Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — наследственное рецессивное, сцепленное с Х-хромосомой нервно-мышечное заболевание. Страдает 1 из 3500 новорожденных мальчиков, болезнь проявляется прогрессирующей мышечной слабостью и атрофией мышц тазового пояса, ног, кардиомиопатией и в 20—30% когнитивными расстройствами [1]. В настоящее время исследования МДД проводятся в направлении изучения патогенеза когнитивных расстройств и поиска медикаментозной терапии. Генетической основой МДД являются мутации в гене дистрофина, являющегося самым большим геном человека с весьма сложной молекулярной организацией: содержит как минимум 5 промоторов, 79 экзонов и кодирует белок с молекулярной массой 427 килодальтон [2]. Дистрофин относится к классу спектрин-актиновых мембранных белков и выполняет структурную роль в мышечных волокнах, обеспечивая их целостность путем стабилизации клеточной мембраны [3]. В норме в мышечном волокне он локализуется на цитоплазматической поверхности сарколеммы, являясь важной составной частью цитоскелета и обеспечивая связь между актиновыми филаментами и сарколеммой [4]. Кроме того, белок дистрофин входит в состав дистрофин-гликопротеинового комплекса (ДГК) [5]. Он присутствует не только в мышечных клетках, но и нейронах, участвуя в работе потенциалзависимых каналов и формировании синапсов [6]. Ген дистрофина отличается большим количеством кодируемых тканеспецифичных изоформ. В настоящее время известно более десятка изоформ, экспрессия которых регулируется внутренними промоторами: Dp427, Dp260, Dpl40, Dp116, Dp71, и тех, которые встречаются в различных органах (лимфоциты, почки, кора головного мозга, мозжечок, периферические нервы, шванновские клетки, сетчатка глаза) [7—10]. Ген дистрофина характеризуется полиморфизмом происходящих в нем мутаций, как точечных, так и протяженных — делеций и дупликаций [11, 12]. Они располагаются по длине гена неравномерно, чаще в его начале (5’-концевая область) и середине (3’-концевая) [12]. Появление в организме мутантных форм белка приводит к нарушениям функций ДГК и мышечной и нервной системы [13]. Существует мнение [14], что изменение в экспрессии изоформы Dpl40 является одним из факторов, приводящих к развитию когнитивных расстройств у больных с МДД. Так, было выявлено [15], что у больных с МДД с мутацией в области промоторов изоформ Dp140 и Dp71 имеет место более низкий индекс IQ, чем при мутации в месте расположения промотора Dp260 и Dp116. В то же время ряд ученых [16] связывают частоту и степень выраженности когнитивных расстройств у больных с МДД с отсутствием сразу нескольких изоформ белка дистрофина, кодируемых в дистальной части гена. И хотя мутации в гене дистрофина уже давно признаны причиной развития когнитивных нарушений у больных с МДД, имеются случаи, когда больные не имеют выраженного когнитивного дефицита [17]. Таким образом, механизм возникновения когнитивных расстройств у больных с МДД остается не до конца изученным и имеет ряд спорных вопросов.

Цель исследования — уточнение патогенеза когнитивных расстройств у больных с МДД в клинико-лабораторном и молекулярно-генетическом исследовании.

Под нашим наблюдением в клинике Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова в условиях стационарного отделения и в рамках работы выездной службы Санкт-Петербургского городского детского хосписа находились 36 больных с МДД мужского пола в возрасте от 5 до 22 лет (средний возраст — 13,7 года). Контрольную группу составили 30 здоровых (7 лет — 22 года, средний возраст — 13,8 года).

Проводили клиническое, молекулярно-генетическое и лабораторное исследования.

Клинико-неврологическое исследование осуществляли по общепринятому протоколу с включением нейропсихологического тестирования для определения степени выраженности когнитивных расстройств [18]. Применяли следующие методики для исследования памяти: запоминание десяти слов; запоминание девяти геометрических фигур; отсроченное воспроизведение десяти слов и девяти геометрических фигур; «двойной тест» Мучника—Смирнова. Для исследования мышления были использованы две методики: «сравнение понятий» и «направленные вербальные ассоциации», для исследования внимания применяли методику с использованием таблиц Шульте. Использовали адаптированные методики, учитывающие возрастные особенности больных с МДД — память, внимание и мышление оценивали от 1 до 30 баллов, результаты тестирования суммировали. Это позволило дифференцировать выявленные когнитивные нарушения по степени тяжести на умеренные и выраженные расстройства когнитивной сферы (от 1 до 30 баллов — выраженные нарушения когнитивной сферы, от 31 до 60 — умеренные и от 61 балла до 90 баллов — их отсутствие).

