В процессах межнейронных взаимодействий важная роль отводится газотрансмиттерам — новому классу сигнальных молекул, экспрессия которых установлена не только в интернейронах, расположенных внутри вазомоторных ядер, но и между ними [1, 2]. Межъядерные интернейроны (МЯ) образуют отдельную популяцию клеток, находящихся в состоянии постоянного тонического возбуждения [3, 4]. При импрегнации препаратов ствола мозга отчетливо видно, что некоторые из них участвуют в образовании локальных цепей между вазомоторными ядрами, другие отдают длинные отростки к ядрам выше- и нижележащих отделов мозга [5—7]. Вероятно, особенности структурной организации МЯ находят отражение в функциональных свойствах этих клеток, что может проявляться в обычных условиях жизнедеятельности организма и особенно ярко при сосудистой патологии.

Цель нашего исследования — изучение МЯ, участвующих в обмене оксида азота, сероводорода и монооксида углерода в каудальных отделах ствола мозга у практически здоровых и страдавших при жизни артериальной гипертензией людей.

Для исследования был использован аутопсийный материал судебно-медицинских исследований 8 практически здоровых мужчин в возрасте 18—44 лет (контроль) и 19 мужчин соответствующего возраста, погибших от механических травм, не связанных с повреждением головного мозга и диагностированной при жизни артериальной гипертензией (АГ) II—III степени. В каждом случае не позднее 3 ч после смерти из полости черепа извлекали головной мозг, отделяли от него продолговатый мозг. Мозговую ткань фиксировали в течение 4 сут в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М-фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 °C, затем пропитывали в течение 3 сут в холодном 30% растворе сахарозы («Serva», Германия) на 0,1 М-фосфатном буфере, после чего замораживали и хранили в жидком изопентале при –70 °С. Для иммуногистохимического исследования из образцов мозга готовили серийные криостатные срезы толщиной 30—40 мкм, которые последовательно инкубировали в 1% нормальной сыворотке лошади в течение 1 ч при комнатной температуре, затем — 18 ч в разведении 1:1000 с моноклональными антителами мыши («Abcam», Великобритания) против нейрональной формы синтазы окиси азота (nNOS), которая в физиологических условиях является морфологическим маркером оксида азота в нервных клетках, цистатионин β-синтазы (СВS) — маркером сероводорода, гемоксигеназы-2 (НО) — маркером монооксида углерода. После этого проводили инкубацию с биотинилированными антителами лошади против IgG («Vector Labs», США) в разведении 1:100 в течение 2 ч и авидин-пероксидазным комплексом («Vecstain Elite ABC Kit», «Vector Labs», США) 1 ч при комнатной температуре. Отмывку препаратов между инкубациями проводили фосфатным буфером. Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина («DAB Substrate Kit for Peroxidase Vector Labs», США) под контролем микроскопа. Затем срезы промывали, обезвоживали в спиртах по стандартной методике и заключали в полистерол. Для контроля специфичности реакций исключали стадию инкубации срезов в специфической антисыворотке. В этих случаях иммунопозитивная реакция на контрольных срезах отсутствовала. В работе использовали также гистохимический метод на NADPH-диафоразу, позволяющий довольно полно исследовать структурные особенности нейронов и их взаимоотношения с другими клетками.

Отдельно изучали клеточные группы МЯ, находящиеся между гиганто- и мелкоклеточным ретикулярными ядрами (МЯ1), ядрами мелкоклеточным и одиночного пути (МЯ2), а также в окружении ретикулярного латерального ядра (МЯ3). Для этого в серии из не менее 20 последовательных срезов каудальной части продолговатого мозга первый окрашивали метиленовым синим или на NADPH-диафоразу (NADPH-d), следующие три — для исследования nNOS (NO-нейроны) и СВS (Н2S-нейроны) и, НО (СО-нейроны). Окраску остальных срезов проводили в той же последовательности. Ядра ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях. Пространственные отношения между исследуемыми группами клеток изучали описанным ранее методом [8]. Препараты просматривали под микроскопом Axiovert 200 М. Подсчет числа и определение размеров нейронов производили на монтажах, сформированных программой AxioVision 4.8, учитывая только клетки, имеющие отчетливо видимое ядро.

