Биомаркеры нейротоксичности как потенциальные индикаторы ишемии спинного мозга

Ишемия, или инфаркт спинного мозга (ИСМ), в МКБ-10 соответствует рубрике G95.1 «Сосудистые миелопатии». Речь идет о тяжелом заболевании с острым или подострым течением, неврологические проявления и последствия которого зависят от локализации и обширности ишемического очага в спинном мозге (СМ), а также индивидуальных особенностей его кровоснабжения [1, 2]. К основным причинам ИСМ относят сосудистые факторы (патология аорты и артерий СМ, включая артериовенозные мальформации, кардиоэмболия, системная гипотензия), компрессионные факторы (грыжа диска, травма позвоночника), а также оперативные вмешательства на аорте и позвоночнике [3, 4].

Большинство вызывающих ишемию спинного мозга состояний поддаются лечению при своевременном выявлении [5]. Часть из них требует консервативного лечения, другая — оперативного вмешательства [3]. Поэтому основным требованием, предъявляемым к новым диагностическим технологиям, является способность выявлять развивающуюся ишемию в острой фазе заболевания или предишемические процессы, способствуя раннему лечению и/или профилактике [6].

Лабораторное экспресс-тестирование, основанное на обнаружении специфичных биомаркеров ишемического поражения СМ, может стать важным дополнением к существующим методам диагностики.

Развивающаяся концепция биомаркеров нейротоксичности, в основе которой лежат представления о нейрососудистой единице и ее регуляции рецепторами глутамата [7, 8], позволяет выявить область мозга, где происходит поражение сосудов, и может определять тяжесть процесса на ранних сроках заболевания.

Цель настоящего исследования — изучение уровня потенциальных биомаркеров нейротоксичности — антител (Ат) к рецепторам глутамата в биологических жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость — ЦСЖ) пациентов с сосудистой миелопатией наряду с традиционными методами исследования. Сравнительным маркером были выбраны Ат к белку S100β, являющемуся показателем повреждения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Материал и методы

40 пациентов с клиническими признаками сосудистой миелопатии были обследованы на базе неврологического отделения № 1 (зав. отделением А.А. Готовчиков) клиники Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П. Павлова Минздрава России в период 2015—2017 гг. Из них 10 пациентов поступили с клинической картиной острого спинального инсульта, 30 — с подострым и хроническим течением заболевания длительностью не более 50 мес.

Критериями включения в исследование были отсутствие острых и хронических нарушений мозгового кровообращения в анамнезе, выполнение магнитно-резонансной томографии (МРТ) позвоночника и СМ. В процессе обработки данных из исследования были исключены 6 пациентов, перенесших церебральный инсульт, 4 — имевших противопоказания к выполнению МРТ, 3 — не подписавших информированное согласие. В итоге в исследование были включены 27 пациентов с ИСМ, 10 мужчин и 17 женщин (средний возраст 56,8 года), составившие основную группу.

Группы сравнения включали 30 пациентов со спондилогенной радикулопатией без признаков ИСМ, 18 мужчин и 12 женщин (средний возраст 42 года) и 30 — с острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК) по ишемическому типу длительностью до 2 нед, 19 мужчин и 11 женщин (средний возраст 56,6 года). В группу контроля вошли 15 здоровых, 9 мужчин и 6 женщин (средний возраст 41 год). Все участники подписали информированное согласие на проведение исследования, утвержденное этическим комитетом указанного университета (протокол № 6 от 30.10.15).

Клиническое обследование. Всем пациентам проводили полное неврологическое обследование, включавшее оценку мышечного тонуса и силы по 6-балльной шкале, рефлексов, поверхностной и глубокой чувствительности, функции тазовых органов.

Нейрорадиологические методы. Нейрорадиологическое исследование СМ было проведено всем пациентам основной группы на высокопольном магнитно-резонансном томографе Signa 1,5 Т («GE Hangweti Medical Systems Co. Ltd») в режимах Т1-взвешенное изображение (ВИ), Т2-ВИ, Т2 FLAIR, STIR. Всем пациентам с ОНМК проведена компьютерная томография на мультиспиральном компьютерном томографе Bright Speed Excel («GE Hangweti Medical Systems Co. Ltd») согласно существующим стандартам.

Биохимические методы. Концентрация Ат к основным рецепторам глутамата (NR2-субъединица NMDA-, AMPA/каинатные рецепторы)^1᠎ в сыворотке крови и ЦСЖ исследована методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов Gold Dot («CIS Biotech Inc», США) и ООО ДРД (ИЦ «Сколково», Россия) согласно инструкциям. Образцы сывороток и ЦСЖ до проведения анализа хранили при –80 ºС не более 6 мес. Для сыворотки верхней границей нормальных величин считали концентрацию Ат к NR2 NMDA 2,0 нг/мл, к AMPA- и каинатным рецепторам 1,5 нг/мл, для ЦСЖ 5,0 нг/мл [9, 10].

