Процесс образования свободных радикалов относится к универсальным механизмам жизнедеятельности любой живой клетки. Их основным источником является процесс трансформации кислорода в митохондриях. Поступающий в клетку кислород подвергается полному восстановлению до воды. Однако в процессе аэробного метаболизма при неполном восстановлении кислорода в качестве промежуточных продуктов образуются свободные радикалы (СР). Они представляют собой различные по атомному составу химические вещества, общей особенностью которых является наличие неспаренного электрона на одной из их орбит. В результате этого СР являются нестабильными веществами, обладающими высокой химической активностью. Свободные радикалы при контролируемом образовании играют важную физиологическую роль: регуляция сосудистого тонуса, проведение возбуждения, участие в реакциях воспаления, механизмах репарации, элиминации отживших клеток [6, 12, 43]. В то же время избыточное образование СР ассоциируется с патологическими процессами. Интенсификация свободнорадикальных процессов в организме может быть вызвана как усилением образования активных форм кислорода (АФК), свободных радикалов и низкомолекулярных эндогенных проокcидантов, так и снижением эффективности действия биологических систем утилизации и детоксикации АФК и С.Р. Образование С.Р. могут провоцировать различные процессы, сопровождающие жизнедеятельность организма: стрессы, ионизирующее излучение, токсины и т. д. СР участвуют в патогенезе большого количества заболеваний — ишемии, сахарного диабета, черепно-мозговой травмы, онкологии, атеросклероза, катаракты, преждевременного старения, болезни Паркинсона (БА), болезни Альцгеймера, хореи Гентингтона [14, 26, 44].
СР разделяют на первичные, вторичные и третичные. Первичные присутствуют обычно в норме в относительно небольших количествах, менее реактивны и оказывают регуляторное или умеренное антимикробное действие. К ним относят оксид азота — обладающий сосудорасширяющим действием супероксидный радикал, который может превращаться в перекись водорода (Н
Клетки головного мозга по сравнению с другими тканями особенно подвержены процессам оксидантного стресса, так как головной мозг отличается высокой интенсивностью окислительного метаболизма и содержит большое количество субстратов перекисного окисления — липидов, а также металлов переменной валентности, являющихся катализатором реакций свободнорадикального окисления. В то же время активность антиоксидантных систем значительно ниже, чем в других тканях [4]. Накапливаясь, СР вызывают прямое окислительное повреждение нуклеиновых кислот и белков. СР индуцируют реакции белков с другими компонентами клетки, вызывая их фрагментацию и нарушение функций. Особенно сильным повреждающим действием обладают процессы перекисного окисления липидов биомембран. Нарушение липидной основы ведет к изменению мембранного потенциала, уменьшению текучести и повышению проницаемости мембран для различных ионов, в том числе Са2+ и Na+. СР могут оказывать влияние и на генетический аппарат клетки, вызывая деструктурирование ДНК. Модифицированные липиды способны влиять на экспрессию генов, индуцирующих апоптоз [30].
В норме действию СР противостоит антиоксидантная система, представленная ферментным и неферментным звеном. Ферментные системы (супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза, церулоплазмин, глутатионпероксидаза) препятствуют образованию СР, и их относят к первичным антиоксидантам. Неферментное звено представлено соединениями, имеющими в своей структуре ароматическое кольцо (витамины А, С, Д, Е, К, убихиноны, триптофан, флавоноиды, каротины и каротиноиды) или тиоловые группы (глутатион, α-липоевая кислота, цистеин, метионин), которые выполняют роль «ловушки» для уже образовавшихся С.Р. Их относят к вторичным антиоксидантам. В условиях повышенного образования СР антиоксидантная система защиты не справляется, СР накапливаются, индуцируя лавинообразный процесс окислительного стресса.
