Введение

Проблема туберкулеза в настоящее время стоит остро не только для отдельных регионов, но и для всего мира в целом. Несмотря на прилагаемые усилия к снижению заболеваемости туберкулезом, тенденция распространения штаммов с широкой и множественной лекарственной устойчивостью приобретает угрожающие масштабы [1]. С возрастанием случаев лекарственно-устойчивых форм заболевания усложняется и назначаемая терапия: комбинированное лечение может включать до 6 одновременно принимаемых препаратов, а длительность курса — увеличиваться до 21 мес. Препараты резервного ряда, на которых и основывается индивидуальная терапия, имеют большой спектр побочных эффектов, в частности нефро- и гепатотоксичность, что в результате может привести к увеличению риска непреднамеренного отравления. Кроме того, препараты из этой группы могут использоваться с целью совершения суицида [2].

«Перхлозон» — это инновационный лекарственный препарат, разработанный в России для борьбы с формами туберкулеза с широкой и множественной лекарственной устойчивостью. Ввиду того что препарат используется относительно недолгое время, данные в литературных источниках о его механизме действия, метаболизме не представлены, как и не найдена информация об особенностях химико-токсикологического анализа [3].

Цель исследования — изучение особенностей извлечения Перхлозона из матриц биологического происхождения в химико-токсикологическом отношении.

Материал и методы

В ходе эксперимента использовали препарат «Перхлозон» — таблетки, покрытые оболочкой, по 0,2 г; воду очищенную; спирт этиловый 60%; хлористоводородной кислоты раствор 0,1 М; натрия гидроксида раствор 0,1 М; аммиака раствор концентрированный 25%; аммиачный буфер pH 10; органические растворители: бутилацетат «х.ч.», гексан «х.ч.», гептан «х.ч.», диэтиловый эфир «ч.д.а.», хлороформ «х.ч.», этилацетат «х.ч.»; растворы электролитов: (NH₄)₂SO₄ «х.ч.» — насыщенный раствор, Na₂CO₃ «х.ч.» — насыщенный раствор, Na₂SO₄ «х.ч.» — насыщенный раствор, NaCl — насыщенный раствор; (NH₄)₂SO₄ «х.ч.» — раствор 20%, Na₂CO₃ «х.ч.» — раствор 10%, Na₂SO₄ «х.ч.» — раствор 5%, NaCl «х.ч.» — раствор 20%.

Пробоподготовку извлечений реализовывали по следующей методике: к 1,0 мл 1% раствора перхлозона в смеси спирта этилового 60% и хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М добавляли 1,0 мл воды. Вариацию значения pH среды от 2 до 11 осуществляли с помощью аммиака раствора концентрированного 25%. Экстрагировали 5,0 мл органического растворителя и испаряли до сухого остатка в токе воздуха при температуре 18—22 °C.

Подтверждение идентичности и количественную оценку проводили спектральными (ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия) и хроматографическими (высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ) методами.

При спектрофотометрической методике установления идентичности для растворения сухого остатка использовали 20,0 мл смеси спирта этилового 60% и хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М (1:1). Аликвоту 1,0 мл помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл и доводили до метки хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, тщательно перемешивали. Регистрировали спектр поглощения исследуемого вещества в области 200—400 нм на приборе «СФ 2000».

Условия идентификации и количественной оценки для высокоэффективной жидкостной хроматографии были подобраны следующие: прибор «МилиХром А-02» жидкостный хроматограф с УФ-детектором, колонка ProntoSIL-120-5 C18 AQ 2×75 мм; подвижная фаза в составе элюент А — NH₄CH₃COO (pH 6,5), элюент Б — ацетонитрил; при изократическом режиме элюирования 15% элюента Б; скорость подачи подвижной фазы — 150 мкл/мин; термостатирование колонки — 35 °C; объем пробы — 2 мкл; длина волны для регистрации сигнала — 312 нм.

Количественную оценку Перхлозона в извлечениях производили по стандартному образцу.

Результаты и обсуждение

Оптимальную методику изолирования Перхлозона из матрицы разрабатывали с учетом оценки влияния разных факторов. Анализ экспериментальных данных степени экстракции заданным рядом изолирующих агентов выявил, что наибольшая степень экстракции достигается этилацетатом при pH 10 (рис. 1).

