В конце 80-х годов прошлого века была выдвинута глутаматергическая нейрохимическая гипотеза патогенеза болезни Альцгеймера (БА) [13]. Основой для нее послужили данные о существенном нарушении глутаматергических нейромедиаторных путей при БА. Методом 1Н-МРТ в мозге больных БА были обнаружены достоверные отклонения от нормальных значений концентрации глутамина и глутамата [16]. Поскольку эти концентрации определяются соотношением интенсивности протекания процессов ферментативного синтеза/утилизации глутамата (в том числе в глутамин/глутаматном цикле), причинами обнаруженных отклонений могут являться изменения количества ферментов, метаболизирующих глутамат [1, 10]. Так, имеются данные о роли глутаминсинтетазы при БА [27], есть сведения и о глутаминазе, но они разрознены, противоречивы и трудно сопоставимы из-за того, что исследования проведены на разных структурах мозга [5, 14]. Вместе с тем изучение глутаминазы (активируемая фосфатом глутаминаза - ФАГ) в мозге при БА представляет интерес в связи с недавним открытием ее разнообразных функций, напрямую не связанных с глутамин/глутаматным циклом [4, 6, 7, 9, 12, 24, 25, 28].

В настоящей работе иммунохимические сравнительные исследования концентрации ФАГ при БА проведены на образцах мозжечка, который ранее не изучался и был выбран в качестве объекта также потому, что в этой структуре уровень иммунореактивного белка ФАГ в мозге человека в норме был охарактеризован как «существенный» [28] и сравнимый с таковым в лобной коре, изучению которой при БА были посвящены наши предыдущие работы [2, 10].

Цель исследования - изучение содержания глутаминазы в мозжечке при БА на аутопсийном материале.

Исследование проведено на образцах коры мозжечка из коллекции аутопсийного мозга, собранной и хранящейся при –80 °С в лаборатории нейрохимии Научного центра психического здоровья РАМН. Было исследовано по 13 случаев БА и контрольных образцов. Эти группы не различались по постмортальному интервалу (4-6 ч) и возрасту. В контрольной группе возраст колебался от 52 лет до 81 года (медиана 70 лет), в группе БА - в диапазоне от 57 до 83 лет (медиана 72 года). Обе группы были уравнены по полу (8 женщин и 5 мужчин в каждой).

Образцы ткани (50 мг) гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (стекло/тефлон) в 1 мл 50 мM TRIS-HCl буфера, pH 7,0, с добавлением 0,35 М сахарозы и коктейля ингибиторов протеаз Sigma P8340-5 ml, с последующим центрифугированием при 1000 g и удалением осадка, содержащего ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток. В полученные супернатанты (уравненные по концентрации белка) добавляли 10% раствор ДС-Na (10% объема) и β-меркаптоэтанол (10% объема), образцы нагревали на кипящей водяной бане 5 мин и проводили одномерный электрофорез в ПАГ по Лэммли и последующий Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала с использованием поликлональных кроличьих антител к С-концевому пептидному фрагменту ФАГ (ПочГ) крысы в разведении 1:20 000 (антитела предоставлены Prof. O.P. Ottersen, Dr. I.A. Torgner, Норвегия), как описано в работе [3]. Количество иммунореактивной ФАГ оценивали в условных единицах (усл. ед.) после количественной обработки изображений, полученных при Вестерн-иммуноблоттинге.

При статистической обработке данных использовали программу Statistica 6.0 («Statsoft»), модуль - непарамет­рический анализ.

На рисунке представлены результаты определения относительного количества иммунореактивной ФАГ в образцах мозжечка больных БА и контрольной группы.

Хотя в целом по всей выборке наблюдалась тенденция корреляции ФАГ с постмортальным интервалом (чем он длительнее, тем меньше иммунореактивной ФАГ), эта связь не была статистически достоверной (p=0,083), при этом не было достоверных различий в величине указанного интервала и между сравниваемыми группами (p=0,60).

Согласно общепринятому взгляду на локализацию и функцию глутаминазы в мозге, она локализована в нейронах и участвует в биосинтезе нейромедиаторного глутамата, т.е. задействована в шаттле глутамата/глутамина, который связан с его нейронно-глиальным циклом [1, 4, 6, 7].

Группой исследователей [19-21, 30] были описаны два пула ФАГ в мозге (оба локализованы в митохондриях): основной пул ассоциирован с мембранами, малый пул представлен легкорастворимой ФАГ [20, 30]. Этими же исследователями были введены понятия о двух «типах», или изоформах, глутаминаз: почечной (ПочГ), которая сходна с мозговой формой фермента, и печеночной (ПечГ). Что касается мозговой ткани, они признают существование в ней разных форм глутаминаз, но рассмат­ривают в основном митохондриальную активируемую фосфатом глутаминазу (ФАГ) [19]. Позднее они же [21] в опытах на культивируемых астроцитах и клетках нейробластомы обнаружили, что в нервной ткани существуют и другие (астроцитарные) изоформы ФАГ, отличающиеся от ПочГ и ПечГ изоформ (слабо узнаваемые антителами к ПочГ и ПечГ, но выявляемые по ферментативной активности). Описанные наблюдения расширили и изменили ранние представления о ФАГ как об исключительно нейрональном ферменте, а перекрестная реакция антител, полученных к крысиному антигену (С-концевой фрагмент ПочГ крысы) и узнающих ФАГ в мозге крысы, с антигеном человека (ФАГ мозга человека) позволила авторам провести сравнительные исследования уровня ФАГ в образцах мозга человека. Так, при иммунохимическом сравнении количества ФАГ в коре мозга больных с синдромом Дауна и контрольных случаев было обнаружено достоверное (p<0,001) снижение количества иммунореактивной ФАГ у больных по сравнению с контролем. В недавней работе C. Shimmura и соавт. [32] было описано достоверное снижение количества иммунореактивного белка ПочГ - ФАГ в задней лимбической коре мозга больных аутизмом.

