Церебролизин — препарат с доказанным нейротрофическим действием, используемый в клинической практике для восстановления неврологических функций пациентов с деменцией, перенесших инсульт или черепно-мозговую травму (ЧМТ) [1]. Его применение достоверно уменьшает неврологический дефицит [2], улучшает когнитивные способности [3], снижает объем зоны инфаркта при инсульте [4]. Препарат оказывает нейрорегенеративное воздействие [5], уменьшая нарушения структуры нейронов [6], снижает уровни провоспалительного фактора некроза опухоли α (ФНО-α) и оказывает антиоксидантное действие [7].
Молекулярными основами нейротрофического и нейропротективного действия препарата являются аминокислоты и пептиды с низкой молекулярной массой (не более 6000—10 000 Да), которые преодолевают гематоэнцефалический барьер и поступают в нейроны [1]. Анализ «легкой» пептидной фракции церебролизина (пептиды до 1500 Да) показал, что в его состав входят биологически активные пептидные фрагменты фактора роста нервов (ФРН, пептиды GEFSV, NSYCTTT), энкефалины и динорфины (YGGFL, GGFLR, YGGFM), фрагменты орексина (пептид CCRQK) и галанина (пептид WWLNSAGY) [8].
Анализ молекулярно-фармакологического действия этих пептидов показал перспективность исследований синергических эффектов между нейроактивными пептидами церебролизина и нейроактивными микронутриентами (в частности, литий) [8, 9]. Установленное в эксперименте повышение активности сигнального каскада Shh под воздействием церебролизина связано с потенцированием пептидными фрагментами ФРН действия витамин-А-зависимых рецепторов ретиноидов, стимулируюших долговременный рост нейритов [8], продолжающийся даже в течение 3—6 мес после окончания курса терапии.
Известно, что течение инсульта и ЧМТ часто сопряжено с развитием судорог, что может быть обусловлено не только нарушениями электролитного обмена, но и морфологическими повреждениями двигательной коры и проводящих путей. Снятие отека мозга (в частности, с использованием диуретиков) повышает судорожную готовность и может провоцировать судороги [10]. Поэтому неадекватно подобранная фармакотерапия инсульта и ЧМТ может существенно усиливать судорожные реакции, осложняя процесс нейрорегенерации.
Одним из важных аспектов биологического действия входящих в состав церебролизина пептидных фрагментов является их потенциальное противосудорожное действие. Известно, что галанин [11], ФРН [12], динорфины [13] и др. регулируют судорожную активность посредством воздействия на соответствующие рецепторы.
Цель исследования — изучить влияние церебролизина на выраженность и тяжесть течения первично-генерализованных судорог, вызванных тиосемикарбазидом.
Материал и методы
Исследование было проведено на 144 белых крысах-самцах массой 200 г. Животные были разделены на девять групп по 16 особей в каждой: группа № 1 — интактный контроль для исключения действия на животных третьих факторов, которые не могут учитываться исследователем; группа № 2 — контроль с воспроизведением первично-генерализованных судорог; группы № 3, 4, 5, 6 и 8 получали церебролизин в дозе 2,5 мл/кг массы внутрибрюшинно 5 дней в неделю в течение 18 дней с перерывами на субботу и воскресенье, группы № 6 и 7 — габапентин в дозе 300 мг/кг внутрижелудочно за 90 минут до воспроизведения судорог, группы № 8 и 9 — вальпроат натрия в дозе 50 мг/кг внутрижелудочно в течение 4 дней до воспроизведения судорог.
Для определения противосудорожных свойств церебролизина, габапентина и вальпроата натрия была использована экспериментальная модель первично-генерализованных судорог, вызванных тиосемикарбазидом [14]. В группах № 2, 3, 6, 7, 8 и 9 тиосемикарбазид вводили в дозе 28 мг/кг внутрибрюшинно, в группе № 4 — 10 мг/кг, в группе № 5 — 20 мг/кг.