Источником СР при БП, помимо митохондрий, являются реакции трансформации дофамина — ауто- и ферментное окисление. При аутоокислении дофамина образуются токсичные семиквиноны, которые могут полимеризоваться в нейромеланин. При окислении дофамина с помощью МАО-В образуется перекись водорода [25]. В норме антиоксидантная система глутатионпероксидазы и глутатиона легко нейтрализует С.Р. Однако, как показывают исследования [21], при БП в глиальных клетках черной субстанции активность антиоксидантных систем значительно снижена. Посмертные исследования мозга больных с БП выявили повышенные уровни содержания малонового диальдегида (продукт ПОЛ), метаболита реактивных продуктов окисления (карбонил, пентозидин, пирралин), а также высокое содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина, являющегося маркером повреждения ДНК [18]. Катализатором окислительно-восстановительных реакций являются ионы железа. Содержание Fe3+ в подкорковых ганглиях очень высоко. Fe3+ в процессе метаболизма превращается в высокореактивный Fe2+, который катализирует трансформацию перекиси водорода в токсичные гидроксильные радикалы. Ионы железа могут снижать уровень внутриклеточного естественного антиоксиданта глутатиона [17, 38].
Дополнительным фактором, повышающим чувствительность нигральных нейронов к оксидантному стрессу, является снижение активности митохондриального комплекса I—NАDH-убихинон оксиредуктазы [19]. При посмертном гистологическом исследовании обнаружено снижение активности этого комплекса на 20—40% по сравнению с возрастной нормой [39]. Дефект комплекса I вызывает ослабление дыхания митохондрий, снижение продукции АТФ, что приводит к уменьшению энергетического потенциала и усилению накопления кислородных форм С.Р. Митохондриальный комплекс I служит мишенью для эндо- и экзотоксинов: 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), изоквинолина, тетрагидроизоквинолина, токсичных производных оксида азота. Нарушение митохондриальной ДНК черной субстанции происходит и при нормальном старении, что может быть одной из причин возрастного снижения резистентности дофаминергических нейронов к пропаркинсоническим факторам. О важной роли митохондриального комплекса I и токсинов свидетельствует возможность воспроизведения синдрома паркинсонизма у животных на модели с введением МФТП. МФТП под действием МАО-В метаболизируется в МФП (1-метил-4-фенил-пиридин), который кумулируется в митохондриях и обусловливает блокаду митохондриального комплекса I. Структурный аналог МФТП — N-метил-норсалсолинол обнаружен в тканях мозга и цереброспинальной жидкости больных с Б.П. Это соединение не проходит через гематоэнцефалический барьер, что позволяет считать его эндогенным протоксином. Установлено его блокирующее действие на активность тирозингидроксилазы, регулирующей продукцию дофамина, позволяя предполагать, что данное соединение участвует в механизмах повреждения дофаминергических нейронов [7, 19].
Современные представления о механизмах оксидантного стресса позволяют выделить несколько «мишеней» для терапевтического воздействия при БП: СР (использование ферментных и неферментных антиоксидантов); металлы переменной валентности (хелаторы металлов); энерготранспортная цепь митохондрий (модуляторы активности митохондрий — коэнзим Q10, креатин); ферменты, участвующие в окислении дофамина (ингибиторы МАО и NO-синтазы); каспазы (ингибиторы каспаз); кальпаин (модуляторы активности).
Наибольшее количество экспериментальных и клинических работ связано с использованием неферментных антиоксидантов.
Витамин Е одним из первых стал применяться в качестве нейропротектора при Б.П. Имея в структуре бензольное кольцо, он способствует сохранению активности мембрансвязанных ферментов, инактивирует гидроксильный радикал и синглетный кислород. В начале 90-х годов были опубликованы результаты исследования DATATOP, в котором оценивалась возможность модифицирующего эффекта витамина Е и ингибитора МАО-В селегилина. В исследование включались пациенты с начальными стадиями БП, а в качестве конечной точки рассматривалось время необходимого назначения леводопы. Результаты исследования были отрицательными — витамин Е не оказывал влияния на течение заболевания [41].