Титр Ат к белку S100β определяли при помощи набора ГЭБ-ИФА-Тест (ООО «Герофарм», Россия) методом ИФА согласно инструкции. Содержание Ат выражали в единицах оптической плотности (ед.опт.пл.) при длине волны 450 нм, границей нормальных величин считали значения, равные 0,1 ед.опт.пл. [11].

Статистический анализ был проведен с использованием пакета программ SAS 9.4 определением непараметрической корреляции Спирмена. Сравнительный анализ уровня антител к рецепторам глутамата и белку S100β в сыворотке крови с учетом общей выборки и количества исследуемых групп проводили при расчете критерия Краскела—Уоллиса. Уровень антител к рецепторам глутамата в ЦСЖ в двух группах определяли, используя U-критерий Манна—Уитни. Значения считали значимыми при p<0,05.

Результаты

У 10 пациентов с признаками сосудистой миелопатии наблюдалось острое течение заболевания по типу спинального инсульта. В основном причиной острой ишемии служили артериовенозные мальформации (22,2%) в виде спинальной дуральной артериовенозной фистулы. У 3 (11,1%) пациентов выявлены тромбозы радикуломедуллярных артерий. Подострое и хроническое течение миелоишемии диагностировали в 17 случаях, из них у 12 (44,4%) пациентов был выявлен ее дискогенный характер. У 6 (22,2%) больных причину ИСМ на момент исследования выявить не удалось.

Проведение МРТ у пациентов с ИСМ позволило детализировать очаги миелопатии. Изолированное поражение шейных сегментов СМ выявлялось в 10 (37%) случаях, грудных — в 6 (22,2%), пояснично-крестцовых — в 2 (7,4%). Сочетанное поражение шейного и грудного отделов было у 3 (11,1%) пациентов, грудопоясничного отдела — у 6 (22,2%).

Наиболее отчетливое изменение сигнала от СМ наблюдалось в режимах Т2-ВИ (рис. 1)

Рис. 1. МРТ грудного отдела позвоночника в сагиттальной (а) и аксиальной (б) плоскостях в режиме Т2-ВИ пациентки 47 лет со спинальным инсультом на фоне наследственной гиперкоагуляции (мутация PAI-1). Повышение сигнала от СМ (стрелки) на протяжении Th7—L1 с утолщением конуса: нижняя параплегия, проводниковые нарушения чувствительности, нейрогенный мочевой пузырь; титр Ат к NR2-пептиду — 2,0 нг/мл, к AMPA — 0,8 нг/мл, к каинатному рецептору — 3,2 нг/мл, к S100β — 0,053 ед.опт.пл.

и STIR.

Исследование сыворотки крови пациентов основной группы показало значимое превышение уровня Ат к NR2-субъединице NMDA-рецептора (среднее значение 2,30 нг/мл) по сравнению с контролем (p=0,013) и группой пациентов со спондилогенной радикулопатией (p=0,0001). У 9 пациентов основной группы с поражением шейных сегментов СМ был выявлен повышенный титр Ат к каинатному рецептору (p>0,05, рис. 2).

Рис. 2. Концентрация биомаркеров сыворотки крови (критерий Краскелла—Уоллиса). По оси ординат: а — Ат к AMPA-рецептору (нг/мл); б — Ат к каинатному рецептору (нг/мл); в — Ат к NR2-рецептору (нг/мл); г — Ат к белку S100β (ед.опт.пл.). По оси абсцисс: группы — 1) контрольная, 2) группа сравнения со спондилогенной радикулопатией, 3) группа сравнения с ОНМК, 4) основная с ИСМ.

Следует отметить, что у части обследованных наблюдалось повышение уровня Ат сыворотки крови более чем к одному типу рецепторов глутамата. Так, у 5 пациентов было обнаружено превышение референсных значений Ат к NR2 и AMPA-рецепторам. В то же время 8 пациентов имели высокие показатели Ат к NR2 и каинатным рецепторам. В основном это были пациенты с тетрапарезом или нижней параплегией, проводниковыми чувствительными и вегетативными расстройствами.

Высокий титр Ат к NR2 выявлялся также в сыворотке крови больных, перенесших ОНМК (p>0,05). Ни в одной из исследуемых групп не было выявлено высоких показателей Ат к АМРА-рецептору (p>0,05, см. рис. 2). Анализ уровня Ат сыворотки крови к белку S100β показал незначительное повышение данного показателя лишь в группе пациентов со спондилогенной радикулопатией (p>0,05, см. рис. 2). В таблице

Уровень Ат к рецепторам глутамата и белку S100β в сыворотке крови пациентов Примечание. * — p<0,05 по сравнению с контролем.

и на рис. 2 представлен сравнительный анализ Ат сыворотоки крови.

Иммунобиохимический анализ ЦСЖ проведен у 16 (59,3% от всей выборки) пациентов с ИСМ и 17 (56,6%) — с радикулопатией, при этом у первых выявлено значимое повышение уровня Ат к NR2 NMDA-рецептору (p=0,0005). Значимого повышения концентраций Ат к другим подтипам глутаматных рецепторов не наблюдалось (рис. 3).