Во всех группах регистрировали латентное время до первого судорожного приступа, количество, характер судорог (вздрагивание, манежный бег, клонические судороги, тонико-клонические судороги с боковым положением, тоническая экстензия, заканчивающаяся гибелью тоническая экстензия) и летальность в течение 90 мин после введения тиосемикарбазида.
После одномоментной декапитации проводили патогистологическое исследование секционного материала головного мозга. После краниотомии головной мозг извлекали целиком и фиксировали его в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сут с помощью фронтальных разрезов выделяли зону прецентральной извилины переднего мозга. Проводку нервной ткани осуществляли по стандартной схеме (обезвоживание в этиловом спирте, ксилоле) с последующим изготовлением парафиновых блоков. Изготовленные на санном микротоме Microm гистологические срезы толщиной 5—6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Дубликаты срезов с помощью набора реактивов компании «Биовитрум» были окрашены по методу Ниссля и импрегнированы серебром. Микрофотографии получали с помощью исследовательского микроскопа Micros и цифровой окулярной камеры DCM 900. Морфометрическое исследование гистологических срезов проводили на анализаторе изображения BioVision (Австрия): подсчет поврежденных нейроцитов пирамидного слоя коры полушарий переднего мозга в десяти различных полях зрения с последующей статистической обработкой результатов.
Результаты и обсуждение
Исследование различных доз противоэпилептического препарата показало, что введение тиосемикарбазида в дозе 10 мг/кг (группа № 4) вызвало менее выраженные судороги по длительности (р=0,002), количеству приступов (р=0,04) и тяжести по признакам «клонические судороги» и «тоническая экстензия» (р=0,004) по сравнению с группой № 3, где доза препарата была 28 мг/кг. В группе № 5 на фоне введения тиосемикарбазида в дозе 20 мг/кг отмечалась меньшая тяжесть приступов по признакам «клонические судороги» и «тоническая экстензия» (р=0,014) по сравнению с группой № 3. При этом летальность животных в группах № 4 и 5 составила 33%, в группе № 3 – 83%. Таким образом, с резким увеличением дозы усиливался и его судорожный эффект, и в группах уменьшилась выживаемость. Животные этих групп получали также церебролизин, который не оказывал конвульсивного эффекта.
Курсовое введение церебролизина на модели тиосемикарбазидовых судорог достоверно снизило тяжесть судорожных приступов (по признаку «вздрагивание») (р=0,003) и уменьшило их длительность (р=0,005). Судороги в группах № 3, 4, 5, 6 и 8 были менее выражены (рис. 1), длительность каждого приступа составляла несколько секунд. Летальность в группе № 3 составила 83%, тогда как в контрольной (группа № 2) — 100%.
У животных из группы № 7 (габапентин) достоверно удлинялось латентное время до развития первого судорожного приступа после воспроизведения модели (р=0,04), уменьшалось количество судорожных приступов по сравнению с контролем (р=0,02) и группой № 9 (вальпроат натрия) (рис. 2). В группе № 7 все животные выжили.
Сочетание церебролизина и габапентина (группа № 6) достоверно увеличило время латентного периода до возникновения судорог (р=0,02) и уменьшило количество приступов (р=0,004), ослабило тяжесть судорожных приступов (по признаку «тонико-клонические судороги» (р=0,001), значимо снизило длительность судорог (р=0,003) по сравнению с контролем (группа № 2) и группой № 7 (габапентин) (рис. 3).
При сравнении результатов групп № 3 (церебролизин) и № 6 (габапентин + церебролизин) в последней регистрировалось меньшее количество судорожных приступов (р=0,001) (см. рис. 3), снижение их тяжести (признаки «тонико-клонические судороги» и «тоническая экстензия», р<0,05) и длительности приступов (р=0,002).
В группе № 9 (вальпроат натрия) не было отмечено отличий в тяжести судорог по сравнению с контролем. Летальность животных в группе № 9 составила 83%. В группе № 8 (церебролизин + вальпроат натрия) тяжесть судорог достоверно снизилась по показателю «вздрагивание» по сравнению с контролем (р=0,001) и группой № 9 (р=0,009). Сочетание препаратов значительно увеличило выживаемость животных: летальность в группе № 8 составила всего 17%.
