Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) - центральный тормозной нейромедиатор в нервной системе млекопитающих синтезируется путем декарбоксилирования глутаминовой кислоты пиридоксаль-5'-фосфатзависи­мым ферментом глутаматдекарбоксилазой (ГДК). В 70-х годах прошлого века в мозге млекопитающих были обнаружены две изоформы ГДК [1], которые позднее были названы в соответствии с молекулярными массами их субъединиц: ГДК65 и ГДК67 [2, 3]. Они имеют разную субклеточную локализацию и функции. Существование нескольких изоформ ключевых ферментов в мозге млекопитающих - по-видимому, фундаментальное свойство нервной системы, обеспечивающее ее пластичность, в данном случае - это способность к использованию альтернативных метаболических путей [4].

ГДК65 кодируется индуцибельным геном (ГДК2, 10p12.1), экспрессия которого индуцируется при резко возрастающей потребности в обеспечении ГАМК. Она связана главным образом с передачей нервных импульсов и ассоциирована с мембранами синаптических везикул в нервных окончаниях [5, 6]. ГДК65 образует комплекс с другими белками, в частности везикулярным переносчиком ГАМК, что способствует сопряжению синтеза и переноса ГАМК в синаптические везикулы [6], и ее состояние циклично меняется из апо- в холофермент в зависимости от потребности в ГАМК [7]. ГДК67, кодируемая конститутивно экспрессирующимся геном (ГДК1, 1q31.1), более равномерно распределена в клетках. Синтез ГАМК этим ферментом является основным синтетическим путем пула ГАМК, который используется для обеспечения базовых функций нейронов, а также функций, напрямую не связанных с проведением нервных импульсов (например, ГАМК используется в качестве дополнительного энергетического источника или трофического фактора при развитии нервной ткани) [7-9].

О важности роли ГДК в мозге млекопитающих свидетельствует то, что нокаут гена ГДК67 летален, а гена ГДК65 - приводит к развитию у животных крайней степени пугливости и судорожных эпилептических припадков [10, 11].

Нарушения ГАМКергической системы происходят при многих нервных и психических заболеваниях, и, поскольку ГДК - это центральный фермент синтеза ГАМК, много исследований посвящено регуляции экспрессии генов, кодирующих ее изоформы, а также регуляции активности и локализации ее изоформ и их изменениям - в связи с различными патологиями нервной системы.

ГДК исследовалась при нейродегенеративных заболеваниях, в частности болезни Альцгеймера (БА). Так, в недавней работе [12] на модели БА авторы отметили у трансгенных мышей существенное повышение активности ГДК в зонах коры, обогащенных отложениями β-амилоида, причем этого повышения не наблюдалось в мозжечке, в котором у трансгенных животных β-амилоид не откладывается. Оказалось, что повышение активности ГДК происходит только во фракции глиального происхождения. Однако другие авторы [13] наблюдали достоверное снижение числа гиппокампальных нейронов, окрашивающихся антителами к ГДК67, в мозге животных линии TgCRND8 - мышиной модели БА - и связывали это с токсическим действием β-амилоида.

Учитывая эффекты, обнаруженные на животных - моделях БА, и глубокие нейрональные и глиальные нарушения при БА, следует признать большую актуальность исследований ферментов метаболизма ГАМК в мозге больных БА. Результаты исследований изоформ ГДК в аутопсийном мозге при БА оказались весьма противоречивыми, что может быть связано с влиянием артефактов (в основном - из-за состояния сильной гипоксии при агонии) на уровень ГАМК и соответственно ГДК при исследовании образцов аутопсийного мозга больных БА [14, 15]. Известны данные о связи количества ГДК в аутопсийном мозге с конкретным терминальным состоянием (наличие, например, ацидоза, связанного с гипоксией), неоднократно отмечалось снижение ее активности в результате тяжелого длительного заболевания [16, 17].