Опубликованные исследования ФАГ при БА малочисленны, а их результаты противоречивы. Так, в ранней статье японских авторов H. Akiyama и соавт. [5] описано достоверное снижение числа ФАГ-позитивных пирамидальных нейронов в коре мозга больных БА (3 случая) по сравнению с контролем, однако другие авторы [14] не нашли достоверных различий в количестве ФАГ, исследовав по 8 случаев БА и контрольных образцов коры мозга (височная, теменная, фронтальная и зрительная). При сравнительном протеомном анализе выделенных и очищенных митохондрий из височной доли мозга 3 больных БА на ранней, 3 - на поздней стадиях заболевания и 3 пациентов с мягким когнитивным снижением методом двухмерной жидкостной хроматографии, сопряженной с тандемной масс-спектрометрией, было обнаружено небольшое повышение количества 21 митохондриального белка, в том числе ПочГ [23].

В настоящей работе мы использовали антитела к С-концевому фрагменту ПочГ для определения количества иммунореактивной ФАГ в ткани мозжечка человека в норме и при БА. Предварительно отделив ядерную фракцию (она содержит ПечГ, которая теоретически могла давать слабую перекрестную реакцию с антителами, использованными нами в работе), мы использовали способ экстракции, позволяющий практически полностью извлечь ФАГ из клеточных компартментов, включая митохондрии.

Хотя в нашем наблюдении в целом общее количество ФАГ при БА в мозжечке по сравнению с контрольной группой достоверно снижалось, не во всех случаях оно было ниже, чем в контроле (на рисунке видна область перекрытия).

Возможно, в перечисленных выше работах, посвященных ФАГ при БА, различий между группами БА и контроля не было отмечено, либо авторы отмечали даже повышение количества ФАГ при БА из-за малого числа случаев или попадания их всех в область перекрытия.

Ранее мы (с использованием тех же антител, что и в настоящей работе) исследовали различные фракции ткани префронтальной коры при БА, а в настоящей работе уровень глутаминазы впервые был оценен в мозжечке при БА.

Предположим, что изменения количества ФАГ происходят сходным образом в разных областях мозга человека (хотя, возможно, степень этих изменений различна в разных его структурах), и сведем воедино наблюдения, сделанные нами при исследовании ткани префронтальной коры [10] и мозжечка при БА. Повышение количества иммунореактивной ПочГ в ассоциированной с мембранами белковой фракции [10] и снижение общей ее концентрации, обнаруженное в настоящей работе, могут свидетельствовать о перераспределении фермента при БА между двумя пулами (митохондриальные мембраны и матрикс) или усилении его ассоциации с мембранами. Этот вопрос, возможно, будет решен в дальнейшем путем раздельного изучения фракции легкорастворимых и ассоциированных с мембранами белков.

Отметим, что мозжечок и префронтальная кора - это структуры мозга, подвергшиеся существенным эволюционным изменениям у человека по сравнению с другими приматами [35]. В последние десятилетия прогресс молекулярно-биологических исследований и достижения в области нейровизуализации позволили заключить, что эволюция мозжечка сопровождалась приобретением значительно большего числа функций, чем предполагалось ранее на основании исследований постмортального мозга человека и экспериментов на животных. Эти новые функции (контроль внимания, другие когнитивные функции, эмоции, настроение, социальное поведение) ранее было принято считать исключительно корковыми [31, 34]. Мозжечок имеет анатомические и функциональные связи с префронтальной корой, а также подкорковыми лимбическими структурами и ядрами ствола мозга, в настоящее время признана его роль в развитии нервных и психических заболеваний [8, 18, 26, 35], включая БА [11].

Еще в 80-х годах прошлого века был представлен ряд экспериментальных нейрохимических свидетельств того, что глутамат играет ведущую нейромедиаторную роль в мозжечке [17, 22]. ФАГ - центральный синтезирующий глутамат фермент - обнаружен в высокой концентрации в окончаниях мшистых волокон мозжечка [15]. Также экспериментально определена высокая глутаминазная активность в терминалях параллельных волокон мозжечка, хотя и неясно, какой тип глутаминазы (ПочГ, ПечГ или еще не известный тип глутаминазы) отвечает за это [15].

Протеомные исследования показали, что глутаминаза - мультифункциональный фермент, изоформы которого кодируются генами GLS, участвует в регуляции азотного метаболизма, энергетическом метаболизме, регенерации глутамата, и, кроме того, регуляции потоков кальция и других ионных каналов, проведении сигналов Akt и ретинола, контроле функций элементов цитоскелета, АТФаз, синтезе белка, системе протеасом, метаболизме нуклеиновых кислот и липидов, хангтинтина, факторов трансформации, организации клеточных ансамблей и проведении внутриклеточных сигналов, клеточном цикле; более того, гены GLS играют критическую роль в созревании нервных клеток [9, 29, 33].

Учитывая множественность функций глутаминазы, можно предположить, что изменение ее общей концентрации, обнаруженное в мозжечке у больных БА, приводит к нарушению не только метаболизма глутамата [1], но и других многочисленных путей, в которых она участвует, вызывая критические последствия, приводящие к нейродегенерации.

Наряду с ПочГ, количество которой мы определяли в представленной работе, представляет интерес также изучение других изоформ ФАГ, например ПечГ в мозге при БА, что составит предмет дальнейших исследований.