Болезнь Альцгеймера (БА) является одним из наиболее социально значимых заболеваний, которому, как правило, подвержены лица старшей возрастной группы. При Б.А. отмечается комплексное нарушение структуры и функции мозга: дисфункция базальной холинергической системы, нарушение синаптической пластичности, уменьшение численности нейронов. Дисфункция базальной холинергической системы заключается в том, что в аксонах холинергических нейронов, оказавшихся в зоне накопления растворимых олигомеров бета-амилоида (новая кора, гиппокамп, миндалина), развивается затухающая ретроградная нейропатия [1]. Она проявляется нарушением ремоделирования терминалей аксонов, ослаблением синтеза, транспорта и усилением обратного захвата ацетилхолина в нейронах базальной холинергической системы. Нарушение синаптической пластичности в указанных зонах приводит к ослаблению долговременной потенциации синаптического проведения и усилению его долговременной депрессии [2]. Уменьшение численности нейронов наблюдается в поле CA1 гиппокампа, зубчатой фасции, субикулуме, ассоциативных зонах лобной, теменной и височной коры. На поздних стадиях болезни процесс уменьшения численности нейронов распространяется на весь мозг, включая обонятельные луковицы, миндалину, базальное ядро Мейнерта, чёрное вещество, голубое пятно и дорзальное ядро шва. Уменьшение численности нейронов обусловлено активизацией процессов клеточной гибели (апоптоза и некроза) и подавлением созревания и функциональной интеграции новых нейронов. Данные функциональные и морфологические нарушения вызывают прогрессирующую потерю памяти и другие когнитивные и нейропсихиатрические нарушения [3]. Заболевание сопровождается накоплением вокруг нервных клеток и в них изменённого β-амилоидного пептида, а также гиперфосфорилированием тау-белка, развитием окислительного стресса и другими нейропатологическими и метаболическими отклонениями [4]. В качестве мишеней для терапевтического и превентивного воздействия при БА рассматриваются компоненты холинергической нейромедиаторной системы, NMDA-глутаматергические рецепторы, а также ферменты, модифицирующие тау-белок или β-амилоидный пептид [4]. Поскольку исследования механизмов инициации и развития болезни Альцгеймера еще не привели к окончательному пониманию ее природы, существующие способы лечения нацелены в первую очередь на купирование симптомов заболевания. Известно, что БА часто сопровождается угнетением мозгового кровоснабжения и функции эпителия, вероятно, играющим существенную роль в развитии нейродегенеративного процесса [5].

Инновационные препараты, созданные на основе релиз-активных антител (РА АТ) к биологически активным соединениям, давно и успешно применяются в клинике, в том числе и при лечении некоторых психических расстройств. Так, содержащий РА АТ к нейроспецифическому белку S100 анксиолитик и антидепрессант тенотен используется в качестве ноотропного и стресс-протективного препарата [6—12]. Его ноотропный и антиамнестический эффекты показаны, в том числе, в условиях фармакологически вызванной холинергической недостаточности [8]. Импаза, препарат РА АТ к эндотелиальной NO-синтазе (eNOS) — ангиопротектор. Ее эндотелиопротективное действие было выявлено в экспериментальной модели дефицита NO (при введении блокатора NO-синтазы L-NAME). Было установлено [13], что по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, препарат РА АТ eNOS проявил активность, сопоставимую и даже превосходящую таковую у использовавшихся препаратов сравнения (ингибитор ангиотензин-превращающий фермент эналаприл и блокатор рецепторов ангиотензина 1-го типа лозартан).

Диваза сочетает в себе два вышеописанных компонента — РА АТ к S100 и к eNOS. Было показано [14], что этот препарат препятствует развитию патологических последствий гипоксии в ткани мозга, обладает выраженным антиоксидантным действием, а также свойствами анксиолитика и антидепрессанта.

Учитывая изученный комплекс эффектов дивазы, а также ее компонентов, мы предположили, что препарат может обладать антиамнестическим действием. Целью данной работы была проверка этого предположения при моделировании симптомов БА на животных.