Рис. 3. Концентрация биомаркеров в ЦСЖ (критерий Краскела—Уоллиса). По оси ординат: а — Ат к AMPA-рецептору (нг/мл). По оси абсцисс: группы — 1) сравнения со спондилогенной радикулопатией, 2) основная с ИСМ.

Зависимость между уровнем биомаркеров крови и данными МР-исследования в виде размера очага сосудистой миелопатии (в см по длиннику) рассчитана с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Положительная умеренная корреляционная связь (r=0,49, p<0,05) выявлена между титром Ат к NR2A NMDA-рецептору в сыворотке и размером очага повышенной интенсивности сигнала на Т2-ВИ (рис. 4).

Рис. 4. Положительная корреляционная связь между концентрацией Ат в сыворотке к NR2 NMDA-рецептору (ось ординат) и размером очага ишемии спинного мозга по данным МРТ (ось абсцисс). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена, r=0,49.

Обсуждение

Относительно небольшая распространенность (1—2% от всех инсультов, или 5—8% от всех заболеваний СМ с примерной ежегодной заболеваемостью 12 человек на 100 000) и сложность диагностики ИСМ не позволяют проводить крупные клинические исследования в области спинальной ангионеврологии [2, 12—15]. Поэтому рекомендации и протоколы по диагностике и лечению сосудистой миелопатии еще не разработаны [6, 16, 17].

Золотым стандартом диагностики ИСМ является МРТ [18, 19]. Однако в остром периоде заболевания изменение интенсивности сигнала в веществе СМ по данным 1,5 Т МРТ зачастую отсутствует [16] и может быть выявлено лишь в 45% случаев на Т2-ВИ [20]. Применение высокочувствительного режима диффузионно-взвешенного изображения МРТ в диагностике поражений СМ затруднительно ввиду ряда технических причин [18, 21, 22]. МР-изменения при ИСМ могут быть схожи с таковыми при других миелопатиях, в частности поперечном миелите [14, 22]. Поэтому в настоящее время основной целью выполнения МРТ при подозрении на ИСМ считается исключение других, компрессионных и некомпрессионных, причин миелопатии [5, 23].

Таким образом, с точки зрения клинической неврологии, актуальным является комбинированный диагностический подход с использованием лабораторных гемотестов и инструментальных методов исследования.

В патогенезе ИСМ, как и при церебральном инсульте, ведущую роль играют процессы глутаматной нейротоксичности. Тем не менее особенности строения, гистоархитектоники и васкуляризации СМ определяют клинические последствия ишемического процесса. Особенно важным является вопрос первичного поражения серого либо белого вещества С.М. Поражение серого вещества считается более благоприятным, проявляясь сегментарными неврологическими расстройствами, в то время как белого — ассоциировано с тяжелыми проводниковыми расстройствами [24].

В связи с этим объектом нашего исследования стали Ат к известным типам рецепторов глутамата (NR2-субъединица NMDA-, AMPA/каинатные), до этого подробно изученные в условиях травмы и ишемии головного мозга [9, 25].

В данном исследовании у пациентов с сосудистой миелопатией по сравнению с контролем было выявлено значимое повышение Ат к NR2-субъединице NMDA-рецепторов глутамата в сыворотке крови, что может говорить об участии этих рецепторов в регуляции артериального кровообращения в сером веществе С.М. Данный биомаркер был также обнаружен нами в ЦСЖ пациентов с ИСМ, что может указывать на его специфичность. При этом высокие значения связаны, по-видимому, с более длительной циркуляцией Ат в ЦСЖ. У части пациентов с клинически более тяжелым течением миелоишемии были обнаружены высокие титры Ат не только к NR2, но и к AMPA/каинатным рецепторам, что, вероятно, свидетельствует об участии последних в регуляции венозного кровообращения, главным образом в белом веществе. Также стоит отметить, что высокие титры Ат к каинатному рецептору отмечались в основном у лиц с поражением шейного отдела СМ.

Повышение Ат к NR2 у пациентов, перенесших ОНМК, подтверждает участие данного рецептора в регуляции артериального кровообращения и его роль в патогенезе ишемии ЦНС. При этом мы не обнаружили повышения уровня Ат к ГЭБ-ассоциированному белку S100β ни в одной из групп с ишемией ЦНС.

Результаты проведенного исследования демонстрируют прямую связь между данными иммунобиохимического и нейровизуализационного исследований и оставляют предпосылки для дальнейших масштабных исследований в области спинальной ангионеврологии.

Таким образом, применение биомаркеров нейротоксичности (рецепторы глутамата и Ат к ним) в клинической неврологии в совокупности с существующими инструментальными методиками может рационализировать диагностику острой и подострой ИСМ, способствовать раннему началу терапии, а также оптимизировать ведение больных благодаря мониторингу тяжести состояния и эффектов лечения.

Интегративный подход к диагностике и персонифицированному лечению с учетом тяжести сосудистой и травматической миелопатии может оказаться полезным для снижения социально-экономических затрат, связанных с последствиями ИСМ и потерей трудоспособности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: grigoryponomarev@yandex.ru

¹NMDA-рецептор — рецептор N-метил-D-аспартата; AMPA-рецептор — рецептор α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты.