мм. Срезы мозга помещали в чашку Петри с 2% раствором ТТХ в фосфатно-солевом буфере и инкубировали в течение 15 мин при 37 °C. Затем срезы переворачивали и инкубировали еще 15 мин при 37 °C, после чего фиксировали в 10% формалине в течение 30 мин. Затем срезы помещали на предметные стекла и сканировали с двух сторон с помощью планшетного сканера с разрешением 2400 dpi в режиме цветного изображения. С помощью свободно распространяемой программы Image J («National Institutes of Health», США) измеряли площадь инфаркта (неокрашенная область) и площадь всего среза.

Объем ишемического инфаркта определяли по формуле:

V=d×ΣA_i/2,

где ΣA_i — сумма площадей области повреждения на срезах мозга с каждой из сторон, d — толщина среза.

При работе соблюдали требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований. Все манипуляции с животными были одобрены биоэтической комиссией НИИ фармакологии им. В.В. Закусова.

Межгрупповые различия оценивали с помощью U-теста Манна—Уитни и точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Данные представляли в форме средних и стандартных ошибок среднего (M±δ.

Вышедшие из наркоза животные выживали хорошо, наблюдались лишь единичные случаи гибели (1—2 крысы в группе). Достоверных межгрупповых различий по выживаемости не было.

По результатам морфометрии срезов головного мозга, окрашенных ТТХ, у оперированных животных была выявлена выраженная зона инфаркта в правом полушарии, включающая кору и стриатум.

Показано, что ГК-2 во всех изученных условиях статистически достоверно снижал объем повреждения мозга на 20—60% (см. рисунок,

(V (группа «инсульт») — V (группа «инсульт+ГК-2»)/V (группа «инсульт»)×100%,

где V — объем инфаркта мозга.

Максимальный эффект ГК-2 зарегистрирован при начале введения через 6—8 ч после операции. При введении через 24 ч эффект сохранялся.

На рисунке показано влияние ГК-2 на объем инфаркта мозга в зависимости от времени начала введения в % от объема повреждения в группе нелеченых животных.

У ложнооперированных животных отсутствовал неврологический дефицит в тесте стимулирования конечностей. Количество баллов для левой и правой стороны тела у животных этой группы составляло 14 на 3-и и 6-е сутки после операции. У оперированных животных наблюдался выраженный неврологический дефицит, что проявлялось в нарушении ответа на тактильную и проприоцептивную стимуляцию передней и задней левых конечностей (контралатеральных по отношению к повреждению). По данному параметру оперированные животные статистически достоверно отличались от ложнооперированных на 3-и и 6-е сутки после операции. ГК-2 статистически достоверно улучшал неврологический статус оперированных животных на 3-и сутки после операции при начале введения через 6 и 24 ч после операции и на 7-е сутки при начале введения через 24 ч (табл. 2).

Установлено, что низкомолекулярный миметик NGF ГК-2 выраженно снижает объем повреждения мозга на 24—60% в условиях окклюзии средней мозговой артерии у крыс при начале введения через 4, 6, 8 и 24 ч после операции. Максимальную активность пептид проявлял при первом введении через 6 и 8 ч.

Действие большинства применяющихся в клинике инсультов нейропротективных препаратов направлено на прерывание глутамат-кальциевого каскада и/или на подавление окислительного стресса. Такие препараты обладают небольшим терапевтическим окном и невысокой эффективностью [12]. Препарат цитиколин с другим механизмом действия [13] оказался эффективным в рандомизированных многоцентровых плацебо-контролируемых исследованиях, однако имеются и противоположные данные, полученные в исследовании ICTUS [14].

Теоретически высокоэффективный препарат для лечения последствий инсультов должен оказывать положительное действие на разные механизмы повреждения нейронов в условиях ишемии, обладать антиапоптотической активностью, сохранять эффективность при отставленном начале введения, а также стимулировать нейрорегенеративные процессы.

Физиологические данные показывают, что нейропротективными и нейрорегенеративными свойствами обладает NGF. NGF эффективно противодействует глутаматной токсичности [15], участвует в защите клеток от окислительного стресса, стимулируя экспрессию белков-антиоксидантов, например белка теплового шока HSP32 (гемоксигеназа 1), супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы [16], проявляет выраженную антиапоптотическую активность, снижая экспрессию проапоптотических белков, таких как Bax и каспаза-3, и стимулируя экспрессию антиапоптотических белков, таких как Bcl-2 [6, 17]. Кроме того, NGF участвует в стимуляции нейрогенеза [18], в том числе в условиях экспериментальной церебральной ишемии [4] и стимулирует ангиогенез [19]. В совокупности эти свойства определяют его эффективность при отставленном начале введения при инсульте. На модели транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у крыс было установлено, что NGF (интраназально) значимо улучшает неврологический статус при введении через 24 ч после операции [4].

Дипептид ГК-2, подобно полноразмерному белку, оказывает нейропротективное действие на модели ишемического инсульта, в том числе при начале введения, отставленном вплоть до 24 ч.

Зависимость выраженности эффектов ГК-2 от времени начала его введения можно объяснить данными по динамике уровня эндогенного NGF при острой ишемии мозга.

Большое количество работ свидетельствует об участии NGF в компенсаторных механизмах при ишемических повреждениях мозга. Так, в эксперименте было установлено, что в первые несколько часов после начала церебральной ишемии резко увеличивается как экспрессия мРНК NGF, так и самого белка, что рассматривается в качестве эндогенного механизма нейропротекции [5, 20]. Содержание эндогенного NGF на экспериментальных моделях инсульта начинает снижаться через 4—6 ч после начала ишемии [20, 21]. В наших опытах нейропротективный эффект ГК-2 при начале его введения через 1 ч [22] и 4 ч после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у крыс был сравнительно небольшим, объем инфаркта мозга снижался на 20—30%. Не исключено, что в этих условиях ГК-2 действовал на фоне высокого уровня эндогенного NGF. Максимума эффект ГК-2 достигал при первом введении через 6—8 ч, когда содержание эндогенного NGF падает [20, 21]. В нейропротективное действие ГК-2 при первом введении через 24 ч, исходя из данных литературы [4, 18], может включаться и стимуляция нейрогенеза.

Таким образом, совокупность результатов настоящего исследования позволяет заключить, что ГК-2 является перспективным соединением для дальнейшей разработки в качестве лекарственного средства для лечения инсультов.

Доклиническая разработка ГК-2 в качестве лекарственного средства для лечения острого и хронического нарушений мозгового кровообращения включена в Федеральную целевую программу «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 г. и дальнейшую перспективу», Государственный контракт № 14.N08.12.0051.

Таким образом, димерный дипептидный миметик NGF ГК-2 (1 мг/кг/сут, внутрибрюшинно) проявляет нейропротективную активность на модели транзиторной окклюзии средней мозговой артерии при начале его введения через 4, 6, 8 и 24 ч после повреждения. Максимальную активность пептид проявляет при первом введении через 6 и 8 ч после индукции церебральной ишемии.

Работа была выполнена при поддержке РНФ (проект № 18−15−00381) и РФФИ (проект № 18−015−00228).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: povarnina@gmail.com