Распределение мексидола в структурах головного мозга, его клеточных элементах и субклеточных фракциях

Гипоксия лежит в основе многих неврологических заболеваний [1]. Для купирования возникающих в этом случае метаболических нарушений необходимо обеспечить как можно более раннюю коррекцию энергетического обмена и восстановление клеточного гомеостаза. Одними из самых перспективных и эффективных лекарственных препаратов, применяемых с этой целью, являются антигипоксанты и антиоксиданты, способные предотвращать, уменьшать или ликвидировать проявления гипоксии благодаря поддержанию энергетического обмена в режиме, достаточном для сохранения структуры и функциональной активности клеток [2]. Среди таких препаратов наибольшая эффективность отмечается у веществ, проникающих в митохондрии и являющихся энергетическими субстратами (производные янтарной кислоты), а также прямых антиоксидантов [3]. К числу последних относится мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат) - оригинальный отечественный антиоксидант и антигипоксант.

Наиболее выраженный терапевтический эффект мексидол оказывает при цереброваскулярных и нейродегенеративных заболеваниях, таких как ишемический и геморрагический инсульты, хроническая ишемия мозга, черепно-мозговая травма, болезни Альцгеймера и Паркинсона [4, 5]. Для повышения эффективности и без­опасности фармакотерапии c использованием мексидола важным является дальнейшее исследование его фармакокинетики, в частности изучение процессов проникновения через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и в митохондрии, где реализуется его основное действие.

Цель настоящего исследования - изучение проникновения мексидола через ГЭБ в разные отделы головного мозга, а также в митохондрии клеток.

Исследование было проведено на половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 220-300 г, полученных из питомника «Столбовая».

Изучение проникновения мексидола через ГЭБ было выполнено на 36 крысах. Мексидол вводили животным внутрижелудочно с помощью металлического зонда в дозе 200 мг/кг массы в форме суспензии на очищенной воде [6]. Через 30 мин, 1, 1,5, 2, 3 и 4 ч после введения препарата проводилась эвтаназия животных под эфирным наркозом (по 6 животных на каждую временну'ю точку).

Для исследования были взяты следующие отделы головного мозга: кора лобных долей больших полушарий, мозжечок, таламус и продолговатый мозг. Кроме того, бралась кровь из брюшной аорты в объеме 5 мл в гепаринизированные пробирки.

Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин. Ткань мозга гомогенизировали в 0,01 М трис-HCl буферном растворе в соотношении 1:10 в течение 1 мин на гомогенизаторе DIAX 900, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Исследование распределения мексидола между митохондриальной и цитоплазматической фракциями коры больших полушарий было выполнено на 10 животных. Мексидол вводили животным перорально в дозе 200 мг/кг массы с последующей эвтаназией под эфирным наркозом через 1,5 и 2,0 ч (по 5 животных на каждую временну'ю точку). Образцы коры больших полушарий мозга гомогенизировали в 0,01 М трис-HCl буферном растворе, приготовленном на 0,05% растворе сахарозы в соотношении 1:10 в течение 30 с на гомогенизаторе Поттера на холоде. Полученный гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочный слой подвергали дифференциальному центрифугированию на холоде при 12 000 об/мин для осаждения митохондрий, после чего над­осадочный слой отбирали для дальнейшего анализа (цитоплазматическая фракция). Осадок разводили в 1 мл трис-HCl буфера, добавляли 2 объемных процента тритона Х-100, гомогенизировали на гомогенизаторе DIAX 9000 (митохондриальная фракция).

Концентрацию мексидола в плазме крови, гомогенатах исследуемых отделов мозга, а также в митохондриальной и цитоплазматической фракциях коры больших полушарий крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для экстракции мексидола к 1 мл исследуемого образца добавляли 3 мл этилацетата (Acros organics), перемешивали на приборе Vortex и помещали на встряхиватель для пробирок Shaker на 10 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Органический слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе (Heidolph instruments). Сухой остаток растворяли в 300 мкл подвижной фазы и 100 мкл раствора вводили в хроматограф [6].

Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Beckman Coulter (США) с ультрафиолетовым спектрофотометрическим детектором при длине волны 296 нм в изократическом режиме по оригинальной методике. При анализе использовали хроматографическую колонку Beckman 4,6×150 мм (зернение 5 мкм). Температура разделения была 28 °С; скорость потока - 0,5 мл/мин. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила (Chem-lab) и воды в объемном отношении 20:80 с добавлением 0,05% триэтиламина (Chem-lab) и ортофосфорной кислоты («ХИММЕД») до pH 4,3. Время удерживания мексидола в данных условиях составило 18,1 мин.

Для статистической обработки результатов применяли программу Statistica 7.0. Характер распределения полученных данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Достоверность различий между группами, имеющими нормальное распределение показателей, рассчитывали по критерию Стьюдента; при распределении данных, отличном от нормального, - по критерию Манна-Уитни. Связь между концентрацией мексидола в плазме крови животных и его содержанием в гомогенатах разных отделов головного мозга определяли по коэффициенту корреляции Пирсона. Для данных, имеющих нормальное распределение, рассчитывали среднее арифметическое значение (M) и стандартное отклонение (SD), для данных, распределение которых отлично от нормального, - медиану (Me), верхний и нижний квартиль (25%; 75%).

Основные результаты, касающиеся распределения мексидола в гомогенатах разных отделов головного мозга крыс, представлены в таблице.

При изучении соотношения концентрации мексидола в гомогенатах исследуемых отделов головного мозга крыс и его содержания в плазме крови были получены следующие результаты: наблюдалась прямая пропорциональная связь между концентрацией мексидола в плазме крови и его содержанием в гомогенатах коры больших полушарий (r=0,3744, p=0,024), мозжечка (r=0,4182, p=0,011), таламуса (r=0,8222, p=0,000) и продолговатого мозга (r=0,3442, p=0,04). Эти данные отражены на рис. 1.

При изучении распределения мексидола в митохондриальной и цитоплазматической фракциях коры больших полушарий крыс было установлено, что максимальное его содержание в митохондриальной фракции определялось через 1,5 ч после введения препарата и достоверно на 406,7% (p=0,003) превышало его уровень, наблюдаемый через 2 ч после введения (рис. 2).

В настоящем исследовании установлено, что мексидол проникает через ГЭБ в разные структуры головного мозга крыс, что может объяснить все его основные фармакологические эффекты - нейропротекторный, антигипоксический, антиоксидантный, анксиолитический и ноо­тропный [1, 4, 5]. При этом максимальная концентрация в гомогенатах мозжечка и таламуса обнаруживалась уже через 30 мин после введения препарата, а в гомогенатах коры больших полушарий и продолговатого мозга - через 1 ч. При проведении перерасчета полученных концентраций мексидола в гомогенатах исследуемых отделов головного мозга крыс из нг/мл в мМ установлено, что они примерно соответствуют концентрациям, в которых препарат проявляет антиоксидантную активность в опытах in vitro, например, содержание мексидола 600 нг/мл соответствует уровню 0,047 мМ [7].

При изучении корреляции между концентрацией мексидола в гомогенатах разных отделов головного мозга крыс и его содержанием в плазме крови была выявлена достоверная прямо пропорциональная зависимость. Это свидетельствует о том, что проникновение мексидола в головной мозг через ГЭБ, скорее всего, носит характер простой диффузии.

В эксперименте максимальная корреляционная связь (r=0,8222, p=0,000) между концентрацией мексидола в таламусе и в плазме крови и более быстрое время ее достижения по сравнению с другими отделами головного мозга (уже через 30 мин после введения препарата), вероятно, связаны с тем, что в пробу таламуса попадала и гипоталамо-гипофизарная область, где ГЭБ имеет высокую проницаемость [8], и мексидол может проникать в головной мозг за более короткое время.

Концентрация мексидола в гомогенате коры больших полушарий через 1 ч после введения превышала его содержание в гомогенатах мозжечка, таламуса и продолговатого мозга, а через 1,5 ч - в гомогенате мозжечка. Данные различия, скорее всего, связаны с тем, что для приготовления гомогената коры больших полушарий использовалась только кора - серое вещество, представленное преимущественно нейронами и нейроглией, способными накапливать мексидол. Для приготовления гомогенатов таламуса, мозжечка и продолговатого мозга брались образцы головного мозга, содержащие также значительное количество белого вещества, представленного нервными волокнами, не накапливающими мексидол.

В ходе выполнения работы было показано, что мексидол способен проникать внутрь митохондрий, которые являются основной мишенью его фармакологического воздействия. Пик концентрации в митохондриях наблюдали через 1,5 ч и после этого его содержание резко снижалось. Видимо, после проникновения внутрь митохондрий мексидол быстро гидролизуется на составные компоненты - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин и янтарную кислоту. Первый метаболит начинает связывать свободные радикалы, образующиеся в процессе переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий, а второй включается в цикл трикарбоновых кислот [1, 4, 5].

Обобщая представленные данные, можно сделать следующие выводы: мексидол проникает через ГЭБ в ткань головного мозга, накапливаясь преимущественно в коре больших полушарий, и он способен проникать внутрь нервных клеток, обнаруживаясь в митохондриальной и цитоплазматической фракциях.