При сравнении результатов групп № 6 и 8 выявлены значимые различия. Сочетание церебролизина с габапентином увеличило латентное время (р=0,01), снизило количество (р=0,004) и тяжесть судорожных приступов по признаку «тонико-клонические судороги» (р=0,001) и «тоническая экстензия» (р=0,03), уменьшило их длительность (р=0,03), по сравнению с группой, где вводили церебролизин и вальпроат натрия (рис. 4).
Нейрогистологическое исследование тканей мозга на модели судорог
Гистологическое исследование секционного материала головного мозга показало, что использованная модель первично-генерализованных судорог (группа № 2) имела морфологическое подтверждение во всех случаях наблюдения. Использование церебролизина в группе № 3 минимизировало уровень ишемического повреждения нейроцитов.
В группе № 2 (контроль) во всех гистологических препаратах были выявлены признаки выраженных нарушений кровообращения на уровне микроциркуляторного русла (МЦР), равномерно проявляющиеся в сером и белом веществе полушарий переднего мозга. В капиллярах явления гемостаза характеризовались агрегацией эритроцитов с выраженным периваскулярным отеком нервной ткани (рис. 5, а,), причем полнокровие венул сопровождалось дилатацией их просвета. В коре полушарий у 2 крыс были выявлены мелкоочаговые периваскулярные кровоизлияния (рис. 5, б,). В артериях интрацеребральных и мягкой мозговой оболочек отмечены признаки стойкого спазма с перпендикулярной ориентацией эндотелиальных клеток и формированием интимальных подушечек (рис. 5, в,).
В модели судорог отмечены ишемические повреждения нейроцитов коры и подкорковых ядер, которые выражались в исчезновении грануляций Ниссля, гомогенизации цитоплазмы с исчезновением контуров ядра и набуханием аксонов (рис. 5, г,). Наблюдалась гибель единичных нейроцитов пирамидного слоя коры, сопровождавшаяся размытием границ и увеличением объема цитоплазмы (рис. 5, д,). Импрегнация серебром зон головного мозга, содержащих проводящие пути, показала неравномерную окраску и нечеткость контуров нервных волокон, а также очаговую пролиферацию микроглиальных элементов (рис. 5, е,). Эти особенности гистологии указывают на выраженные повреждения морфологии и ишемизацию коры головного мозга.
В группе № 3 (церебролизин) расстройства кровообращения МЦР в исследованных гистологических образцах характеризовались гемостазом в капиллярах и умеренно выраженным перикапиллярным отеком нервной ткани коры и белого вещества переднего мозга. Спастическое состояние интрацеребральных и пиальных артерий зарегистрировано лишь в 2 случаях из 16.
Важно отметить, что в группе № 3 (церебролизин) значительная часть нейроцитов коры и подкорковых ядер не имела структурных повреждений на микроскопическом уровне (рис. 6, а,). Ишемические повреждения нейронов характеризовались очаговым хроматолизом единичных пирамидных клеток и набуханием нейрональных аксонов, что является классическим нейроморфологическим критерием обратимых изменений. Макроглиальная реакция нервной ткани была минимальной и выражалась слабым отеком периартериолярных астроцитов. Импрегнация серебром проводящих двигательных путей головного мозга в большинстве наблюдений демонстрировала сохранность миелиновых оболочек нервных волокон, которые имели четкие контуры (рис. 6, б,).
Количественный анализ показал, что использование церебролизина минимизировало уровень ишемического повреждения нейроцитов до обратимого состояния. Морфометрический анализ указывает, что в группе № 3 (церебролизин) количество поврежденных нервных клеток коры составило 20,5%, тогда как в группе № 2 (контроль) — 49,8% при достоверных морфологических признаках гибели нейроцитов.
