Одна из актуальных задач современной экспериментальной неврологии - исследование патогенетических закономерностей, лежащих в основе дисфункций дофаминергических структур мозга, наблюдающихся при ряде заболеваний, среди которых по тяжести и социальным последствиям следует выделить болезнь Паркинсона [16]. При этом важное значение в развитии нейродегенеративного процесса при болезни Паркинсона придается глиальным клеткам, в частности астроцитарной нейроглии [7, 15]. По данным литературы [9, 21], астроциты принимают участие в нейротрансмиссии, обмене медиаторных аминокислот - глутамата и ГАМК, формировании синаптических контактов между нейронами и вовлекаются в процессы синаптической пластичности. Астроциты реагируют на повреждение нервной ткани развитием астроглиоза, характеризующегося их усиленной пролиферацией, гипертрофией и увеличением экспрессии глиальных белков, связанных с формированием цитоскелета (в том числе кислый глиофибриллярный белок - GFAP), что ведет к структурным перестройкам в нервной ткани [21]. Ранняя пролиферация астроглии при моделировании дегенерации дофаминовых нейронов, вероятно, опосредована активацией микроглии, вызванной гибелью нейронов [4, 11], но может быть связана и с нарушением баланса медиаторов в базальных ганглиях мозга при дисфункции дофаминергической системы [23]. В то же время влияние активированной нейроглии на нейротрансмиссию изучено недостаточно, так как при активации нейроглии ее ферментные системы, связанные с обменом медиаторов, могут давать неоднозначную реакцию [10, 13, 23].

Цель работы - исследование количественных морфологических и нейрохимических показателей состояния нейронов и нейроглии в нигростриатных образованиях мозга крыс при фармакологическом моделировании гипофункции дофаминовой системы.

Работу проводили на трех группах (по 14 животных в каждой) крыс линии Вистар, самцах с массой тела 200-220 г. Нарушение дофаминергической передачи воспроизводили двумя путями: на протяжении 2 нед 1-й группе внутрибрюшинно вводили резерпин (1,5 мг/кг, раствор в 0,01% Tween-80), нарушающий включение дофамина в везикулы [16, 25], 2-й - раствор галоперидола (0,5 мг/кг), блокирующего D2-рецепторы, контрольной группе - инъекции физиологического раствора.

Для биохимического исследования из каждой группы брали по 8 животных и спектрофотометрическим методом оценивали удельную активность ферментов тирозингид­роксилазы (ТирГд), моноаминоксидазы Б (МАО Б) и глутаминсинтетазы (ГлнСин). Исследования проводили в субклеточных фракциях, полученных дифференциальным центрифугированием гомогенизированной ткани, взятой из хвостатых ядер. Активность ТирГд определяли в цитоплазматической фракции по окислению кофактора реакции гидроксилирования 6-метилтетрагидроптерина и выражали в δD335/мг белка в пробе за 60 мин [3]. Активность МАО Б измеряли в митохондриальной фракции, используя субстрат p-нитрофенилэтиламин, и выражали в δD450/мг белка в пробе за 60 мин [1]. Активность ГлнСин определяли в цитоплазматической фракции по образованию γ-глутамилгидроксамата [5] и выражали в δD540/мг белка в пробе за 30 мин. Содержание белка в пробе измеряли по Лоури. Подробнее использованные методы были описаны нами ранее [2].

Для иммуногистохимического исследования клеточных популяций черной субстанции и хвостатого ядра мозга брали по 6 животных из каждой группы. Мозг контрольных и подопытных крыс фиксировали в 4% формалине и заливали в парафиновые блоки, которые раскладывали на фронтальные срезы толщиной 7 мкм. Иммуногистохимические реакции проводили авидин-пероксидазным методом, следуя протоколу изготовителя антител («Sigma»). Для выявления астроцитов использовали первичные кроличьи моноклональные антитела к GFAP в разведении 1:200. Аналогично выявляли ГлнСин (в разведении 1:5000) и ТирГд (в разведении 1:1000). Проводимые реакции визуализировали при помощи вторичных биотинилированных козьих антител, выработанных к иммуноглобулинам кролика, и стрептавидин-пероксидазы. Пероксидазную метку выявляли реакцией с 3,3-диаминобензидином. Препараты подкрашивали 0,05% раствором крезилового фиолетового.