Поиск делеций в гене дистрофина осуществляли методом мультиплексной полимеразно-цепной реакции (20 экзонов и промоторная область). Поиск делеций и дупликаций проводили с помощью мультиплексной амплификации лигированных зондов (79 экзонов и промоторная область). В работе использовали наборы зондов P034 и P035 («MRC-Holland», Нидерланды). Анализ проводили с помощью автоматической системы капиллярного электрофореза ABI 3130×1 («Applied Biosystems», США). Выявление точковых мутаций было осуществленно в отделе молекулярной генетики госпиталя Кошан (Париж, Франция) методом секвенирования следующего поколения с последующей верификацией по Сэнджеру.

Определение уровня нейротрофинов (фактор роста головного мозга — ФРГМ, фактор роста нерва — ФРН и цилиарный нейротрофический фактор — ЦНТФ) проводили иммуноферментным методом в образцах сыворотки крови. Были использованы иммуноферментные наборы фирмы «RayBiotech, Inc». Пороговые величины определения ФРГМ, ФРН, ЦНТФ имели следующие значения: 20, 14 и 8 пг/мл соответственно. Все эти нейротрофические факторы участвуют в процессе дифференцировки нейронов: ФРГМ регулирует процесс созревания синапсов, ФРН необходим для роста аксонов и ветвления дендритов, а ЦНТФ относится к семейству нейропоэтических цитокинов и рассматривается как ключевой фактор для жизнедеятельности глиальных клеток [19].

Проводили сравнительный анализ когнитивных расстройств, особенностей генома больных с МДД и уровня нейротрофинов в сыворотке крови. Больные с МДД были разделены на две группы по наличию когнитивных расстройств: 1-я группа — без когнитивных расстройств (n=17); 2-я группа — с умеренными и выраженными когнитивными расстройствами (n=19). В дальнейшем для уточнения роли расположения мутации больные с подтвержденной мутацией были разделены на две группы по принципу ее расположения в проксимальном отделе гена МДД Х-хромосомы (с 1-го по 40-й экзон) (n=8) или дистальном отделе с 41-го по 79-й экзон (n=16). Такое распределение было продиктовано данными о роли изоформ белка дистрофина, экспрессируемых с дистальной части гена Dp140 и Dp71 в развитии когнитивных расстройств у больных с МДД [20].

В ходе исследования применяли следующие методы статистического анализа: определение числовых характеристик переменных; оценку соответствия эмпирического закона распределения количественных переменных теоретическому закону нормального распределения по критерию Шапиро—Уилка, оценку значимости различия средних арифметических значений в независимых выборках с использованием Т-критерия Стьюдента. Описание количественных признаков было выполнено с использованием среднего арифметического значения и стандартного отклонения. Нулевую статистическую гипотезу отвергали при уровне значимости p<0,05. Статистический анализ осуществляли с использованием пакета программ Statistica 8.0 («StatSoft, Inc.», США).

У 63% больных с МДД заболевание дебютировало в возрасте 2—5 лет, у 37% — в 5—7 лет. У всех больных заболевание начиналось с поражения мышц тазового пояса и проксимальных отделов ног и носило неуклонно прогрессирующий характер. Основными клиническими симптомами были слабость и атрофия мышц ног и тазового пояса с развитием псевдогипертрофий икроножных мышц (рис. 1).

Данные иммуноферментного анализа нейротрофинов свидетельствуют, что концентрации ФРН в сыворотке крови у больных с МДД выше, чем в контрольной группе, — 2391 [1587; 4136] и 553 пг/мл [314; 864] соответственно (р<0,001).

Молекулярно-генетическое исследование установило в 58% случаев наличие делеций и дупликаций, в 8% — нонсенс-мутаций в различных экзонах. Распределение мутаций в гене МДД носило неравномерный характер, наиболее часто они встречались на участке гена с 43-й по 50-й экзон (рис. 3).