В целом использованная модель первично-генерализованных судорог имела морфологическое подтверждение во всех наблюдениях. При использовании превентивной терапии церебролизином повреждения нервных волокон головного мозга оказались минимальными. Таким образом, применение церебролизина (группы № 3, 4, 5, 6 и 8) оказало отчетливый нейропротективный эффект на клетки коры головного мозга в условиях «стресса» (ишемия), характерного для использованной модели судорог, что подтверждено сохранностью органелл цитоплазмы нейроцитов.
Молекулярные основы противосудорожной активности церебролизина
Возникновение судорог при введении тиосемикарбазида связано с уменьшением содержания в мозге ГАМК вследствие торможения активности фермента декарбоксилазы глутаминовой кислоты. Механизмы противосудорожного действия габапентина и вальпроата натрия известны. Так, вальпроат натрия как противоэпилептическое средство активирует фермент, катализирующий образование ГАМК, и ингибирует фермент инактивации ГАМК. В итоге вальпроат-анион способствует значительному накоплению ГАМК в головном мозге. Габапентин — антиконвульсант, который используется для лечения эпилепсии и нейропатической боли, способствуя биосинтезу ГАМК. В терапевтических концентрациях он непосредственно открывает ионные каналы для ионов калия, не связывается с ГАМК, бензодиазепиновыми, NMDA и глициновыми рецепторами.
Установленные в настоящем исследовании противосудорожные эффекты церебролизина обусловлены, видимо, пептидным и аминокислотным составом препарата. В составе церебролизина были найдены пептидные фрагменты галанина, энкефалинов, динорфинов, тиролиберина и ФРН [1, 8], потенциально обладающие высокой биологической активностью. Кроме того, известно, что церебролизин и пептидные фрагменты ФРН способствуют повышению уровней нейротрофического фактора мозга (BDNF). Как показывают приводимые ниже результаты фундаментальных и клинических исследований, все эти компоненты церебролизина могут проявлять существенную противосудорожную активность.
Низкий уровень BDNF является прогностическим критерием развития когнитивных нарушений у больных с острой ЧМТ [15]. Клинические исследования показали [16], что церебролизин и пептидные фрагменты ФРН способствуют повышению уровней зрелого BDNF в крови, что ассоциировано с достоверным улучшением неврологического состояния пациентов с ЧМТ.
Низкие уровни BDNF ассоциированы с интенсивностью проявления судорог, что указывает на его противосудорожные эффекты. Например, у животных с генетической моделью эпилепсии WAR (стимулируется звуком высокой интенсивности) отмечено увеличение в коре провоспалительных цитокинов — интерлейкина ИЛ-1b и -6, ФНО-а и BDNF. Увеличение уровней BDNF является, вероятно, защитной реакцией организма на эпилептогенную активность мозга [17]. Это подтверждается тем, что даже однократное применение процедуры электросудорожной терапии способствовало быстрому повышению синтеза зрелой формы BDNF в гиппокампе [18].
Модель судорог на основе циклотиазида (который одновременно активирует возбуждающие NMDA-рецепторы и ингибирует тормозящие ГАМК-рецепторы, вызывая эпилептиформную активность) нарушает регуляцию синтеза BDNF в нейронах. Иммуногистохимический анализ показал, что уровни и самого фактора BDNF, и его рецептора TrkB в гиппокампе существенно снижаются при создании модели циклотиазидных судорог. Даже спустя 6 мес после введения циклотиазида иммуногистохимическое окрашивание клеток на BDNF показало значительное снижение интенсивности в областях СА1, СА3 и DG (зубчатая извилина) гиппокампа по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо (р<0,001) [19].
На защитный эффект BDNF также указывает снижение его уровня в сыворотке крови пациентов с эпилепсией и психогенными неэпилептическими судорогами (1033±435 пг/мл по сравнению с контролем — 4289±1810 пг/мл, р<0,001) [20, 21].