Вычисляли среднюю площадь профильного поля интернейронов (мкм²), их общее количество при окраске препаратов метиленовым синим и долю от них, приходящуюся отдельно на NO-, Н2S- и СО-нейроны, концентрацию (относительная плотность) клеток из расчета на 1 мм², интенсивность реакции (ИР), измерение которой проводили пиксельным методом [9]. Для количественной обработки материала использовали пакет компьютерных программ, внедренных в АСАИ Allegro-MC. Данные представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученные при обработке каждого среза в отдельности (не менее пяти для каждого фермента), взятого от каждого трупа. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Значения доверительного интервала р<0,05 считали статистически достоверными.

В контроле между компактно расположенными нейронами вазомоторных ядер определялись небольшие группы и отдельно лежащие МЯ, среди которых при специфической иммуноцитохимической реакции выявлялись интернейроны, экспрессирующие nNOS, СВS или, НО (рис. 1). В местах локализации соответствующих ферментов образовывался гранулярный осадок, который в зависимости от плотности расположения преципитата маркировал нейроны и нервные проводники в различные оттенки коричневого цвета.

Гистохимическим методом на NADPH-d выявлялись структурные особенности организации МЯ (рис. 2). Клетки различались формой, размерами, структурой и длиной отростков. Чаще других встречались интернейроны веретеновидной и полигональной формы, выявлялись также округлые и треугольные. Тела М.Я. или тесно прилежали, образуя компактные группы из 3—4 клеток, или находились на некотором расстоянии друг от друга. Они связаны между собой, а также с внутриядерными интернейронами и внутримозговыми сосудами различными по протяженности отростками. Некоторые дендриты напоминали куст из нескольких коротких расходящихся веточек (см. рис. 2) или при последовательной бифуркации основного ствола отростки удалялись на значительное расстояние от тела клетки (см. рис. 2). Первые выявлялись во всех трех клеточных группах, обычно у интернейронов небольшого размера, вторые чаще встречались в МЯ1 у более крупных (свыше 350 мкм²) клеток.

Среди МЯ, экспрессирующих nNOS, НО или СВS, наиболее часто определялись мелкие межъядерные интернейроны площадью от 150 до 200 мкм² (мМК). На их долю приходилось не менее ½ от общего числа иммунопозитивных нервных клеток соответствующей медиаторной принадлежности (рис. 3). Среди крупных межъядерных клеток (кМК) наиболее многочисленную группу (24—32%) составляли интернейроны площадью от 350 до 500 мкм². В мелких интернейронах чаще наблюдалась экспрессия nNOS и НО, в более крупных — СВS.

В мМК интенсивность реакции nNOS и, НО почти на 1/3 выше, чем кМК (см. рис. 3). Среди СВS-позитивных клеток такой зависимости не прослеживалось: плотность отложения продукта реакции невысока во многих мелких и части крупных интернейронов (см. рис. 1), поэтому различия ИР между этими группами клеток несущественны (р>0,05). Среди клеток, содержащих СВS, ИР достоверно ниже, чем включающих nNOS и, НО (р<0,05), среди которых выявляется большая группа мелких клеток с высокой и умеренной плотностью отложения продукта реакции (см. рис. 1). Среди NO- и СО-нейронов отчетливо прослеживаются локальные различия ИР: ее величина в МЯ2 и МЯ3, где много мМК, существенно выше, чем в МЯ1 (р<0,05). Среди Н2S-нейронов зависимость значений ИР от местоположения клеток выражена в меньшей степени (см. рис. 3).

Концентрация МЯ в значительной степени связана с нейрохимией интернейронов, однако всегда выше среди мМК (см. рис. 3). Наибольшая величина установлена среди мелких nNOS- и НО-позитивных интернейронов, достоверно ниже относительная плотность мМК, экспрессирующих СВS (р<0,05). Однако среди кМК концентрация последних наибольшая: более чем на 1/3 превышающая значения показателя в НО- и в 2 раза — nNOS-позитивных клетках (р<0,05). Между NO-нейронами выявлены наиболее существенные локальные отличия концентрации клеток (см. рис. 3). Только среди них определяются достоверные отличия величины показателя между всеми группами МЯ (р<0,05). Концентрация СО-нейронов в МЯ1 существенно ниже, чем в МЯ2 и МЯ3 (р<0,05), между которыми значимых различий нет (p>0,05). В отличие от нейронов, экспрессирующих nNOS и НО, относительная плотность СВS-нейронов в МЯ1—3 примерно одинакова (р>0,05).

Различия реакции мелких и крупных интернейронов отчетливо проявлялись при развитии А.Г. При окраске на NADPH-d по длине отростков, отходящих от тел кМК, обнаруживались участки с плотным отложением продукта реакции, другие — бледно окрашиваются, а их анатомическая целостность прерывалась участками, имеющими мелкозернистую структуру (см. рис. 2). Появлялись сильно извитые, неравномерно утолщенные, иногда фрагментированные волокна, тонкие концевые веточки находились на некотором расстоянии от нейрона или не определялись совсем. В большинстве мМК структурные изменения были выражены слабо или не определялись. В некоторых из них, обычно интенсивно окрашенных, отростки умеренно утолщены, а по их ходу обнаруживаются спиралевидные или лентообразные извитости. В терминальных отделах таких проводников отмечалось разрастание концевых ретикуляров, отличающихся интенсивным отложением преципитата (см. рис. 2). Подсчеты показывают, что изменения мМК при АГ связаны с увеличением значений исследованных показателей (см. рис. 3). В зависимости от типа газотрансмиттерных нейронов доля мМК и концентрация возрастали при АГ II степени в среднем на 6—10% (р<0,05), АГ III степени — на 8—14% (р<0,05). ИР в большинстве мелких клеток не отличалась от контрольного уровня (см. рис. 3), в связи с чем увеличение ее значений (3—5%) при АГ не выходит за рамки статистически значимой погрешности (p>0,05), несмотря на то что в некоторых мМК интенсивность реакции очень высока (см. рис. 3). В отличие от мелких интернейронов в кМК наблюдалось достоверное снижение (р<0,05) величины всех изученных количественных показателей (см. рис. 3). Более существенные изменения во всех случаях отмечались среди nNOS-позитивных нейронов.

Вместе с тем сокращение величины показателей в значительной степени зависело от локализации клеток (см. рис. 3). В МЯ1, где много кМК, изменения были более выражены, чем МЯ3 и МЯ2, где их не так много. Например, при АГ II—III степени ИР в NO-нейронах в МЯ1 сокращалась в среднем на 10—14% (р<0,05), а в МЯ3 — только на 5—8% (р<0,05), концентрация — на 6—9 (р<0,05) и 8—12% (р<0,05) соответственно. Снижение соответствующих показателей, вычисленных среди НО- и H2S-нейронов было не так выражено и достигало достоверного уровня только в МЯ1 при АГ II степени и МЯ3 при АГ III степени (р<0,05).

В «вазомоторной области» продолговатого мозга, отличающейся большим топохимическим разнообразием клеток, многочисленную группу образуют интернейроны, содержащие газотрансмиттеры, которые играют важную роль в центральных механизмах регуляции гемодинамики. Экспрессия ферментов, участвующих в образовании этих веществ, выявлена в интернейронах вазомоторных ядер ствола мозга [10, 11], а увеличение или снижение концентрации NO, СО и Н2S в соответствующих областях мозга вызывало изменение тонуса сосудов и артериального давления [12—15]. Приведенные в данной работе материалы показывают, что экспрессия nNOS, НО и СВS наблюдается и в других интернейронах, которые находятся между ретикулярными и неретикулярными ядрами продолговатого мозга. Эта относительно немногочисленная группа клеток отличается от внутриядерных нейронов размерами, характером образуемых связей, количеством, интенсивностью иммуногистохимической реакции. Кроме того, в нейронах вазомоторных ядер в 2—3 раза выше концентрация nNOS, НО-2 и СВS [1, 2, 10].

Недавно было показано [16, 17], что популяция МЯ функционально неоднородна. Выполненные с применением микроэлектронной техники исследования показали, что реакция мелких и крупных интернейронов на раздражение афферентных систем имеет определенные особенности. Мелкие клетки обеспечивают прежде всего межнейронное взаимодействие афферентных и эфферентных сигналов в локальных участках мозга. Для них характерна определенная дифференцировка межклеточных связей, поэтому смешения полисенсорных сигналов не происходит. Крупные клетки, находясь в состоянии постоянного тонического возбуждения, стабильно посылают импульсы в вышележащие отделы мозга и на периферию. Многие из таких нейронов обладают ауторитмической («pacemaker-like») активностью [4, 6]. Сигналы, достигающие находящихся в боковых рогах спинного мозга симпатических центров, обеспечивают поддержание сосудистого тонуса. Эти нейроны идентифицированы с помощью пероксидазной метки, вводимой в область бокового рога спинного мозга, и антидромной электрической стимуляции интермедиолатеральных клеточных столбов в грудной части спинного мозга [7, 18].

Согласно нашим данным, у мелких и крупных МЯ структура отростков и характер образуемых ими связей существенно отличаются. У мМК выявляются дендриты, напоминающие куст из нескольких коротких расходящихся веточек. Они контактируют с лежащими поблизости МЯ или интернейронами, находящимися на периферии вазомоторных ядер, участвуя в образовании локальных межъядерных нейронных цепей. У кМК отростки удаляются на значительное расстояние от тела клетки, отдавая восходящие или нисходящие ветви в другие отделы мозга. Такие клетки угнетаются активацией механорецепторов синокаротидной зоны, а возбуждаются хеморецепторными афферентными входами [4, 6]. Помимо вазомоторных рефлексов, они обеспечивают проведение сигнала к ядрам гипоталамуса в процессе формирования эмоционально-поведенческих реакций и координацию процессов кровообращения и дыхания [5]. Уровень экспрессии nNOS и, НО в мМК в несколько раз выше, чем в кМК.

Однако наиболее существенные отличия выявлены в реакции мелких и крупных МЯ на изменение артериального давления. Среди мМК различной медиаторной принадлежности величина количественных показателей при АГ не меняется или наблюдается некоторое их повышение. Со стороны кМК, напротив, отмечается быстрая и выраженная реакция, связанная со снижением количественных показателей и разнообразными нарушениями структуры большинства нейронов. Уже при первых исследованиях нитроксидергических нейронов в различных отделах мозга было выявлено небольшое количество (~2%) мелких интернейронов с интенсивной ферментативной реакцией («одиночные энзимоактивные клетки»), которые оставались неизмененными при разнообразной патологии нервной системы, когда большинство других нейронов погибало [19]. Аналогичные данные были получены при изучении вазомоторных ядер ствола мозга при хроническом подавлении NО-синтазы и развития вследствие этого АГ [20].

Как показали наши наблюдения, при развитии АГ наблюдается постепенное сглаживание локальных отличий МЯ, особенно выраженное среди нитроксидергических клеток. В результате в первую очередь происходят изменения пространственных отношений интернейронов вазомоторного центра продолговатого мозга, а затем за счет изменений структурной организации межнейронных связей, возможно, его выше- и нижележащих отделов, что может привести к системному ремоделированию нервного центра и общему снижению регуляторного потенциала управляющих воздействий [5, 10].

Таким образом, в центральные механизмы управления гемодинамикой вовлечены по крайней мере две группы интернейронов: внутри- и межъядерные. Реакция мелких и крупных МЯ на повышение артериального давления различается: мМК сохраняют относительно стабильную организацию при АГ и выполняют, по-видимому, преимущественно интегративную функцию, кМК, напротив, активно реагируют на повышение ДА, что подтверждает их участие в регуляции гемодинамики.