Черток В.М.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Коцюба А.Е.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Иммунолокализация гемоксигеназы-2 в нейронах сосудодвигательного центра человека при артериальной гипертензии

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(2): 44-48

Просмотров : 27

Загрузок :

Как цитировать

Черток В. М., Коцюба А. Е. Иммунолокализация гемоксигеназы-2 в нейронах сосудодвигательного центра человека при артериальной гипертензии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(2):44-48.

Авторы:

Черток В.М.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Все авторы (2)

В последние годы появляется все больше фактов в пользу того, что монооксид углерода (СО) наряду с другими газотрансмиттерами может играть заметную роль в различных функциях ЦНС [7, 11, 12]. Имеются экспериментальные доказательства участия этого газа в центральной регуляции гемодинамики [10]. Субстрат для эндогенного образования СО - молекула гема, расщепление которой катализируется ферментом гемоксигеназой (НО). В настоящее время установлены три изоформы гемоксигеназы: одна индуцибельная - НО-1 (белок теплового шока HSP32, играющий важную роль в адаптации клеток к действию стрессорных факторов) и две конститутивные - НО-2 и НО-3. В головном мозге выявлена высокая активность НО-2 [12]. Вместе с тем никто не представил материалов по изучению НО-позитивных нейронов в областях мозга, управляющих вазомоторикой при изменениях кровяного давления, что имеет принципиальное значение для выяснения механизмов, лежащих в основе работы нервного центра.

Цель работы - исследование иммунолокализации и количественного распределения НО-позитивных нейронов в ядрах бульбарного отдела сосудодвигательного центра у людей, страдавших артериальной гипертензией (АГ).

Материал и методы

Для исследования использовали материал судебно-медицинских исследований трупов мужчин в возрасте 18-44 лет, погибших от не связанных с повреждением головного мозга механических травм, 8 из которых были практически здоровыми (контрольная группа), а 6 страдали диагностированной при жизни АГ II степени. Не позднее 3-4 ч после смерти из полости черепа извлекали головной мозг, отделяли от него мост и продолговатый мозг, которые фиксировали в течение 4 сут в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 °С. Затем материал погружали в 25% раствор сахарозы на 3 сут, после чего замораживали и хранили в жидком изопентале при –70 °С.

Для иммуногистохимического выявления НО-2 из образцов мозга готовили криостатные срезы толщиной 40 мкм, которые последовательно инкубировали в 1% нормальной сыворотке лошади в течение 1 ч при комнатной температуре, затем с моноклональными антителами мыши против НО-2 («Abcam», Bеликобритания) в разведении 1:1000 при температуре 4 °С в течение 18 ч, после этого с биотинилированными антителами лошади против IgG мыши («Veсtor Labs», США) в разведении 1:100 в течение 2 ч и авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, «Veсtor Labs», США) 1 ч при комнатной температуре. Между инкубациями проводили отмывки препаратов фосфатным буфером. Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, «Vector Labs», США) под контролем микроскопа. Затем срезы промывали, обезвоживали в спиртах по стандартной методике и заключали в полистерол.

Изучали ядра солитарного тракта, дорсальное блуждающего нерва, ретикулярные - латеральное, мелко-, гигантоклеточное, околоцентральное, а также шва задней группы (темное и крупное). В серии из последовательных срезов один окрашивали 0,5% раствором метиленового синего, а следующий за ним использовали для иммуногистохимического выявления НО-позитивных нейронов. При изучении топографии ядер каждый из двух срезов исследовали раздельно в двух микроскопах, в окуляры которых помещали одинаковые сетки с равновеликими квад­ратами. Каждое ядро ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях, после чего его контуры воспроизводили на экране монитора в соответствии с положением ядер относительно координат сетки.

В проекции среза каждого ядра определяли долю, приходящуюся на НО-позитивные нейроны, а также величину среднего значения оптической плотности продукта реакции (ОППР) в иммунопозитивных нейронах каждого ядра в соответствии с опубликованной ранее методикой [3]. Количественную обработку материалов проводили с использованием автоматизированной системы анализа изображений Allegro MC. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных от каждого человека при обработке не менее двенадцати срезов. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты

В местах локализации НО выпадает гранулярный осадок, который в зависимости от интенсивности реакции окрашивает нейроны в различные оттенки коричневого цвета (рис. 1, а-з).

Рисунок 1. Распределение гемоксигеназы-2 в продолговатом мозге человека. а-г - НО-позитивные нейроны с разной оптической плотностью продукта реакции; д - ядро солитарного тракта; е - ретикулярное латеральное ядро; ж - ретикулярное мелкоклеточное ядро; з - ретикулярное гигантоклеточное ядро. Ув. а-г - об. 20х, ок. 10х; д-з - об. 3,4х, ок. 10х.
НО-позитивные нейроны отличаются между собой формой, размерами, плотностью расположения клеток. Большая часть нейронов, экспрессирующих НО, овальной или веретеновидной формы размером от 9 до 30 мкм. Значительно реже встречаются иммунопозитивные клетки звездчатой или треугольной формы средних (40-60 мкм) и крупных (80-100 мкм) размеров.

Изучение образцов контроля показало, что наиболее многочисленную группу НО-позитивные нейроны образуют в проекции ядра солитарного тракта (13,7%) и ретикулярного латерального ядра (11,6%). В этих же ядрах установлены и наиболее высокие значения ОППР (рис. 2, а).

Рисунок 2. Доля НО-позитивных нейронов (в %, светлые столбики) и средний показатель оптической плотности (усл.ед., темные столбики) в исследуемых ядрах контрольной группы (а) и при АГ (б). ЯСТ - ядро солитарного тракта; РЛЯ - ретикулярное латеральное ядро; РМЯ - ретикулярное мелкоклеточное ядро; ДЯБН - дорсальное ядро блуждающего нерва; РГЯ - ретикулярное гигантоклеточное ядро; РОЦЯ - ретикулярное околоцентральное ядро; ТЯШ - темное ядро шва; КЯШ - крупное ядро шва. За 100% принято количество нейронов соответствующих ядер, окрашенных метиленовым синим, в контрольной группе.
Почти в 2 раза ниже доля энзимпозитивных клеток и интенсивность реакции в дорсальном ядре блуждающего нерва, ретикулярном мелкоклеточном. Еще более ограниченное количество клеток (0,5-4,8%) выявляется в ретикулярных гигантоклеточном, околоцентральном, темном и крупном ядрах.

В проекции ядра солитарного тракта и ретикулярного латерального ядра клетки, экспрессирующие НО, представлены в основном мелкими (диаметром 9-18 мкм) нейронами, обладающими интенсивной реакцией, которые располагаются преимущественно на периферии вентральной части ядер (см. рис. 1, д, е). В их ростральной части наряду с мелкими иммунореактивными клетками встречаются компактные группы нейронов треугольной или звездчатой формы диаметром 60-80 мкм с низким или умеренным содержанием продукта реакции. Большая часть НО-позитивных нейронов дорсального ядра блуждающего нерва имеет небольшие размеры и умеренную или высокую активность реакции (см. рис. 2, а). В ретикулярном мелкоклеточном ядре энзимпозитивные нейроны концентрируются в основном в вентральной части, где располагаются клетки средней величины с низкой и умеренной ОППР. Среди них встречаются единичные нейроны, в которых продукт реакции образует более плотные скопления (см. рис. 1, ж). В большей части крупных мультиполярных нейронов ретикулярного гигантоклеточного ядра, а также в средних по размеру нейронах ядер шва активность реакции очень низкая (см. рис. 1, з). В мелких клетках, обычно располагающихся на периферии этих ядер, определяется более интенсивное отложение продукта реакции.

При АГ в исследованных ядрах продолговатого мозга наблюдается уменьшение доли НO-позитивных нейронов и средних значений ОППР (см. рис. 2, б). При этом сокращение количественных показателей в наибольшей степени затрагивает нейроны ростральной части ядра солитарного тракта и ретикулярного латерального ядра. В этих ядрах наблюдается значительное снижение ОППР (на 21,3 и 17,9% соответственно) при умеренном уменьшении доли (на 12,8 и 9,6%) иммунопозитивных нейронов (см. рис. 2, б). В дорсальном ядре блуждающего нерва величина показателей хотя и снижается, но по сравнению с чувствительными ядрами незначительно: ОППР уменьшается на 13,3%, а содержание НО-позитивных нейронов - на 0,4%. В ядрах шва и ретикулярном мелкоклеточном ядре наблюдается весьма умеренное сокращение средних значений интенсивности реакции в НО-позитивных нейронах и доли этих клеток. В ретикулярных гигантоклеточном и околоцентральном ядрах по сравнению с другими отмечено минимальное снижение обоих показателей (см. рис. 2, б). Заметим, что во всех ядрах изменения затрагивают в первую очередь небольшие клетки округлой формы с высокой или умеренной плотностью отложения продукта реакции. Уровень значений интенсивности реакции в крупных полигональных клетках, а также количество этих нейронов при АГ не выходят за рамки статистической погрешности расчетов.

Обсуждение

Проведенное исследование показало наличие морфологического субстрата для участия СО в центральных механизмах регуляции кровотока. В исследованных ядрах продолговатого мозга, имеющих отношение к бульбарному отделу сердечно-сосудистого центра, постоянно определяются клетки, экспрессирующие НО. Их количество варьирует в различных ядрах от 0,5 до 14%, но во всех случаях концентрация таких нейронов в чувствительных ядрах в 3-5 раз выше, чем в двигательных. В ядре одиночного пути выявляется самая многочисленная популяция НО-позитивных клеток. В нем же установлены и наиболее высокие значения ОППР, что свидетельствует о большой значимости СО в обеспечении функций этого ядра.

Экспериментальных доказательств участия СО в регуляции вазомоторики немного. Недавно появилось сообщение, что унилатеральная микроинъекция гемина в область ядра одиночного тракта приводит к освобождению СО и сопровождается значительным снижением кровяного давления и частоты сердечных сокращений [10]. Эти эффекты не проявляются при предварительном введении Zn-протопорфирина IX - ингибитора НО. Исследование клеточных механизмов регуляции активности НО показало, что синтез СО увеличивается в ответ на повышение цитозольной концентрации кальция, активацию протеинкиназы С и тирозинкиназ [7]. В ЦНС в этом процессе задействованы метаботропные глутаматные рецепторы I типа [8, 9]. Метаботропные рецепторы, активированные в ядре одиночного тракта, способны регулировать проведение нервного импульса через специфические цГМФ-зависимые механизмы к нейронам тех ядер, которые в свою очередь обеспечивают эфферентные влияния на сердце и кровеносные сосуды. В этом случае CO выступает в качестве модулятора, усиливающего спонтанную или вызванную секрецию ацетилхолина, серотонина или некоторых других медиаторов и гормонов [2, 11, 15].

В двигательных ядрах мишенью для модулирующих воздействий могут быть не только выявленные крупные энзимпозитивные клетки, но и небольшие нейроны, отличающиеся интенсивной ферментативной реакцией, которые обычно располагаются на периферии этих ядер или между крупными нейронами и помимо НО содержат нитроксидсинтазу и цистатионин β-синтазу [4, 6].

Как известно, аксоны крупных клеток ядер шва и ретикулярного гигантоклеточного ядра участвуют в формировании нисходящих систем продолговатого мозга - рафе- и ретикулоспинального путей. В этих системах особая роль принадлежит серотонину - нейротрансмиттеру с широким спектром действия. Однако в области указанных ядер находится не только большее количество серотонинергических нейронов [1, 5], но и, как показало проведенное исследование, НО-позитивные клетки. Вполне вероятно, что модулирующее влияние нейронов, аккумулирующих СО, передается на серотонинергические нейроны ядер шва и двигательных ядер ретикулярной формации. Далее сигнальная трансдукция осуществляется посредством нисходящих проводящих путей, приводя к активации преганглионарных симпатических нейронов промежуточно-латерального ядра спинного мозга и провоцируя изменение кровяного давления. При АГ во всех ядрах было отмечено снижение доли НО-позитивных клеток и содержания в них фермента, в большей степени затрагивающее нейроны чувствительных ядер, а также, очевидно, дорсального ядра блуждающего нерва и некоторых ретикулярных.

В ядре одиночного пути, являющегося областью вторичных афферентных нейронов барорецепторной дуги, наблюдается наиболее выраженное изменение содержания НО, что может быть связано с серьезными нарушениями механизмов синтеза СO при АГ в афферентном звене рефлекторной дуги. При АГ в этом ядре снижается содержание и другого газотрансмиттера - оксида азота, который в физиологических условиях, облегчая процессы передачи сенсорной информации внутри ядра, усиливает барорецепторное торможение симпатической вазомоторной активности, способствуя поддержанию адекватного уровня кровяного давления [4, 13, 16]. В ядре одиночного пути происходит переключение нервного импульса с афферентных нервов, идущих от дуги аорты, на эфферентные нейроны ретикулярных ядер. Не случайно при его разрушении развивается тяжелая гипертензия [14].

Подавление активности ферментных систем, наблюдающееся при АГ, приводит не только к сокращению синтеза оксида азота и CO, но и последующему снижению концентрации растворимой гуанилатциклазы, которую они активируют, и цГМФ, обеспечивающего один из главных физиологических эффектов газотрансмиттеров - расслабление сосудистой стенки [8, 12]. Однако СО является слабым активатором растворимой гуанилатциклазы: in vitro он активирует гуанилатциклазу в 30 раз слабее, чем оксид азота. В отличие от последнего, являющегося сильным, но короткоживущим стимулятором гуанилатциклазы, CO за счет своей химической стабильности может оказывать хотя и слабые, но долговременные эффекты [9, 11, 15]. Снижение синтеза оксида азота, а затем и СО в нейронах сосудодвигательного центра поддерживает длительно текущую гиперактивацию симпатической нервной системы, провоцируя ремоделирование сосудистой стенки и закрепление АГ.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (Госконтракт 4.740.11.0186).

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail