Снижение когнитивного функционирования (нейрокогнитивный дефицит) является одним из наиболее значимых проявлений шизофрении. Нейрокогнитивный дефицит проявляется в виде характерных нарушений мышления, внимания и коммуникаций, а также широкого круга познавательных процессов (различные аспекты вербальной и зрительно-пространственной памяти и научения, скорость психомоторных реакций, планирование и контроль, обобщение и формирование понятий, способность переключаться с одного модуса действия на другой), оцениваемых с помощью стандартизованных нейропсихологических тестов. Когнитивные нарушения у больных шизофренией являются одним из ведущих синдромов этого эндогенного заболевания наряду с позитивными, негативными и другими расстройствами [1]. В пользу этого предположения свидетельствуют такие факты как: 1) независимость когнитивного снижения от уровня интеллектуального развития; 2) наличие когнитивного дефицита у больных, не лечившихся психофармакологическими средствами, и у больных с первым эпизодом болезни; 3) появление признаков когнитивного снижения до начала эндогенного психоза и резкое снижение когнитивных функций после начала болезни, последующая относительная стабилизация в ходе дальнейшего развития болезненного процесса. Нейрокогнитивный дефицит существенно осложняет социальную адаптацию и качество жизни больного и, в худшем случае, является причиной инвалидизации, ложащейся тяжелым бременем на членов семьи больного и общество в целом. Он рассматривается также [2—4] как один из важных факторов при оценке прогноза развития болезни.

Наследуемость когнитивных нарушений при эндогенных психозах довольно высока. Более того, выявленные у больных нарушения, хотя и менее выраженные, отмечаются и у их психически здоровых родственников [5, 6].

В свете изложенных данных ведется активный поиск генов, которые могут быть связаны с нейрокогнитивным дефицитом при шизофрении. Анализ ассоциаций с функциональными генами-кандидатами, а также сканирование генома с помощью биочипов позволили выявить несколько значимых генов-кандидатов. Это гены цинк-пальцевого белка 804A ZNF804A [7], катехол-о-метилтрансферазы (СОМТ) [8], кальциевого канала SCN2A [9], а также гены глутаматергической системы [10]. В то же время бо́льшая часть вариативности риска развития когнитивных нарушений у больных остается необъясненной. Это может быть связано с тем, что при рассмотрении этиологии болезни не учитывается роль эпигенетических факторов, регулирующих экспрессию генов путем модификации хроматина, в частности метилирования ДНК. Эпигенетические аспекты когнитивного дефицита у больных шизофренией практически еще не изучены. Первым шагом к их исследованию является выбор генов-кандидатов и соответствующих мишеней (однонуклеотидных вариаций, или SNV от англ. single nucleotide variant) как в этих генах, так и в геноме в целом для выявления участков метилирования.

Цель настоящей работы — разработка стратегии такого поиска и составление списка мишеней, который необходим для дальнейшего эпигенетического исследования, в частности получения продуктов в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с бисульфитно-конвертированной ДНК для выбранных мишеней и последующей расшифровки их нуклеотидной последовательности (секвенирования).

Выбор полиморфизмов проводили: 1) на основании данных литературы о статусе метилирования генов у больных шизофренией; 2) в сайтах метилирования (CpG) в регионах сцепления, обнаруженных при полногеномных анализах ассоциаций на шизофрению (GWAS от англ. Genome Wide association study), 3) среди SNV, которые расположены внутри сайтов связывания транскрипционных факторов. При этом учитывалось, что SNV внутри сайта CpG (CpG-SNV) могут оказывать сильное влияние на уровень метилирования соседних цитозинов [11, 12] и часто ассоциированы со сложными наследственными заболеваниями [13]. Полиморфизмы, попадающие внутрь сайтов связывания транскрипционных факторов, также могут быть с большей вероятностью функционально значимыми [14].

Для решения первой задачи при выборе мишеней был проведен анализ источников литературы в базах данных PubMed (с 1966 г. по настоящее время). Использовали следующие группы ключевых слов для поиска: 1) epigenetics, genome-wide association studies, GWAS, epigenome-wide association studies, EWAS, DNA methylation, CpG; 2) schizophrenia, cognitive deficit, cognitive impairment. Поиск проводили для сочетаний ключевых слов из первой и второй групп. Для решения второй задачи полиморфизмы (SNP, делеции и инсерции), изменяющие или создающие CpG, были определены на референтном геноме hg19 с помощью специально написанной программы.

Поиск публикаций по приведенным выше ключевым словам и их сочетаниям показал, что наибольшее число ссылок соответствует сочетанию «GWAS-schizophrenia» (1256), далее следуют сочетания «DNA-methylation—schizophrenia» (363) и «epigenetics—schizophrenia» (280). Значительно меньшее число публикаций соответствовало сочетаниям «GWAS-cognitive impairment-schizophrenia» (20), «DNA methylation — cognitive impairment — schizophrenia» (8) и «DNA methylation — cognitive deficit — schizophrenia» (2).

По результатам поиска литературы были выбраны и проанализированы статьи по полногеномным анализам метилирования при шизофрении. Изучены работы, выполненные с использованием образцов ДНК, выделенных из крови [15—20] и посмертно взятого головного мозга [21—24]. В этих работах с помощью высокопроизводительных методов с использованием биочипов сравнивается уровень метилирования в CpG в группах больных шизофренией и здоровых людей. В зависимости от используемого метода можно проанализировать от десятков до сотен тысяч сайтов в геноме. Согласно данным разных работ, у больных шизофренией имеются отличия в статусе метилирования, причем число генов, в которых обнаружены отличия, может варьировать от десятков до тысяч. Анализ этих данных показал, что число мишеней, для которых обнаружена надежно воспроизводимая ассоциация с заболеванием, чрезвычайно мало.