Учитывая, что в последнее время при изучении когнитивных расстройств все большее внимание уделяется мозжечку [18, 19], а также противоречивые результаты исследований количества изоформ ГДК в мозге при БА, выполнено исследование, целью которого было определение содержания ГДК65 и ГДК67 в аутопсийных образцах мозжечка при БА и установление возможной связи изучавшихся показателей обмена с этой патологией.

Исследование проводили на образцах коры мозжечка из коллекции аутопсийного мозга, собранной и хранящейся при –80 °С в лаборатории нейрохимии (руководитель - проф. Г.Ш. Бурбаева) Научного центра психического здоровья РАМН. Было подобрано 13 случаев БА и 13 контрольных образцов (мозг психически здоровых людей). Эти группы достоверно не различались по интервалу, прошедшему от момента смерти до взятия материала для исследования (4-6 ч), возрасту (в контрольной группе - 52-81 год - медиана 70 лет, в группе БА - 57-83 года - медиана 72 года) и причинам смерти. Обе группы были уравнены также по числу представителей обоих полов (8 женщин и 5 мужчин в каждой).

Образцы ткани (50 мг) гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (стекло/тефлон) в 1 мл 50 мM TRIS-HCl буфера, pH 7,0, с добавлением 0,35 М сахарозы и коктейля ингибиторов протеаз Sigma P8340-5ml, с последующим центрифугированием при 1000 g и удалением осадка, содержащего ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток. В полученные супернатанты добавляли 10% раствор додецилсульфата Na (10% объема) и β-меркапто­этанол (10% объема), образцы нагревали на кипящей водяной бане 5 мин и проводили одномерный электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли (нагрузка на 1 дорожку составила 10 мкг общего белка экстракта) и последующий Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала с использованием поликлональных антител (фирма «Chemicon Ab1511»), дающих реакцию с обеими изоформами ГДК, в разведении 1:10 000 и конъюгата козьих антител к IgG кролика с пероксидазой хрена в том же разведении. Количество иммунореактивных изоформ ГДК оценивали в условных единицах (усл. ед.) после сканирования фотопленок, засвеченных при хемилюминесценции нитроцеллюлозных мембран после Вестерн-иммуноблоттинга, и количественной обработки полученных изображений.

При статистической обработке данных использовали программу Statistica 6.0 (Statsoft), модуль - непараметрический анализ.

Учитывая различную клеточную локализацию и разную степень ассоциации с мембранами изоформ ГДК65 и ГДК67, мы выбрали способ экстракции белков из ткани мозжечка, позволивший достичь полного извлечения обеих изоформ ГДК и перевода их в растворимую форму. Количество обеих изоформ ГДК во всех образцах определялось троекратно. На рис. 1 приведена наиболее типичная картина окрашивания, полученная в результате электрофореза и иммуноблоттинга образцов мозжечка с последующей обработкой антителами, узнающими обе изоформы.

На рис. 2 представлены результаты определения относительного количества иммунореактивных изоформ ГДК65 и ГДК67 в образцах мозжечка контрольной группы и больных БА.

Различия между группами, оцененные критерием Манна-Уитни, были статистически достоверными: для ГДК67 p=0,00004, для ГДК65 p=0,0002. Достоверной корреляции между уровнями ГДК65 и ГДК67 в обеих группах не наблюдалось.

Интересно отметить, что в 90-е годы прошлого века в мозжечке млекопитающих был обнаружен гетеродимер ГДК65/67, хотя специфическая клеточная локализация его не выяснена, а вопрос о том, имеет ли он отношение к распределению фермента во внутриклеточных органеллах, так и остался открытым [21, 22]. Исходя из установленного в настоящей работе отсутствия корреляции между количеством ГДК65 и ГДК67, можно предположить, что в мозжечке человека эти изоформы синтезируются независимо и, поскольку присутствуют не в эквимолярных количествах, не все из них образуют гетеродимеры. Как упоминалось выше, результаты выполненных ранее исследований ГДК при БА были весьма противоречивы. Так, при сравнении образцов мозга больных БА с контрольными случаями не было зарегистрировано достоверных отличий ни в активности ГДК (20 случаев БА и 14 - контрольных) [23], ни в уровнях мРНК ГДК67 [24], хотя первые авторы зафиксировали тенденцию к усилению (по сравнению с контролем) активности ГДК в таламусе, полосатом теле и черной субстанции [23].