Анализ места расположения мутации в гене МДД позволил выявить, что имеет место нарушенный синтез изоформ белка дистрофина Dp260 (n=17), изоформ Dp140 (n=15), Dp116 (n=1) и Dp71 (n=1). У 15 больных отмечалась мутация в гене МДД в экзонах, влияющих на синтез двух (Dp260 и Dp140) (n=14) и более изоформ (Dp140, Dp260, Dp116 и Dp71) (n=1) (табл. 1).

Полученные результаты клинико-неврологического, молекулярно-генетического и лабораторного исследований были сопоставлены с целью уточнения роли генетических и биохимических факторов в развитии когнитивных расстройств при МДД. Было выявлено достоверное снижение концентрации нейротрофина ФРГМ во 2-й группе. Проверка эмпирического распределения переменных, характеризующих концентрацию нейротрофинов, в соответствии с законом нормального распределения по критерию Шапиро—Уилка показала достоверное различие (p<0,01). Таким образом, для описания числовых характеристик указанных количественных признаков наиболее адекватно использование медианы и квартилей: Me [Q25%; Q75%], здесь и далее средняя тенденция количественной случайной величины будет описываться медианой, а особенности закона распределения уточняться границами интерквартильного размаха (рис. 4).

Таким образом, концентрация ФРГМ имеет статистические значимые различия в группах пациентов с наличием и отсутствием когнитивных расстройств (p<0,001). Во 2-й группе наблюдалась сниженная концентрация ФРГМ — 23 670 [21 700; 30 720] пг/мл против 32 700 [31 660; 33 750] пг/мл в 1-й группе. Для данного показателя был выполнен расчет абсолютного риска варианта течения МДД с когнитивными нарушениями, отношения шансов этого риска (ОШ) и 95% доверительного интервала (ДИ) О.Ш. Уровень ФРГМ был разделен на два интервала в соответствии с законом распределения этой переменной в группах. В табл. 2 представлены

По сравнению с данной группой у пациентов с концентрацией ФРГМ менее 31 000 пг/мл риск неблагоприятного течения составил 75% (15 из 20 пациентов), шансы развития когнитивных расстройств статистически значимо (p<0,001) увеличивались более чем в 10 раз (ОШ=12,0; 95% ДИ ОШ=[1,9—76,4]).

Нейротрофины ФРН и ЦНТФ не имели достоверных различий между показателями концентрации в 1-й и 2-й группах. При исследовании концентрации нейротрофинов в зависимости от места расположения мутации в гене МДД было выявлено достоверное снижение концентрации ФРН в группе с дистальным расположением мутации. Для уточнения роли расположения мутации в гене МДД и развития когнитивных расстройств у больных было проведено сопоставление данных молекулярно-генетического и клинико-нейропсихологического исследования, которое не выявило достоверных различий по наличию когнитивных расстройств и месту расположения мутации в гене МДД. Однако более выраженные нарушения в когнитивной сфере наблюдались у больных с МДД с расположением мутации в дистальном отделе гена МДД. Изучение роли отдельных изоформ белка дистрофина в развитии когнитивных расстройств не позволило выявить достоверных данных вследствие недостаточности клинических наблюдений.

