Бурбаева Г.Ш.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Бокша И.С.

Терешкина Е.Б.

Стародубцева Л.И.

Савушкина О.К.

Воробьева Е.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России, Москва, Россия

Прохорова Т.А.

Глутаминаза в мозжечке при болезни Альцгеймера (исследование аутопсийного материала)

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(12): 71-75

Просмотров : 3

Загрузок :

Как цитировать

Бурбаева Г. Ш., Бокша И. С., Терешкина Е. Б., Стародубцева Л. И., Савушкина О. К., Воробьева Е. А., Прохорова Т. А. Глутаминаза в мозжечке при болезни Альцгеймера (исследование аутопсийного материала). Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(12):71-75.

Авторы:

Бурбаева Г.Ш.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Все авторы (7)

В конце 80-х годов прошлого века была выдвинута глутаматергическая нейрохимическая гипотеза патогенеза болезни Альцгеймера (БА) [13]. Основой для нее послужили данные о существенном нарушении глутаматергических нейромедиаторных путей при БА. Методом 1Н-МРТ в мозге больных БА были обнаружены достоверные отклонения от нормальных значений концентрации глутамина и глутамата [16]. Поскольку эти концентрации определяются соотношением интенсивности протекания процессов ферментативного синтеза/утилизации глутамата (в том числе в глутамин/глутаматном цикле), причинами обнаруженных отклонений могут являться изменения количества ферментов, метаболизирующих глутамат [1, 10]. Так, имеются данные о роли глутаминсинтетазы при БА [27], есть сведения и о глутаминазе, но они разрознены, противоречивы и трудно сопоставимы из-за того, что исследования проведены на разных структурах мозга [5, 14]. Вместе с тем изучение глутаминазы (активируемая фосфатом глутаминаза - ФАГ) в мозге при БА представляет интерес в связи с недавним открытием ее разнообразных функций, напрямую не связанных с глутамин/глутаматным циклом [4, 6, 7, 9, 12, 24, 25, 28].

В настоящей работе иммунохимические сравнительные исследования концентрации ФАГ при БА проведены на образцах мозжечка, который ранее не изучался и был выбран в качестве объекта также потому, что в этой структуре уровень иммунореактивного белка ФАГ в мозге человека в норме был охарактеризован как «существенный» [28] и сравнимый с таковым в лобной коре, изучению которой при БА были посвящены наши предыдущие работы [2, 10].

Цель исследования - изучение содержания глутаминазы в мозжечке при БА на аутопсийном материале.

Материал и методы

Исследование проведено на образцах коры мозжечка из коллекции аутопсийного мозга, собранной и хранящейся при –80 °С в лаборатории нейрохимии Научного центра психического здоровья РАМН. Было исследовано по 13 случаев БА и контрольных образцов. Эти группы не различались по постмортальному интервалу (4-6 ч) и возрасту. В контрольной группе возраст колебался от 52 лет до 81 года (медиана 70 лет), в группе БА - в диапазоне от 57 до 83 лет (медиана 72 года). Обе группы были уравнены по полу (8 женщин и 5 мужчин в каждой).

Образцы ткани (50 мг) гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (стекло/тефлон) в 1 мл 50 мM TRIS-HCl буфера, pH 7,0, с добавлением 0,35 М сахарозы и коктейля ингибиторов протеаз Sigma P8340-5 ml, с последующим центрифугированием при 1000 g и удалением осадка, содержащего ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток. В полученные супернатанты (уравненные по концентрации белка) добавляли 10% раствор ДС-Na (10% объема) и β-меркаптоэтанол (10% объема), образцы нагревали на кипящей водяной бане 5 мин и проводили одномерный электрофорез в ПАГ по Лэммли и последующий Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала с использованием поликлональных кроличьих антител к С-концевому пептидному фрагменту ФАГ (ПочГ) крысы в разведении 1:20 000 (антитела предоставлены Prof. O.P. Ottersen, Dr. I.A. Torgner, Норвегия), как описано в работе [3]. Количество иммунореактивной ФАГ оценивали в условных единицах (усл. ед.) после количественной обработки изображений, полученных при Вестерн-иммуноблоттинге.

При статистической обработке данных использовали программу Statistica 6.0 («Statsoft»), модуль - непарамет­рический анализ.

Результаты

На рисунке представлены результаты определения относительного количества иммунореактивной ФАГ в образцах мозжечка больных БА и контрольной группы.