Моделирование симптомов БА проводили с помощью интрацеребровентрикулярного введения крысам фрагмента β-амилоидного пептида 25—35 (Аβ_25—35). Он образуется в результате протеолиза основного белка, и по сравнению с полной формой является более активным индуктором характерных для ранних стадий БА поведенческих нарушений у животных [15, 16].

Эксперименты выполнялись на самцах крыс породы Wistar в возрасте 16 нед с массой тела 280—300 г. Интрацеребровентрикулярное введение (icv) фрагмента β-амилоидного пептида Аβ_25—35 проводили в правый боковой желудочек (координаты AP –0.8, L 1.5, H 3.8¹⁶) в дозе 15 нМ на животное с помощью микрошприца (фирмы «Hamilton») (объем введения 5 мкл) [17]. В табл. 1 перечислены экспериментальные группы и их условные обозначения. В качестве контроля использовали группы интактных ложнооперированных крыс и животных, получавших icv инъекцию физиологического раствора. Препаратом сравнения служил мемантин («Merz», Германия). Релиз-активные препараты производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» (Россия) РА АТ S100, РА АТ eNOS и их комбинация РА АТ S100 + РА АТ eNOS использовались в форме водных растворов и вводились через зонд внутрижелудочно в соответствии с их клиническим применением.

На протяжении всего периода эксперимента контролировалась масса тела животных.

С 6-го по 8-й дни после операции исследовательская активность и способность животных запоминать элементы незнакомой обстановки оценивались в тесте распознавания новых объектов [18, 19] на арене площадью 60×60×40 см. В 1-й день животные помещались на арену для адаптации на 5 мин. На 2-й день на арену помещали 2 идентичных нейтральных стеклянных предмета и регистрировали время контакта крыс с предметами. Для тестирования кратковременной памяти через 1 ч один из предметов менялся на новый. Регистрировалось время контакта с «домашним» и новым предметом. Через 24 ч после первоначального помещения в установку для тестирования долговременной памяти животное снова перемещали на арену с новым и «домашним» объектом [18, 19].

На 9-й день после операции у крыс экспериментальных и контрольных групп вырабатывалась условная реакция пассивного избегания (УРПИ) на основе наказания и через 4 сут (на 13-й день после операции) тестировалась сохранность выработанной реакции. УРПИ вырабатывалась в установке, состоящей из освещенной (40×40×40 см) камеры с полом из оргстекла и темной (20×17×20) камеры с металлическим решетчатым полом, на который может подаваться электрическое напряжение. Крыса, помещенная в эту систему камер, под влиянием безусловного («норкового») рефлекса стремится больше времени проводить в темной камере. На этапе обучения крыса помещалась в светлую камеру, в течение 180 с регистрировался латентный период захода в темную камеру. Сразу после перехода крысы в темную камеру на ее пол подавался электрический ток силой 0,6 мА, после чего крыса пересаживалась в «домашнюю» клетку. В результате у животных вырабатывался условный рефлекс пассивного избегания темной камеры. При проверке выработки реакции через 4 сут крыса повторно помещалась в светлую камеру, поведенческие показатели регистрировались в течение 3 мин.

Эффективность моделирования β-амилоидной амнезии определялась по нарушению распознавания новых объектов и выработке УРПИ на 4-й день, а также по снижению массы тела.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Statistica 8.0 («StatSoft»). Межгрупповые различия анализировались параметрическими (критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна—Уитни) методами, в зависимости от типа распределения. Гипотеза о нормальности распределения проверялась критерием Шапиро—Уилка.

Масса тела животных, подвергшихся оперативному вмешательству и получавших Аβ_25—35, была существенно снижена по сравнению с интактными крысами. Введение экспериментальных препаратов (в том числе препарата сравнения — мемантина) не вызвало дополнительных изменений базового значения или динамики этого показателя.