Клинико-нейропсихологическое исследование больных с МДД в 33% случаев выявило когнитивные нарушения различной степени выраженности. В последние годы изучение патогенеза когнитивных расстройств у больных с МДД имело приоритетное направление — выявление связи между когнитивным дефицитом и местом расположения мутации в гене МДД. Было отмечено, что среди больных с МДД при делеции 52-го экзона чаще диагностировались когнитивные расстройства [21]. Однако ряд исследователей [22] объясняют это тем, что при МДД чаще выявляются мутации в экзонах 44—53, тем самым формируется более обширная когорта больных. Среди обследованных нами больных 65% имели мутации в гене МДД, расположенные в экзонах 43—53, т. е. дистальной части гена. Известно [23], что дистальное расположение мутации в гене белка МДД является предрасполагающим фактором для развития когнитивных расстройств. В нашем исследовании более выраженные нарушения когнитивной сферы были зафиксированы также у больных с дистальным расположением мутации в гене белка МДД. В настоящее время активно изучается [24] вклад различных изоформ белка МДД в развитие когнитивных нарушений. Установлено [25, 26], что для когнитивных расстройств особенно важны изоформы дистрофина Dp140 и Dp71. По нашим данным, среди выявленных мутаций преобладали затрагивающие синтез изоформы Dp140, так как известно, что промотор изоформы Dp140 располагается в интроне 44. Необходимо отметить, что среди 4 больных МДД с выраженными нарушениями в когнитивной сфере у 3 была выявлена мутация, затрагивающая изоформы Dp260 и Dp140, и у 1 поврежден синтез изоформ Dp140, Dp260, Dp116 и Dp71. Эти данные показывают, что более выраженные когнитивные расстройства присутствуют у больных с наличием мутации в гене МДД, затрагивающей синтез нескольких изоформ белка МДД, однако малочисленность клинических наблюдений не позволяет оценить достоверность полученных результатов. Впервые была предпринята попытка оценить влияние концентрации нейротрофинов в сыворотке крови больных с МДД на развитие когнитивных расстройств и сопоставить полученные данные с результатами молекулярно-генетического анализа. Выявлено, что в группе больных с МДД с наличием когнитивных расстройств имеет место достоверное снижение концентрации нейротрофина ФРГМ. Сопоставляя собственные наблюдения с данными N. Doorenweerd и соавт. [27] по изучению микроструктуры головного мозга у больных с МДД с помощью методики количественной магнитно-резонансной томографии, мы можем гипотетически объяснить роль данного фактора в развитии когнитивного дефицита. Было отмечено, что больные с МДД с наличием мутации, затрагивающей изоформу Dp140 (–), и прошедшие нейропсихологическую экспертизу с худшими результатами, имели меньший объем головного мозга, а также серого вещества по сравнению с группами контроля и больных с МДД с Dp140 (+), получивших положительную оценку при тестировании. Те же авторы, изучая церебральный кровоток у больных с МДД, выявили [28], что часть пациентов имеют сниженную церебральную перфузию. Однако эти данные не коррелировали с уменьшением объема головного мозга и серого вещества у больных с МДД. В то же время больные с нарушениями церебральной гемодинамики имели в гене МДД мутации, затрагивающие изоформу Dp140. Было высказано предположение о влиянии изоформы Dp140 на функционирование сосудистых эндотелиальных клеток и астроцитов, опосредованно влияющих на состояние церебральной перфузии. Вероятно, уменьшение объема головного мозга можно гипотетически связать с низким уровнем нейротрофина ФРГМ, так как именно этот фактор способствует росту и дифференцировке нейронов головного мозга [19]. Нами установлено, что у пациентов с концентрацией ФРГМ менее 31 000 пг/мл риск неблагоприятного течения составил 75% (15 из 20 пациентов), шансы развития когнитивных расстройств статистически значимо (p<0,001) увеличивались более чем в 10 раз (ОШ=12,0; 95% ДИ ОШ=[1,9—76,4]). Отметим, что у больных с МДД с дистально расположенной мутацией в гене имела место более высокая концентрация нейротрофина ФРН. Согласно результатам предыдущих исследований нейротрофической регуляции у детей с тяжелыми формами наследственной и приобретенной патологии ЦНС [29, 30], ФРН является маркером патологического процесса. Необходимо учитывать и нейритингибирующий эффект высоких концентраций ФРН, выявленный в серии экспериментов с сывороткой крови больных спинальной мышечной атрофией в органотипической культуре нервной ткани [31, 32].

Таким образом, в развитии когнитивных расстройств у больных с МДД участвует ряд механизмов, сочетание которых приводит к более выраженному когнитивному дефекту. Среди них отмечаются как молекулярно-генетические факторы — дистальное расположение мутации в гене МДД, влияние различных комбинаций нарушенного синтеза изоформ белка МДД (Dp140, Dp116, Dp260 и Dp71), так и биохимические факторы, связанные с особенностями нейротрофической регуляции, проявляющиеся сниженным уровнем нейротрофина ФРГМ в сыворотке крови у больных с МДД и повышенной концентрацией ФРН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: sokolova.m08@mail.ru