Болезнь Альцгеймера (БА) — тяжелое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся относительно медленным развитием, что является причиной сложностей его ранней диагностики. В настоящее время важное направление диагностики БА — поиск биомаркеров в таких легкодоступных биологических жидкостях, как сыворотка и плазма крови. Известно, что у пациентов с БА нарушается проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), и такие крупные периферические молекулы, как антитела, способны проникать в мозг [1—3]. При Б.А. происходит также разрушение многих белковых компонентов нейронов, которые в условиях нарушенного ГЭБ попадают в кровяное русло [4, 5]. Элиминирование разрушенных белковых компонентов в крови происходит при участии антител к ним. В связи с этим выявление антител к мембранным белкам нейронов мозга в сыворотке крови больных представляет интерес с точки зрения как постановки более точного диагноза заболевания, так и оптимизации лечения [3].

Цель работы — исследование уровня аутоантител в сыворотке крови пациентов с БА к трем поверхностным белкам мембран нейронов мозга — α7-типу ацетилхолинового рецептора (AChR), прионному белку (PrP) и рецептору конечных продуктов гликозилирования (RAGE).

Из данных литературы [6—8] известно, что все выбранные белки участвуют в связывании с агрегированной формой β-амилоида, что приводит к гибели нейронов при Б.А. Для определения уровня аутоантител были использованы также два внутриклеточных белка — нуклеофозмин (Nuc) и сурвивин (Sur). Для визуализации антител к соответствующим белкам производили выбор и синтез экспонированных участков всех белков.

Исследовали сыворотку крови 26 больных с вероятной БА (по критериям NINCDS-ADRDA [9] и МКБ-10 [10]): по 13 больных с пресенильным и сенильным типами БА на разных этапах развития заболевания (табл. 1).

Оценку психического статуса пациентов проводили по шкале MMSE с учетом пола и возраста; отмечали также, курит ли пациент в настоящее время.

В качестве контроля была использована сыворотка крови 4 здоровых.

Исследование было разделено на два этапа: на первом — исследовали сыворотку пациентов № 1—9 и здоровых № 1—3 (проводили скрининг всех пептидных фрагментов на выявление аутоантител), на втором — пациентов № 1—26 и здоровых № 1—4 (исследовали сыворотку только против фрагмента, титры антител к которому значительно различались в контроле и у пациентов с БА).

Для синтеза были выбраны экспонированные участки каждого из названных выше белков (табл. 2). Так, из AChR были выбраны пептидные фрагменты последовательности AChR-(1—23) и AChR-(173—193), из прионного белка — PrP-(17—33), PrP-(95—123) и PrP-(203—229); из белка конечных продуктов гликозилирования — RAGE-(60—76); из двух внутриклеточных белков также были выбраны фрагменты: из сурвивина — Sur-(1—22), из нуклеофозмина — Nuc-(19—36) и Nuc-(283—294). Для визуализации антител к сурвивину, помимо синтетического фрагмента, был использован рекомбинантный белок Sur-rec.

Синтез выбранных пептидов был осуществлен твердофазным методом, как описано в литературе [11].

Ранее была изучена активность некоторых из выбранных фрагментов белков-мишеней β-амилоида (AChR и PrP) в животной модели БА, и показано, что иммунизация ими приводила к индукции терапевтических антител к мишеням β-амилоида и сохранению пространственной памяти животных [12, 13].

Забор крови проводили в стерильных условиях в вакуумные пробирки. Образцы крови центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин и затем отбирали супернатант в отдельные конические пробирки типа «эппендорф». Готовили аликвоты по 20 мкл каждого образца сывороток, добавляли азид натрия (0,5%) и хранили при –20 °С.

Короткий фрагмент Nuc-(283—294) был конъюгирован с высокомолекулярным белком-носителем гемоцианином улитки (Keyhole limpet hemocyanin — KLH). Для этого к 0,94 мл раствора KLH в фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline — PBS) pH 7,4 добавляли 1 мг пептида, перемешивали 30 мин, затем по каплям добавляли 50 мкл 0,25% раствора глутарового альдегида, инкубировали 16 ч и диализовали против PBS в течение 18 ч с трехкратной сменой буфера.

Для проведения ИФА в лунки 96-луночного планшета вносили раствор пептида в воде либо KLH-конъюгат пептида в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере рН 9,5 в концентрации 20 мкг пептида/мл или 30 мкг в расчете на пептид для конъюгированного фрагмента Nuc-(283—294) и проводили инкубацию в течение ночи при +4 °С. Затем проводили четырехкратную промывку буфером PBS, содержащим 0,5% детергента tween 20. В случае использования конъюгатов пептидов дополнительно проводили забивку лунок 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (bovine serum albumin, или BSA) при 37 °C в течение 1 ч и снова промывали их. Далее добавляли образцы сывороток в разведениях 1:40 и 1:80, после чего снова промывали лунки PBS tween. Затем проводили инкубацию с антителами против иммуноглобулинов человека, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 1 ч при 37 °C и промывали 4 раза PBS tween. Для визуализации в лунки добавляли раствор субстрата (0,05% перекиси водорода и 0,05% о-фенилендиамина в цитратном буфере, pH 5,0). Реакцию останавливали добавлением 10% серной кислоты и измеряли оптическое поглощение при 492 нм. Результаты приведены в виде единиц оптической плотности (ЕОП). При разведении 1:80 наблюдалась наиболее четкая разница между сыворотками здоровых и пациентов с БА.