Для морфометрии препаратов с каждого мозга отбирали 10-15 срезов, выявляющих GFAP или ГлнСин, и исследовали их под микроскопом Leica DMLB, оснащенным цифровой фотокамерой DC-300 и программой анализа изображений Leica Qwin. Для анализа клеточных элементов в дорсолатеральной области хвостатого ядра на каждом срезе случайным образом брали 2-3 поля зрения (0,22 мкм²); у одного животного набирали 25-30 полей зрения. Исследовали плотность распределения (число клеточных элементов на единицу площади) следующих популяций нейроглии: GFAP-позитивной астроглии, астроцитов, содержащих в отростках ГлнСин, и плотность ядер глиальных клеток, которые не выявляли отростков. В области черной субстанции подсчитывали площадь тел и плотность распределения нейронов, содержавших ТирГд.

Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0. Выборки проверяли на нормальность распределения и проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), о различиях между группами судили по апостериорному тесту Фишера.

Проведенное исследование показало, что длительное введение животным резерпина и галоперидола влияло на морфологические параметры дофаминовых нейронов. По сравнению с контролем размеры нейронов, выявляемых иммуногистохимическим методом на ТирГд, значимо снижались в компактной части черной субстанции, под действием резерпина на 12% и галоперидола на 23% (см. таблицу).

В хвостатом ядре при длительном введении оба препарата снижали удельную активность ТирГд (рис. 1): резерпин на 39%, галоперидол на 26% по сравнению с контролем.

Для характеристики процессов обмена медиаторов, в которые вовлечена астроцитарная глия хвостатого ядра, использовали показатели удельной активности МАО Б, отчасти локализованной в астроцитах, и ГлнСин [6, 8]. Хотя действие резерпина и галоперидола на синтез дофамина было сходным, активность МАО Б по сравнению с контролем менялась только под действием резерпина, снижаясь на 30%, но не галоперидола (см. рис. 1). Известно фазовое влияние галоперидола на метаболизм биогенных аминов [20], что позволяет предположить дальнейшее снижение активности МАО Б при более длительном воздействии нейролептика.

Удельная активность ГлнСин (см. рис. 1) в хвостатом ядре по сравнению с контролем статистически значимо снижалась на 14% только под влиянием резерпина. Это, вероятно, может увеличивать содержание внеклеточного глутамата, который в свою очередь может оказывать токсический эффект на клеточные популяции хвостатого ядра [7].

Биохимические изменения ферментных систем сопоставляли с реакцией астроцитов, выявляемых иммуногистохимическим методом на GFAP и ГлнСин, а также по числу глиальных клеток, не содержащих эти маркеры на единицу площади (рис. 2).

Галоперидол, как и резерпин, увеличивал плотность распределения суммарного числа глиальных клеток в хвостатом ядре на 16%, но это происходило не за счет пролиферации астроглии, поскольку он значимо не менял плотность астроцитов, содержащих GFAP или ГлнСин, но статистически значимо повышал (на 15%) плотность распределения прочей глии, что может быть связано с увеличением числа олигодендроцитов.

Анализ изменений удельной активности ТирГд и ее иммуногистохимической локализации в нигростриатной системе показал, что длительное нарушение дофаминергической передачи, вызываемое резерпином и галоперидолом, уменьшает синтез дофамина. Истощение везикулярного пула дофамина под влиянием резерпина и длительная блокада D2-рецепторов галоперидолом снижали удельную активность ТирГд и уменьшали размеры дофаминовых нейронов, что, по-видимому, свидетельствует об ослаблении компенсаторных возможностей системы синтеза дофамина при длительном нарушении дофаминергической передачи. Снижение активности ТирГд в хвостатом ядре под влиянием нейролептиков связывают с подав­лением фосфорилирования фермента [20, 12]. В то же время зарегистрированное нами уменьшение плотности дофаминовых нейронов под действием галоперидола указывает на частичную гибель нейронов черной субстанции, что подтверждается и данными литературы [14, 26].

Моделируемая дисфункция дофаминовой системы приводила к выраженному ответу со стороны глиальных клеток, причем их реакция зависела от мишени воздействия используемых препаратов. Введение резерпина увеличивало плотность распределения GFAP-позитивных астроцитов в стриатуме, что может свидетельствовать об их пролиферации in situ или миграции из перивентрикулярной зоны [11, 15, 21]. Известно, что усиление экспрессии GFAP характерно для различных моделей нейродегенерации дофаминовых нейронов черной субстанции [11]. При этом причинами активации астроцитов стриатума при разрушении черной субстанции может быть как ответ на повреждение ткани мозга, так и реакция астроглии на нарушение медиаторного баланса в базальных ганглиях [4, 11]. Поскольку резерпин не вызывал дегенерацию дофаминовых нейронов черной субстанции в проведенном эксперименте, можно предположить, что наблюдаемая нами активация астроглии является ответом на нарушение медиаторного баланса в хвостатом ядре.

Показано, что значительная часть МАО Б в стриатуме, участвующей в катаболизме дофамина, содержится в астроцитах [8, 19]. Зарегистрированное нами снижение удельной активности МАО Б под действием резерпина, вызывающего нарушения обмена дофамина, можно рассматривать и как компенсаторную реакцию, направленную на поддержание концентрации медиатора. По-видимому, изменения активности МАО Б в астроцитах вносят вклад в регуляцию катаболизма дофамина. По данным литературы [23], астроциты также тесно связаны с глутаматергической передачей в хвостатом ядре. Результаты проведенного исследования cвидетельствуют не только о гетерогенности астроцитов хвостатого ядра по содержанию GFAP и ГлнСин, но и разнонаправленных изменениях синтеза этих белков при активации глии. На фоне повышения плотности распределения GFAP-позитивных астроцитов под действием резерпина наблюдали снижение экспрессии и удельной активности ГлнСин. По-видимому, реакция астроцитов хвостатого ядра при нарушении обмена дофамина может быть вызвана как непосредственно снижением содержания этого медиатора, так и опосредованно через изменения активности глутаматергической системы. В свою очередь обнаруженное в эксперименте снижение активности и экспрессии ГлнСин при активации астроглии может быть одной из причин описанного при гипофункции нигростриатной системы повышения содержания внеклеточного глутамата [18]. Кроме того, по некоторым данным [27], подавление экспрессии ГлнСин усиливает миграцию астроцитов, что указывает на возможную роль регуляции активности этого фермента при перестройках внеклеточного матрикса, наблюдаемых при активации астроглии.

Галоперидол в отличие от резерпина значимо не влиял на исследованные ферментные системы катаболизма медиаторов, связанные с глиальными клетками, и не менял плотность распределения астроцитарной глии. Однако его длительное введение увеличивало плотность прочей глии, вероятно, за счет олигодендроцитов, что находит подтверждение и в литературе [24], так как было показано, что галоперидол оказывает влияние на процессы их дифференцировки. Отмечено, что галоперидол не влия­ет на обмен глутамата в астроцитах [17], что подтверждается и нашими результатами. Вероятно, отсутствие активации астроглии под действием галоперидола связано с его избирательным действием в отношении D2-рецепторов и, как следствие, слабым влиянием на кортико-стриатную глутаматергическую систему, активность которой модулируется D1-рецепторами [18]. Кроме того, галоперидол подавляет иммунную реакцию в мозге [22], что также может быть причиной отсутствия выраженного ответа со стороны астроцитов, реакция которых тесно связана с иммунными взаимодействиями [21]. Следовательно, можно заключить, что астроцитарные ферменты медиаторного обмена и экспрессия астроцитами кислого глиофибриллярного белка регулируются различными механизмами, и изменения этих показателей могут быть разнонаправленными. Развитие реактивного глиоза, усиливающего экспрессию GFAP и пролиферацию астроглии в ответ на патологическое воздействие, вероятно, не всегда сопровождается усилением других глиальных функций.

В то же время, по данным литературы [23] и полученных нами результатов, можно предположить, что активация астроцитов вызывает «переключение» их функциональной роли, запуская процессы, направленные на структурные перестройки в ткани мозга. Морфофункциональные изменения астроглии при нарушении дофаминергической передачи, очевидно, влияют на обмен медиаторов дофамина и глутамата и их взаимодействие в хвостатом ядре.

Проведенное исследование показало, что длительное введение резерпина и галоперидола снижает синтез дофамина в нигростриатной системе, о чем можно судить по показателю удельной активности ТирГд, и вызывает структурно-функциональные изменения дофаминергических нейронов черной субстанции. При этом реакция астроглии хвостатого ядра проявляет свои особенности в зависимости от используемой модели дисфункции дофамина. Так, истощение везикулярного пула дофамина в хвостатом ядре под действием резерпина вызывает реактивные изменения астроглии и сопровождается изменениями активности ферментов медиаторного обмена, связанных с астроцитами, - ГлнСин и МАО Б. В то же время блокада D2-рецепторов галоперидолом не влияет на астроциты хвостатого ядра, но увеличивает плотность распределения других видов глии.

Таким образом, длительная гипофункция дофаминовой системы приводит к изменениям морфологических и нейрохимических показателей, отражающих взаимодействие нейронов и нейроглии в хвостатом ядре, соотношение между разными типами глии и их участие в обмене нейромедиаторов. Изменение нейроглиальных взаимодействий в стриатуме, приводящее к дисбалансу нейромедиаторных систем, может вносить вклад в развитие дисфункции базальных ядер при ряде заболеваний человека, в том числе болезни Паркинсона.