Рецепторы галанина модулируют протекание судорожного процесса [11]. Рецепторы галанина GALR1 играют важную роль в регуляции судорожной активности. В трансгенной модели (делеция гена Galr1 у мышей) установлено снижение уровней инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-I), повышена частота спонтанных тонико-клонических судорог, что указывает на антисудорожную активность галанина [22].
Введение в гиппокамп генномодифицированных галанинпродуцирующих клеток в рамках тестирования клеточной терапии (12,6 нг/мл/24 ч) снижал эпилептиформную активность гиппокампа [23]. В эксперименте генная терапия галанином предотвращает судорожную активность и уменьшает среднюю тяжесть приступов за счет снижения судорожной восприимчивости [24].
По данным оценки поведения и электрографии, введение галанина в грушевидную (пириформная) кору мозга предотвращает судорожную активность, вызываемую периферическим введением каиновой кислоты [25].
В пикротоксиновой модели судорог введение галанина в ЦНС также оказывало противосудорожные эффекты. При введении в хвостатые ядра или черную субстанцию галанин оказывал противосудорожное действие в более высокой дозе (200 нг), а в прилежащее ядро — в более низкой (50 нг) [26].
В экспериментальных моделях судорог (одностороннее повреждение зубчатой извилины, внутрижелудочковое введение каиновой кислоты) отмечены существенные нарушения регуляции уровней энкефалинов (повышение) и динорфинов (снижение) [13]. В эксперименте пептидный аналог тиролиберина защищал от судорог, вызванных пикротоксином или каиновой кислотой, причем без существенного изменения артериального давления [27].
У пациентов с медиальной височной эпилепсией были отмечены изменения экспрессии рецепторов нейротрофических факторов: например снижение уровней рецептора ФРН P75 (NTR) у пациентов с межприступным психозом и увеличение — рецептора TrkB у пациентов с психозом или депрессией [28]. Церебролизин увеличивает уровни зрелого ФРН при болезни Альцгеймера [29]. В эксперименте пептид-миметик ФРН тормозит развитие судорог [12].
Воспаление играет важную роль в патогенезе судорог. В эксперименте активация микроглии и повышение уровней провоспалительных цитокинов ИЛ-1-β, ФНО-α и S100B были ассоциированы с повышенной восприимчивостью к судорожной активности [30].
Повышение экспрессии BDNF в гиппокампе снижает частоту спонтанных приступов в пилокарпиновой модели эпилепсии [31] и понижает активность процессов воспаления в ЦНС (в частности, за счет резкого снижения синтеза провоспалительного ИЛ-1β) [32].
Церебролизин проявляет выраженные противовоспалительные свойства, что может существенно способствовать снижению судорожной активности. Например, исследование действия церебролизина (0,1 мл на 1 кг массы тела, 10 инъекций через день) на ряд показателей аутоиммунитета (уровни FasL, Fas, металлотионеина-1) в группе из 20 новорожденных в возрасте 1 мес с ишемическими поражениями ЦНС и 20 здоровых детей показало, что его применение оказывало нормализующее действие на состояние Т-лимфоцитов (увеличение Fas, уменьшение FasL, p<0,001) и активировало антиоксидантную защиту через увеличение уровня мРНК металлотионеина-1 [33]. Установлено, что нормализация аутоиммунитета способствует снятию отека и улучшению кровообращения в пораженных ишемией участках мозга.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать следующие выводы.
Церебролизин уменьшает тяжесть и длительность судорог, вызванных тиосемикарбазидом, увеличивает выживаемость животных. Он также модулирует эффекты лекарственных средств, обладающих противосудорожным действием: усиливает действие габапентина и в меньшей степени вальпроата натрия (что, вероятно, связано с разными точками приложения действия лекарственных средств). По данным нейрогистологического исследования, церебролизин оказывает нейропротективный эффект на клетки коры головного мозга в условиях ишемии, ассоциированной с тиосемикарбазидной моделью судорог, обеспечивая сохранность нейроцитов. Показано, что нейропептиды, активные фрагменты которых входят в состав церебролизина, проявляют и нейротрофические, и противосудорожные эффекты.