Рисунок 1. Результаты определения относительного количества иммунореактивной ФАГ (в усл. ед.) в образцах коры мозжечка больных БА и контрольной группы.
Из него видно, что большинство образцов от больных БА содержит меньшее количество фермента, чем контрольные образцы. Хотя медианы по группам мало различаются (21 усл. ед. при БА и 28 - в контроле), U-тест Манна-Уитни показал достоверное различие в количестве ФАГ между группой БА и контролем (суммы рангов равны 119,5 и 231,5 соответственно, U=28,5, Z= –2,87, p=0,004). Поскольку изученные группы были уравнены по возрасту, постмортальному интервалу и полу, то различия между ними в количестве ФАГ, вероятно, обусловлены свойственным БА патологическим процессом в мозговой ткани. По количеству ФАГ мужчины (16) от женщин (10) не отличались (U-тест Манна-Уитни показал суммы рангов 208,5 и 142,5, U=72,5, Z= –0,40, p=0,70).

Хотя в целом по всей выборке наблюдалась тенденция корреляции ФАГ с постмортальным интервалом (чем он длительнее, тем меньше иммунореактивной ФАГ), эта связь не была статистически достоверной (p=0,083), при этом не было достоверных различий в величине указанного интервала и между сравниваемыми группами (p=0,60).

Обсуждение

Согласно общепринятому взгляду на локализацию и функцию глутаминазы в мозге, она локализована в нейронах и участвует в биосинтезе нейромедиаторного глутамата, т.е. задействована в шаттле глутамата/глутамина, который связан с его нейронно-глиальным циклом [1, 4, 6, 7].

Группой исследователей [19-21, 30] были описаны два пула ФАГ в мозге (оба локализованы в митохондриях): основной пул ассоциирован с мембранами, малый пул представлен легкорастворимой ФАГ [20, 30]. Этими же исследователями были введены понятия о двух «типах», или изоформах, глутаминаз: почечной (ПочГ), которая сходна с мозговой формой фермента, и печеночной (ПечГ). Что касается мозговой ткани, они признают существование в ней разных форм глутаминаз, но рассмат­ривают в основном митохондриальную активируемую фосфатом глутаминазу (ФАГ) [19]. Позднее они же [21] в опытах на культивируемых астроцитах и клетках нейробластомы обнаружили, что в нервной ткани существуют и другие (астроцитарные) изоформы ФАГ, отличающиеся от ПочГ и ПечГ изоформ (слабо узнаваемые антителами к ПочГ и ПечГ, но выявляемые по ферментативной активности). Описанные наблюдения расширили и изменили ранние представления о ФАГ как об исключительно нейрональном ферменте, а перекрестная реакция антител, полученных к крысиному антигену (С-концевой фрагмент ПочГ крысы) и узнающих ФАГ в мозге крысы, с антигеном человека (ФАГ мозга человека) позволила авторам провести сравнительные исследования уровня ФАГ в образцах мозга человека. Так, при иммунохимическом сравнении количества ФАГ в коре мозга больных с синдромом Дауна и контрольных случаев было обнаружено достоверное (p<0,001) снижение количества иммунореактивной ФАГ у больных по сравнению с контролем. В недавней работе C. Shimmura и соавт. [32] было описано достоверное снижение количества иммунореактивного белка ПочГ - ФАГ в задней лимбической коре мозга больных аутизмом.

Опубликованные исследования ФАГ при БА малочисленны, а их результаты противоречивы. Так, в ранней статье японских авторов H. Akiyama и соавт. [5] описано достоверное снижение числа ФАГ-позитивных пирамидальных нейронов в коре мозга больных БА (3 случая) по сравнению с контролем, однако другие авторы [14] не нашли достоверных различий в количестве ФАГ, исследовав по 8 случаев БА и контрольных образцов коры мозга (височная, теменная, фронтальная и зрительная). При сравнительном протеомном анализе выделенных и очищенных митохондрий из височной доли мозга 3 больных БА на ранней, 3 - на поздней стадиях заболевания и 3 пациентов с мягким когнитивным снижением методом двухмерной жидкостной хроматографии, сопряженной с тандемной масс-спектрометрией, было обнаружено небольшое повышение количества 21 митохондриального белка, в том числе ПочГ [23].