Рис. 1. График, иллюстрирующий зависимость степени извлечения Перхлозона из матрицы от природы изолирующего агента и рН-среды.

Исследование влияния электролитов показало, что их добавление не увеличивает степень экстракции вследствие всаливающего действия и дальнейшее использование нецелесообразно. Увеличение времени контакта экстрагента с матрицей с 3 до 7 мин не привело к значимому подъему выхода. В то же время трехкратная обработка матрицы порциями чистого растворителя позволила повысить степень извлечения с 70,5±2,5 до 83,5±3%.

Апробацию разработанной методики реализовывали для извлечения Перхлозона из матриц биологического происхождения, а именно: мочи, слюны и плазмы крови [4—5].

Биоматрицу готовили следующим образом: к 35,0 мл мочи добавляли по 15,0 мл раствора Перхлозона, содержащего 3,0, 6,0 и 8,0 мг/мл; к 5,0 мл слюны (предварительно подвергшейся замораживанию в течение суток) добавляли 1,0, 3,0, и 3,0 мл раствора, содержащего 5,0, 10,0 и 15,0 мг/мл соответственно; к 15,0 мл плазмы крови добавляли 5,0, 7,0 и 10,0 мл раствора, содержащего 2,0, 10,0 и 15,0 мг/мл Перхлозона соответственно. Таким образом получали концентрации, равные терапевтической, токсической и летальной дозе (рассчитанные для человека массой 70,0 кг) в пересчете на объем биоматрицы [3—6]. Выдерживали полученные смеси в течение суток при температуре 20 °C. В биоматрицах слюны и плазмы крови осаждали белки, используя трихлоруксусной кислоты раствор 50% и последующее центрифугирование. К 1,0 мл молельной смеси добавляли 1,0 мл воды, 1,0 мл аммиачного буфера pH 10 и экстрагировали в течение 3 мин, трехкратно.

В качестве предварительного метода установления идентичности Перхлозона после извлечения использовали УФ-спектрофотометрический метод. Критерий идентичности Перхлозона в извлечениях из биоматрицы характеризовался максимумом поглощения при 346±1 нм и соответствовал максимуму поглощения стандартного образца (рис. 2).

Рис. 2. УФ-спектр поглощения Перхлозона в области 200—400 нм.

В качестве подтверждающего метода использовали ВЭЖХ. На хроматограмме ВЭЖХ Перхлозон, выделенный из биоматрицы, регистрируется в виде одного пика с объемом удерживания 698 мкл (рис. 3), что соответствует объему удерживания стандартного образца Перхлозона.

Рис. 3. Хроматограмма стандартного раствора Перхлозона (растворитель метанол, концентрация 0,375 мг/мл).

Количественная оценка изолирования дана с помощью ВЭЖХ, полученные результаты представлены в таблице.

Результаты количественной оценки перхлозона при извлечении из матриц биологического происхождения

Приведенные в таблице данные свидетельствуют о том, что применение вышеописанной методики позволяет изолировать достаточное количество препарата (73,5—79,5% из мочи, 66,0—74,7% из слюны и 65,50—68,1% из плазмы крови) для исследования биологического материала на наличие Перхлозона и установления факта отравления.

Представленная методика проста в исполнении и позволяет получить воспроизводимые результаты. Надежность и пригодность для целей химико-токсикологического анализа подтверждена валидацией, относительное стандартное отклонение (RSD, %) составило 4,95% для мочи, 5,03% для слюны и 5,18 % для плазмы [7].

Выводы

В ходе эксперимента оценено влияние разных факторов и выявлены наиболее приемлемые условия извлечения Перхлозона из матрицы (трехкратная экстракция этилацетатом при pH 10 в течение 3 мин).

Предложена схема изолирования перхлозона из матриц биологического происхождения (моча, слюна, плазма крови) с подтверждением ее пригодности в химико-токсикологическом отношении.

Для целей идентификации Перхлозона и его количественного определения в извлечениях из мочи, слюны и плазмы крови предложены методы УФ-спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.