По результатам проведенной работы в список мишеней были включены некоторые из традиционных генов-кандидатов шизофрении, а также гены и участки генома, в которых статус метилирования у больных в наибольшей степени отличался от контрольной группы здоровых людей.

1. Ген мозгового нейротрофического фактора (BDNF)— сайты метилирования в этом гене расположены вблизи хорошо изученного полиморфизма Val66Met (rs6265). Во многих работах показано, что полиморфизм Val66Met влияет на когнитивные функции у больных шизофренией [см. обзоры 25, 26]. Исследование метилирования гена вблизи rs6265 показало, что его уровень связан с точностью выполнения теста, оценивающего рабочую память, и изменением активности префронтальной коры по результатам функциональной магнитно-резонансной томографии (ф-МРТ) у здоровых людей [27].

2. Ген COMT. Полиморфизм Val158Met (rs4680) в экзоне 4 связан с образованием сайта CpG только у носителей аллеля Val. Кроме того, в недавнем исследовании обнаружены новые сайты метилирования, расположенные в экзоне 2 и промоторе гена [28]. Метилирование в локусе rs4680 было ассоциировано с рабочей памятью у здоровых людей [29], а метилирование в промоторе гена COMT, связанной с мембранами (MB-COMT), — с нейрональной активностью в левой дорсолатеральной префронтальной коре [30].

3. Ген рилина (RELN). Известно, что регуляция промотора этого гена осуществляется за счет метилирования ДНК, при этом метилирование влияет на активность RELN, что приводит к снижению когнитивных функций [31].

4. Ген, кодирующий малый ядерный рибонуклепротеиновый полипептид N (SNRPN). Ген содержит участки, различающиеся по уровню метилирования, которые влияют на уровень его экспрессии; обнаружена ассоциация между экспрессией гена и снижением когнитивного функционирования при синдроме Прадера—Вилли и расстройствах аутистического спектра [32].

5. Ген, кодирующий субъединицу протеасомы^​1​᠎ А4 (PSMA4). Полиморфизмы в этом гене ассоциированы как с метилированием в эмбриональном мозге, так и с шизофренией по данным GWAS [33].

6. Ген, кодирующий FAM63B (семейство родственных белков 63, член В). FAM63B входит в систему, которая может быть связана с дифференциацией нейронов и экспрессией генов дофаминергической системы. В исследовании [19] показано, что FAM63B является значимым маркером метилирования ДНК при шизофрении.

7. Ген акцессорного белка рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP). В этом гене с образованием CpG-сайта связан полиморфизм rs16872141. Показано, что статус метилирования в сайте rs16872141 изменен как в ДНК, выделенной из крови, так и в образцах аутопсийного мозга [34].

8. Интрон гена MAD1L1 (район пробы cg25323444), в котором, по данным работы [20], были обнаружены различия в уровне метилирования между больными шизофренией и здоровыми людьми.

Для составления выборки CpG-SNV были использованы следующие критерии включения: 1) оценка неравновесия по сцеплению D’ в регионе CpG-SNV с индексным полиморфизмом GWAS на шизофрению не менее 0,9 [35]; 2) частота минорного аллеля не менее 25%; 3) для полиморфизмов, обусловленных заменой цитозина на тимин, наличие в регионе (2,5 тысяч пар нуклеотидов) мишени полиморфизма с идеальным сцеплением (r^2=1). Последнее условие необходимо для того, чтобы отличать в результатах секвенирования бисульфитно-конвертированной ДНК варианты, содержащие тимин, от вариантов, содержащих конвертированный неметилированный цитозин. Конкретные значения частоты полиморфизмов были определены по составной выборке людей европейского происхождения, приведенных в международном проекте 1000 геномов (http://www.internationalgenome.org/). CpG-SNV, расположенные на расстоянии друг от друга не более 2,5 тыс. пар нуклеотидов, были объединены в одну мишень. Всего нами было найдено 750 мишеней, удовлетворяющих приведенным выше критериям включения.

Для поиска полиморфизмов вокруг SNV, расположенных внутри сайтов связывания транскрипционных факторов, были использованы позиционные матрицы связывания транскрипционных факторов из базы данных HOCOMOCO [36] для поиска SNV, изменяющих или создающих сайты связывания транскрипционного фактора. Критерии включения были те же, что и для CpG-SNV. В результате было выбрано несколько транскрипционных факторов, для которых известна их роль в регулировании работы нейрональных клеток (NRSF, EGR1, TCF4, MEF2C и другие), а также транскрипционный фактор CTCF.

Всего в список были включены 406 мишеней.

Полный их список доступен в сети Интернет по адресу:

https://docs.google.com/spreadsheets/d/12q8qf3f0W0Ol0 jOMvqySmDueX0ja3w5IrZzCjB5vRQ/edit?usp=sharing

Таким образом, на основании анализа данных литературы и биоинформатического анализа составлен список кандидатных регионов (мишеней) для проверки отличий в статусе метилирования ДНК при оценке эффективности выполнения нейрокогнитивных тестов у больных шизофренией и психически здоровых людей.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00056).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.