S. Zhang и соавт. [46] оценивали заболеваемость БП в двух больших когортах мужчин и женщин, вошедших в два больших эпидемиологических исследования: The Nurses’ Health Study (76,890 женщин на протяжении 14 лет) и Health Professionals Follow-up Study (331 мужчина на протяжении 12 лет). Было выявлено, что прием витамина Е или С в виде пищевых добавок или мультивитаминов не ассоциируется со снижением риска Б.П. Однако риск БП снижался при употреблении высоких доз витамина Е с пищей. E. Miller и соавт. [27] провели метаанализ 19 клинических исследований, показывающих, что высокие дозы витамина Е (превышающие 400 ME/сут) в течение 1 года могут повышать риск смерти.
Другим направлением антиоксидантной терапии является использование регуляторов митохондриальной активности коэнзима Q10 — убихинона, являющегося акцептором электронов дыхательной цепи митохондрий I и II комплекса. В пилотном двойном плацебо-контролируемом исследовании, получившем название QE2, назначение коэнзима Q10 в дозе 1200 мг/сут в течение 16 мес небольшой группе пациентов с БП выявило уменьшение степени двигательных расстройств [42]. Эти результаты должно было подтвердить последующее более крупное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование QE3, проводившееся в 67 центрах Северной Америки. 600 пациентам с начальными стадиями БП коэнзим Q10 назначался в дозе 1200/2400 мг/сут. Однако в мае 2011 г. National Institute of Neurological Disorders and Stroke and Parkinson Study Group [17] на основании промежуточного анализа остановили это исследование. Статистически значимых различий между группами активной и плацебо выявлено не было. Высокие дозы коэнзима Q10 были признаны небезопасными.
Другим препаратом митохондриальной направленности является креатин. Его нейропротективный эффект был неоднократно показан в экспериментах на моделях паркинсонизма. В настоящее время продолжается крупное мультицентровое двойное слепое плацебо-контролируемое исследование в параллельных группах — NET-PD LS-1 (Neuroprotection Exploratory Trials in Parkinson’s Disease) — 1720 пациентов с начальными стадиями БП, рандомизированые в группу креатина или плацебо. Результаты будут оценены в 2015 г. [17].
Глутатион является важнейшим антиоксидантным ферментом в головном мозге, который инактивирует образующуюся перекись водорода до воды и кислорода. При снижении уровня глутатиона и глутатионпероксидазы происходит трансформация перекиси в высокотоксичные гидроксильные радикалы, обладающие значительным повреждающим потенциалом. Как показали морфологические исследования, при БП в глиальных клетках черной субстанции активность системы глутатиона значительно падает. Его защитный эффект был отмечен в эксперименте на моделях паркинсонизма. G. Sechi и соавт. [40] изучали эффективность внутривенного введения глутатиона в дозе 600 мг 2 раза в день в течение 30 дней на 9 ранее не леченных пациентах с начальной стадией Б.П. Все пациенты сообщили об улучшении состояния (на 42% по сравнению с началом). После окончания терапии эффект сохранялся в течение 2—4 мес. Двойное слепое плацебо-контролируемое пилотное исследование проводится в настоящее время Parkinson’s Disiase and Movement Disorders Center Университета Южной Флориды [19].
МАО В участвует в процессе окисления дофамина. В качестве его побочного продукта образуется перекись водорода. Учитывая этот механизм, ингибиторы МАО-В могут обладать не только симптоматическим эффектом, увеличивая содержание дофамина в головном мозге, но и антиоксидантным потенциалом. В исследовании DATATOP, упоминавшемся выше, в группе больных, получавших селегилин, было отмечено улучшение двигательной активности по шкале UPDRS в среднем на 1,9 балла через 4 нед терапии. Однако нейропротективный эффект был признан неубедительным, так как значимых различий между группами сравнения (токоферол и плацебо) получено не было [41]. Вместе с тем анализ пациентов, которые по окончании исследования получали леводопу вместе с селегилином на протяжении 7 лет, показал снижение темпов прогрессирования заболевания, уменьшение длительности периодов «выключения», реже встречались феномен «включения—выключения», застывания при ходьбе, по сравнению с пациентами, которым селегилин был заменен на плацебо через 5 лет терапии. Однако дискинезии в группе селегилина регистрировались чаще [20]. Подобные результаты были получены в Скандинавском исследовании, в котором было показано благоприятное влияние селегилина в плане назначения леводопы и долгосрочного прогноза [32]. В другом исследовании SINDEPAR (синемет/депренил/парлодел) 782 пациента, получавшие или бромкриптин, или леводопу, были рандомизированы в группы селегилина или плацебо. Длительность наблюдения составила 14 мес. Для того чтобы разграничить симптоматический и модифицирующий эффект селегилина, его прием был остановлен за 2 мес до окончания исследования, а прием бромкриптина и леводопы — за 1 нед. Результаты показали, что у пациентов, получавших селегилин, балл по шкале UPDRS был ниже, чем в группе плацебо, независимо от того, входили они в группу леводопы или бромкриптина [23]. Несмотря на эти результаты, остается сомнение, достаточно ли 2 мес, чтобы исключить симптоматический эффект селегилина.