Поведение животных в тесте распознавания новых объектов под влиянием операции не изменилось, однако введение β-амилоидного пептида привело к статистически значимому сокращению времени взаимодействия животных со знакомым, «домашним», предметом как через 1 ч, так и через 24 ч после первоначального помещения в экспериментальную обстановку (табл. 2). Кроме того, на стадии обучения крысы, получившие icv инъекцию Аβ_25—35, меньше контактировали с предметами, чем крысы контрольных групп. Все это свидетельствует о том, что введение β-амилоидного пептида приводит к общему снижению исследовательской активности животных, а не только к изменению их способности к обучению. В то время как крысы из контрольных групп больше контактировали с новым незнакомым объектом, крысы с БА в равной степени обследовали знакомый и новый предметы, и помимо нарушения исследовательской активности у этих животных наблюдалась амнезия. В группе крыс, получавших в/б инъекции мемантина после введения β-амилоидного пептида, поведение в данном тесте не отличалось значимо от интактных или получивших icv инъекцию физиологического раствора животных на всем протяжении опыта. Однако существенные различия между длительностью обследования нового и «домашнего» объектов обнаружены только через 24 ч после обучения.

Несмотря на отсутствие существенных изменений в поведении при первоначальном помещении в установку у животных, получавших РА АТ S100, через 1 ч после обучения время взаимодействия крыс с новым объектом превышало длительность обследования «домашнего» предмета. Через сутки после исходного тестирования крысы этой группы в равной степени обследовали оба предмета, т. е. протективного эффекта препарата выявлено не было.

При введении РААТ к eNOS отмечались более выраженные изменения в поведении животных. Так, вызванное операцией снижение исследовательской активности в новой обстановке (неофобия) уменьшилось при исходном тестировании и не наблюдалось при проверке выработанной реакции через 1 ч и 24 ч после обучения. Кроме того, через 24 ч после обучения крысы этой группы проводили больше времени в контакте с новым объектом, наравне с интактными (см. табл. 2).

Использование комбинированного препарата РА АТ S100 + РА АТ eNOS привело к полному восстановлению базового уровня исследовательской активности животных (по длительности контакта с предметами при исходном тестировании). Отличий длительности взаимодействия с объектами по сравнению с интактным контролем не было выявлено ни через 1 ч, ни через 24 ч после первоначального тестирования.

В тесте условной реакции пассивного избегания животные контрольных групп демонстрировали успешное формирование обучения с наказанием — на 4-е сутки ЛП захода в темный отсек установки был существенно больше, чем при первом помещения в экспериментальную ситуацию (см. рисунок). Интрацеребровентрикулярное введение Аβ_25—35 привело к нарушению формирования стойкого ассоциирования темного отсека с электроболевым раздражением — ЛП захода в отсек значимо не изменился по сравнению с первоначальным значением. Таким образом, β-амилоид нарушил способность крыс к формированию памятного следа при отрицательном подкреплении.

В группе животных, получавших препарат сравнения мемантин, произошло восстановление нормального формирования условной реакции — ЛП захода в темный отсек при проверке навыка увеличился практически до уровня интактных крыс, т. е. препарат успешно скорректировал нарушения, вызванные введением β-амилоида.

Введение РА АТ S100 также привело к удлинению среднегруппового ЛП захода в темный отсек, значение параметра приблизилось к уровню контрольных крыс, как и в группе препарата сравнения.

Использование препарата релиз-активных антител к eNOS вызвало рост ЛП первого захода в темную камеру лишь на уровне тенденции (р=0,12; по критерию Манна—Уитни при сравнении длительности ЛП при первом и повторном помещении в экспериментальную установку с группой БА). Статистически значимое возрастание количества болюсов, наблюдаемое при повторном помещении в экспериментальную установку, может свидетельствовать о выраженной эмоциональной реакции у животных.

При введении РА АТ S100 + РА АТ eNOS также наблюдалась тенденция к увеличению сдвига ЛП первого захода в темный отсек при проверке сохранности выработанной условнорефлекторной реакции по сравнению с группой β-амилоидных крыс (р=0,13). Статистически значимого увеличения количества болюсов не выявлено, поэтому наблюдаемый протективный эффект препарата, по-видимому, не связан с эмоциональной компонентой поведения крыс в установке для выработки УРПИ.