Как говорилось выше, на первом этапе исследования проводили скрининг сыворотки крови пациентов с БА № 1—9 и здоровых № 1—3 на наличие антител ко всем выбранным фрагментам (табл. 3). Изучали связывание каждой индивидуальной сыворотки. В табл. 3 приведены наиболее низкие и высокие значения ЕОП в обеих группах.

Среди всех исследованных фрагментов белков антитела в сыворотке пациентов и здоровых были обнаружены к двум фрагментам ацетилхолинового рецептора AChR-(1—23) и AChR-(173—193), двум — прионного белка PrP-(17—33) и PrP-(95—123), одному — рецептора конечных продуктов гликозилирования RAGE-(60—76) и белка Nuc-(19—36). К остальным фрагментам связывание антител было незначительным. Различия в связывании сыворотки здоровых и пациентов выявлены при использовании фрагментов ацетилхолинового рецептора — сыворотка пациентов связывалась с пептидами AChR-(1—23) и AChR-(173—193) со значительно меньшей интенсивностью, чем здоровых. Наибольшие различия в интенсивности связывания аутоантител в обеих группах проявил пептид AChR-(173—193). Так, у здоровых диапазон оптической плотности составил 0,801—1,276 ЕОП, а в группе пациентов — 0,198—0,456 ЕОП. В связи с этим для проведения дальнейших исследований был выбран фрагмент AChR-(173—193).

На втором этапе исследования были изучены образцы сыворотки крови всех 26 пациентов и 4 здоровых против фрагмента AChR-(173—193), разница в связывании антител с которым в сыворотке крови здоровых и пациентов с БА была наиболее выраженной. Проведенные исследования показали, что в 24 сыворотках пациентов был выявлен уровень аутоантител значительно ниже, чем у здоровых (см. рисунок). Сыворотка пациентов № 21 и № 26 показали значения оптической плотности, близкие к таковым у здоровых.

В проведенном исследовании не было выявлено зависимости уровня антител к фрагменту AChR-(173—193) от типа или этапа развития БА, а также возраста или показателя MMSE. Возможно, для ее обнаружения необходимо проводить более масштабные исследования.

В результате проведенных экспериментов среди выбранных нами белков антитела в сыворотке крови больных обнаруживались к нескольким белкам, однако достоверные изменения в связывании антител между группами здоровых и пациентов с БА наблюдались только к фрагменту ацетилхолинового рецептора AChR-(173—193). Отметим, что фрагмент AChR-(1—23) также показал различия между пациентами с БА и здоровыми, однако не столь значительные. Так, уровень антител к двум фрагментам AChR был ниже у пациентов с Б.А. Полученные нами данные показывают несомненное участие AChR α7-типа и антител к нему в развитии БА.

Изначально ацетилхолиновая система «страдает» при развитии БА, что проявляется в снижении холинергической иннервации, дефиците ацетилхолина и как следствие — потере памяти [14, 15]. AChR α7-типа наиболее широко представлены на нейронах гиппокампа и коры мозга, поэтому снижение уровня данного белка при БА наблюдается именно в этих отделах [16, 17]. Ранее было показано, что α7-субъединицы AChR включаются в патогенез травматических повреждений мозга и, возможно, играют важную роль в их развитии [18]. Следует отметить, что информация о роли антител к этому рецептору противоречива. Так, проведенные нами ранее исследования [12, 19] показали, что антитела к фрагменту AChR-(173—193) оказывали терапевтическое действие на модели БА у животных и защищали клетки от индуцированной β-амилоидом гибели. В то же время есть информация [20] о том, что эти антитела стимулируют индукцию интерлейкина-6 астроцитами, что приводит к развитию воспалительных процессов в мозге. Таким образом, несомненно важная роль антител к AChR при БА требует дальнейшего изучения.

Настоящее исследование показало, что снижение уровня аутоантител к фрагменту AChR-(173—193) не связано с наблюдаемой у пациентов с БА иммунодепрессией, поскольку к фрагментам других белков (PrP, RAGE, Nuc) в сыворотке пациентов был обнаружен высокий уровень антител, даже превышающий таковой у здоровых. Таким образом, определение уровня антител к фрагменту AChR-(173—193) является терапевтически значимым маркером БА и может служить простым методом, уточняющим диагностику заболевания.

Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ № 14−04−31232.