Разагилин — другой селективный ингибитор МАО-В, который в эксперименте с МФТП-индуцированным паркинсонизмом оказался в 5 раз эффективнее селегилина. Кроме того, метаболиты разагилина не обладают амфетаминоподобными эффектами. Наряду с влиянием на МАО-В в эксперименте были показаны другие его эффекты: препятствие открытию мембранных пор митохондрий и снижение выхода цитохрома С в цитоплазму, снижение активности проапоптозных генов и протеинов, ингибирование активности глицероальдегид-3-фосфатдегидрогеназы [21]. В рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании TEMPO [34] оценивался эффект раннего и позднего назначения разагилина в монотерапии у больных с начальными стадиями Б.П. На первом этапе (6 мес) пациенты были рандомизированы в группы разагилина (1 или 2 мг/сут) или плацебо. Во второй фазе исследования (6 мес) пациенты, получавшие плацебо, вошли в активную группу и получали разагилин. Анализ результатов исследования показал, что через 12 мес в группе пациентов, изначально получавших разагилин, балл по шкале UPDRS был ниже по сравнению с группой отсроченного старта. Результаты оказались статистически значимыми, однако разница в изменении среднего балла была неубедительной [35]. Исследование ADAGIO [37] было призвано подтвердить положительное влияние разагилина в плане замедления прогрессирования Б.П. По сравнению с TEMPO оно было более маштабным (1176 ранее не леченных пациентов с БП) и продолжительным (18 мес). Это исследование также проводилось с использованием дизайна отсроченного старта. На первом этапе пациенты были рандомизированы в четыре группы: группы разагилина в дозе 1 или 2 мг/сут и плацебо (1 и 2 мг/сут) [31]. На втором этапе через 36 нед группа плацебо начинала прием разагилина в дозе 1 или 2 мг/сут. Через 18 мес в группе пациентов, принимавших разагилин в дозе 1 мг/сут с начала исследования, оценка по шкале UPDRS оказалась ниже исходной на 2,8 балла, в группе с отсроченным стартом — на 4,5 балла. Среди пациентов, получавших разагилин в дозе 2 мг/сут с самого начала, скорость прогрессирования была также ниже, однако статистически значимой разницы по общему баллу UPDRS по сравнению с группой с поздним началом получено не было. Возможно, объяснение этого парадоксального результата заключается в том, что более высокие дозы разагилина оказывают преимущественно симптоматический эффект, маскируя модифицирующий эффект препарата. Другим объяснением может быть то, что нейропротекция может следовать U-образной кривой, и доза 2 мг попадает в своеобразный «провал» кривой. Очевидно, необходимы дальнейшие исследования разагилина. Требуется более длительный период наблюдения, а также включение пациентов с развернутой стадией болезни, что может помочь отдифференцировать симптоматический эффект от нейропротективного при более высоких дозах разагилина. В октябре 2011 г. FDA (the US Food and Drug Administration Advisory Committee) по результатам исследования TEMPO и ADAGIO признал доказательства модифицирующего эффекта разагилина недостаточными [20].