Таким образом, проверка эффективности выработки УРПИ негативного подкрепления показала, что из трех использованных релиз-активных препаратов наибольшую активность проявили РА АТ S100.

В настоящей работе у крыс были смоделированы характерные для БА проявления, которые достаточно четко выявлялись при тестировании способности животного к запоминанию объектов в новой обстановке, а также к выработке обучения на основе отрицательного подкрепления. Использованные для лечения препараты по-разному влияли на эти особенности поведения животных.

В тесте распознавания новых объектов препарат сравнения мемантин оказал положительное воздействие на формирование следа долговременной памяти, при этом не повлияв на сниженный в результате экспериментального воздействия уровень исследовательской активности в новой обстановке, а также на кратковременную память животных. На фоне введения препарата РА АТ S100, напротив, наблюдалось восстановление кратковременной памяти. РА АТ eNOS, помимо влияния на узнавание нового объекта через 24 ч после обучения, нивелировали симптомы неофобии. Комбинированный препарат РА АТ S100 + РА АТ eNOS более эффективно, чем отдельные компоненты, компенсировал негативные последствия экспериментального вмешательства — поведенческие показатели статистически значимо не отличались от наблюдавшихся в группе интактных животных.

Тестирование выработки УРПИ показало, что РА АТ S100 оказали максимальное воздействие на поведение крыс в установке, а РА АТ eNOS повлияли в первую очередь на эмоциональную составляющую реакции животных на электроболевую стимуляцию. Несмотря на то что эффект РА АТ S100 + РА АТ eNOS не достиг уровня статистической значимости, животные, получавшие комплексный препарат, проявили бо́льшую активность по сравнению с группой введения РА АТ eNOS.

Суммируя результаты, полученные на модели β-амилоидной амнезии, можно отметить, что препарат тенотен (РА АТ S100) оказал максимальное влияние на нарушенные когнитивные функции животных, в то время как препарат импаза (РА АТ eNOS) больше повлиял на симптомы, связанные с оперативным вмешательством. Диваза (РА АТ S100 + РА АТ eNOS), содержащая компоненты обоих препаратов, оказала более эффективное действие, нивелируя неофобию и амнезию, в результате чего поведение животных было скорректировано практически до уровня контрольных животных.

Релиз-активные антитела к белку S100 и eNOS, совместно воздействуя на повреждение мозга вследствие развития нейродегенеративных процессов, способствовали снижению тяжести поведенческих проявлений развившейся патологии у экспериментальных животных. Для тенотена уже была показана способность влиять на синаптическую пластичность и электрические характеристики мембраны изолированных нейронов [20—22]; ГАМК-А- и ГАМК-Б-модулирующее действие, а также влияние на серотонинергическую систему [9, 23, 24]. Нейропротективные свойства препарата были доказаны [10] на модели нейродегенеративного заболевания, вызванного введением скополамина — показаны ноотропный и антиамнестический эффекты РА АТ S100, сравнимые по выраженности с действием пирацетама. Механизм действия второго однокомпонентного препарата, импазы, основан на регуляции работы каскада «NO-синтаза → NO-гуанилатциклаза → цГМФ». Для Р.А. АТ eNOS было многократно показано эндотелиопротективное действие на функциональном, биохимическом и морфологическом уровнях в различных экспериментальных моделях. Подобный эффект, с точки зрения развития нейродегенеративного заболевания, представляет высокую значимость. Комбинированный препарат диваза не только сочетает в себе свойства его компонентов, но и демонстрирует вероятность их взаимного усиления, что соответствует полученным ранее данным [14] о положительном воздействим дивазы на моделях ишемии головного мозга и при комплексной терапии астеноневротических, вестибуло-атактических и психовегетативных расстройств.

Полученные в данном исследовании положительные результаты подтверждают необходимость и перспективность дальнейшего исследования влияния монокомпонентных и комбинированных релиз-активных препаратов на моделях нейрокогнитивных нарушений, позволяя предполагать расширение области их клинического применения у человека.