В ранних работах [14-16, 25] считалось, что в мозжечке при БА поражаются главным образом холинергические нейроны, а ГАМКергические - в основном остаются интактными, причем, если и наблюдалось «выпадение» ГАМКергических нейронов при БА, исследователи считали это результатом влияния артефактов, в основном из-за состояния сильной гипоксии при агонии.

В работе E. Perry и соавт. [25] при сравнении образцов аутопсийного мозга больных сенильной деменцией (БА) с контрольной группой, независимо от исследованной структуры мозга было отмечено снижение активности ГДК. Однако на нее влияли упомянутые выше факторы, поэтому авторы указали на необходимость тщательного подбора образцов контрольной группы. Впоследствии этот вопрос в литературе специально не поднимался, и возможные влияния считали нивелированными подбором соответствующих контрольных групп.

При сравнении образцов мозга трех групп - пожилых лиц контрольной группы, пожилых пациентов с шизофренией, больных БА - M. Gluck и соавт. [26] наблюдали достоверное снижение активности ГДК при шизофрении по сравнению с контролем, но при сравнении контрольной группы с БА различий не наблюдали. При сравнении уровня экспрессии ГДК67 (количество мРНК) в образцах полосатого тела 5 больных БА и 9 контрольных случаев было обнаружено достоверное повышение сигнала мРНК ГДК67 в дорсальных отделах - хвостатом ядре и скорлупе, но не в вентральном отделе полосатого тела [24]. Недавно при сравнительных исследованиях аутопсийного мозга больных БА и контрольной группы было обнаружено снижение количества иммунореактивной ГДК65 нейронов и нейропиля в образцах височной извилины, гиппокампе и скорлупе. Однако в количестве ГДК67 различий не наблюдалось [27].

В нашей работе было выявлено достоверное снижение количества обеих изоформ ГДК в мозжечке при БА, причем количество изоформы, ответственной за синтез нейромедиаторной ГАМК (ГДК65), снижено при БА в большей степени, чем изоформы, отвечающей за базовый метаболизм ГАМК (ГДК67). Это дает основание предполагать, что, по меньшей мере, в мозжечке при БА нарушаются не только процессы, непосредственно связанные с ГАМК-зависимой нейротрансмиссией (ГДК65), но и базовые процессы по обеспечению нейронов и глией ГАМК (ГДК67). Обнаруженное нами снижение количества обеих изоформ ГДК согласуется с распространенными представлениями о недостаточности в мозге при БА ГАМКергической ингибирующей системы и развивающихся вследствие этого гипервозбуждения и нейротоксичности. В связи с этим можно говорить не о причинах наблюдаемого снижения концентрации ГДК при БА, а о его последствиях и возможных путях их компенсации.

Несмотря на обнаружение многочисленных путей регуляции активности ГДК и экспрессии ее генов, о попытках использования в терапевтических целях этих регуляторных путей неизвестно. Однако, исходя из распространенных представлений о том, что при нейродегенеративных заболеваниях (болезни Паркинсона, Альцгеймера) наблюдается недостаточность активности ГАМКергической системы, обусловленная снижением активности ГДК, был предложен способ повышения активности ГДК посредством генной терапии. Недостаточность ГАМК-системы предложено компенсировать путем введения вектора - последовательности ДНК, кодирующей ГДК, и, таким образом, увеличения количества ГДК в мозге больных эпилепсией, болезнью Паркинсона или Альц­геймера^[1]. Представляет большой интерес дальнейшее развитие исследований в этом направлении.