Неэрголиновые агонисты дофаминовых рецепторов (АДР) из-за наличия в структуре гидроксилированного бензольного кольца, выполняющего роль «ловушки» СР, также обладают нейропротективным потенциалом. Многочисленные экспериментальные исследования показали, что АДР предотвращают действие митохондриальных токсинов, повышают экспрессию глутатиона, каталазы и СОД [24, 29, 36]. В недавно проведенных исследованиях СALM-PD и REAL-PET было выявлено, что прием прамипексола/ропинерола при сроках наблюдения от 2 лет до 4,5 года сопровождается достоверно меньшим угнетением связывания радиофармпрепаратов при ПЭТ (флюородопа) и ОФЭКТ (препараты тропана) в стриатуме по сравнению с леводопой. Полученные результаты были интерпретированы как снижение темпа нарастания дегенеративных изменений в дофаминергических нейронах на фоне приема АДР, однако данные функциональной нейровизуализации не коррелировали с клиникой [33, 45].
Клинические исследования АДР с использованием дизайна отсроченного старта выполнены на примере прамипексола (PROUD-study-Pramipexole On Underlying Disease). Продолжительность первой фазы составила 6—9 мес. Пациенты были рандомизированы в группу прамипексола (1,5 мг/сут) или плацебо. Во второй фазе все пациенты получали прамипексол. В качестве конечных точек рассматривались динамика по шкале UPDRS и изменения на DaTSCAN. Результаты исследования не выявили достоверных различий между группой с ранним и отсроченным началом приема прамипексола [17]. На сегодняшний день вопрос о модулирующем эффекте АДР остается дискуссионным.
Экспериментальные исследования с МФТП-индуцированным паркинсонизмом у мышей показали наличие антиоксидантного эффекта у отечественного препарата мексидол. Его предварительное введение уменьшало интенсивность процессов липопероксидации, индуцированных применением МФТП, снижая концентрацию продуктов ПОЛ в мозге мышей, а также выраженность морфологических изменений, связанных с уменьшением количества дофаминергических нейронов, снижением уровня нейромеланина, а также глиальной реакции [10]. Мексидол ингибирует процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1—3, 8, 11] и активно реагирует с гидроксильными радикалами пептидов [5], снижает повышенный при патологии уровень NO в мозге [16]. Препарат мексидол усиливает антиоксидантную защиту организма, повышая активность СОД, глутатионпероксидазы и некоторых других антиоксидантных ферментов [5, 15]. В частности, мексидол связывает супероксидный анион-радикал и повышает активность СОД, но не влияет на активность 1-изофермента глутатион-SH-трансферазы и каталазы, однако значительно повышает активность Se-зависимой глутатионпероксидазы [15].
Мексидол достоверно подавляет как аскорбатзависимое — неферментативное, так и НАДФН2-зависимое — ферментативное железоиндуцируемое ПОЛ в гомогенатах мозга [15]. Причем в отличие от кудесана (1,86 мМ витамина Е, 5,72 мМ коэнзима Q
Гимантан — новый противопаркинсонический препарат — производное 2-аминоадамантана, оказывает нейропротективный эффект на моделях паркинсонического синдрома. В механизме действия гимантана выявлены свойства блокатора ионных каналов глутаматных рецепторов NMDA-подтипа, ингибитора МАО В, антирадикальная активность. На модели паркинсонического синдрома, вызванного нейротоксином МФТП у мышей С57BL/6, показано, что предварительное (до МФТП) введение гимантана способствует предотвращению усиления процессов ПОЛ в коре и стриатуме [28].
Таким образом, несмотря на обнадеживающие результаты экспериментальных исследований, на сегодняшний день в арсенале терапии БП нет ни одного препарата, чей нейропротективный модицифирующий эффект был бы однозначно доказан в клинике. Причины неудач кроются в нескольких проблемах: недостаточные знания в области патогенетических механизмов БП; отсутствие моделей БП на животных, модулирующих нейродегенеративный процесс; недостаточное количество длительных двойных слепых плацебо-контролируемых исследований; недостаточная чувствительность применяемых шкал, не позволяющих уловить медленное прогрессирование заболевания; отсутствие надежных и доступных биомаркеров, которые отражали бы динамику заболевания.