В настоящей работе мы использовали антитела к С-концевому фрагменту ПочГ для определения количества иммунореактивной ФАГ в ткани мозжечка человека в норме и при БА. Предварительно отделив ядерную фракцию (она содержит ПечГ, которая теоретически могла давать слабую перекрестную реакцию с антителами, использованными нами в работе), мы использовали способ экстракции, позволяющий практически полностью извлечь ФАГ из клеточных компартментов, включая митохондрии.

Хотя в нашем наблюдении в целом общее количество ФАГ при БА в мозжечке по сравнению с контрольной группой достоверно снижалось, не во всех случаях оно было ниже, чем в контроле (на рисунке видна область перекрытия).

Возможно, в перечисленных выше работах, посвященных ФАГ при БА, различий между группами БА и контроля не было отмечено, либо авторы отмечали даже повышение количества ФАГ при БА из-за малого числа случаев или попадания их всех в область перекрытия.

Ранее мы (с использованием тех же антител, что и в настоящей работе) исследовали различные фракции ткани префронтальной коры при БА, а в настоящей работе уровень глутаминазы впервые был оценен в мозжечке при БА.

Предположим, что изменения количества ФАГ происходят сходным образом в разных областях мозга человека (хотя, возможно, степень этих изменений различна в разных его структурах), и сведем воедино наблюдения, сделанные нами при исследовании ткани префронтальной коры [10] и мозжечка при БА. Повышение количества иммунореактивной ПочГ в ассоциированной с мембранами белковой фракции [10] и снижение общей ее концентрации, обнаруженное в настоящей работе, могут свидетельствовать о перераспределении фермента при БА между двумя пулами (митохондриальные мембраны и матрикс) или усилении его ассоциации с мембранами. Этот вопрос, возможно, будет решен в дальнейшем путем раздельного изучения фракции легкорастворимых и ассоциированных с мембранами белков.

Отметим, что мозжечок и префронтальная кора - это структуры мозга, подвергшиеся существенным эволюционным изменениям у человека по сравнению с другими приматами [35]. В последние десятилетия прогресс молекулярно-биологических исследований и достижения в области нейровизуализации позволили заключить, что эволюция мозжечка сопровождалась приобретением значительно большего числа функций, чем предполагалось ранее на основании исследований постмортального мозга человека и экспериментов на животных. Эти новые функции (контроль внимания, другие когнитивные функции, эмоции, настроение, социальное поведение) ранее было принято считать исключительно корковыми [31, 34]. Мозжечок имеет анатомические и функциональные связи с префронтальной корой, а также подкорковыми лимбическими структурами и ядрами ствола мозга, в настоящее время признана его роль в развитии нервных и психических заболеваний [8, 18, 26, 35], включая БА [11].

Еще в 80-х годах прошлого века был представлен ряд экспериментальных нейрохимических свидетельств того, что глутамат играет ведущую нейромедиаторную роль в мозжечке [17, 22]. ФАГ - центральный синтезирующий глутамат фермент - обнаружен в высокой концентрации в окончаниях мшистых волокон мозжечка [15]. Также экспериментально определена высокая глутаминазная активность в терминалях параллельных волокон мозжечка, хотя и неясно, какой тип глутаминазы (ПочГ, ПечГ или еще не известный тип глутаминазы) отвечает за это [15].

Протеомные исследования показали, что глутаминаза - мультифункциональный фермент, изоформы которого кодируются генами GLS, участвует в регуляции азотного метаболизма, энергетическом метаболизме, регенерации глутамата, и, кроме того, регуляции потоков кальция и других ионных каналов, проведении сигналов Akt и ретинола, контроле функций элементов цитоскелета, АТФаз, синтезе белка, системе протеасом, метаболизме нуклеиновых кислот и липидов, хангтинтина, факторов трансформации, организации клеточных ансамблей и проведении внутриклеточных сигналов, клеточном цикле; более того, гены GLS играют критическую роль в созревании нервных клеток [9, 29, 33].

Учитывая множественность функций глутаминазы, можно предположить, что изменение ее общей концентрации, обнаруженное в мозжечке у больных БА, приводит к нарушению не только метаболизма глутамата [1], но и других многочисленных путей, в которых она участвует, вызывая критические последствия, приводящие к нейродегенерации.

Наряду с ПочГ, количество которой мы определяли в представленной работе, представляет интерес также изучение других изоформ ФАГ, например ПечГ в мозге при БА, что составит предмет дальнейших исследований.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail