Нарушения когнитивного функционирования рассматриваются в качестве одного из наиболее значимых проявлений шизофрении, в патогенезе которой генетические факторы играют ведущую роль. Поэтому поиск генов, связанных с выраженностью нейрокогнитивного дефицита у больных шизофренией, представляет значительный интерес. За последнее время в этой области достигнуты значительные успехи. Обнаружена ассоциация между полиморфными участками (полиморфизмами) в нескольких генах и когнитивными показателями, которые оценивали с помощью разных подходов, в частности по изменениям электрической активности мозга (вызванные потенциалы) и эффективности выполнения нейрокогнитивных задач [3]. Однако обнаруженная ассоциация не всегда подтверждалась в повторных исследованиях, что указывает на возможную опосредующую роль других факторов. К ним можно отнести эмоциональные особенности испытуемого. Эмоции, особенно негативные, оказывают влияние на базовые когнитивные процессы, однако в молекулярно-генетических исследованиях когнитивных процессов их роль, как правило, не учитывается. Нам известна лишь одна работа [6], в которой исследовали опосредующую роль эмоциональных особенностей в ассоциации между молекулярно-генетическим маркером и когнитивным функционированием. В этой работе изучали связь между полиморфизмом 5-HTTLPR гена переносчика серотонина и параметрами слуховых вызванных потенциалов у психически здоровых людей. При этом оценивали личностные особенности испытуемого, связанные с негативной эмоциональностью, в частности выраженность невротизма, который измеряли с помощью личностного опросника NEO-PI.

Цель настоящего исследования - изучение модулирующего влияния негативной эмоциональности на связь между полиморфизмом гена мозгового нейротрофического фактора - BDNF (от англ. brain-derived neurotrophic factor) и показателями произвольного внимания при шизофрении.

Когнитивные функции исследовали с помощью нейрофизиологического метода (слуховых вызванных потенциалов) и нейропсихологического тестирования.

В качестве признака, связанного с негативной эмоциональностью, была выбрана личностная тревожность. Выбор гена BDNF обусловлен тем, что он играет важную роль в нейрогенезе, поскольку связан c пролиферацией, дифференциацией и выживанием нейронов, а также участвует в регуляции высвобождения нейротрансмиттеров из синаптической щели.

Было обнаружено снижение экспрессии м-РНК гена BDNF и количества белкового продукта в префронтальной коре мозга больных шизофренией, следствием чего может быть нарушение трофического обеспечения, необходимого для нормального функционирования соответствующих нейронов в этой критической для развития шизофрении области мозга [19]. Оценка уровня BDNF в плазме крови больных шизофренией также показала его снижение по сравнению с данными для контрольной группы [11]. Ген, кодирующий BDNF, локализован на хромосомном участке 11р13. Полная открытая рамка считывания находится в последнем экзоне и кодирует два белковых варианта, образующихся за счет альтернативного сплайсинга. Один из них содержит про-домен, кодируемый 5'-последовательностью, обозначаемой pro-BDNF. В структуре этой последовательности обнаружен участок, в котором гуанин может быть заменен на аденин (G/A), что приводит к замещению аминокислот в соответствующем белке: валин замещается метионином в кодоне 66. В соответствии с этим однонуклеотидный полиморфизм обозначают Val66Met. Предполагается, что указанный полиморфизм связан с изменениями внутриклеточного транспорта и упаковки pro-BDNF, что в конечном итоге оказывает влияние на регуляцию секреции белка. В частности, в случае аллеля Met обнаружено снижение секреции BDNF в культурах нейронов гиппокампа. Аллель Met оказывает влияние на внутриклеточное распределение BDNF и его зависимую от деполяризации секрецию [5]. На уровне морфологии мозга у психически здоровых людей и больных шизофренией с генотипами, содержащими аллель Met, обнаружено уменьшение объемов дорсолатеральной префронтальной коры и гиппокампа [18], а также снижение количества серого вещества при соответствующем увеличении объема боковых желудочков мозга [13]. Исследования, посвященные поиску связи между полиморфизмом Val66Met и нейрокогнитивными признаками, в том числе и у больных шизофренией, показали, что носители аллеля Met демонстрировали худшие когнитивные показатели (эпизодическая вербальная память, зрительно-пространственные функции) [1, 14]. C. Beste и соавт. [4] обнаружили у здоровых студентов влияние полиморфизма Val66Met на зрительную иконическую (сенсорную) память с лучшими результатами в группе ValVal по сравнению с носителями минорного аллеля, что свидетельствует о вовлеченности гена в процессы предвнимания в зрительной сфере. Некоторые исследователи [15] связывают этот ген с психической скоростью (скоростью обработки информации). Гомозиготы ValVal, по-видимому, имеют преимущество и при выполнении более сложных когнитивных задач, в частности затрагивающих оперативную (рабочую) память [10]. В то же время полиморфизм Val66Met ассоциирован с тревожностью, негативной эмоциональностью, депрессией. Например, показано, что генотип ValVal в сочетании со стрессом в раннем возрасте является предиктором увеличения серого вещества миндалины и медиальных отделов префронтальной коры, которое в свою очередь связано с учащением сердечного ритма, вызванного испугом и повышенной тревожностью [9].

Таким образом, выбранный ген BDNF, как и изученный ранее ген переносчика серотонина, связан не только с когнитивными функциями, но и с негативной эмоциональностью, что вполне оправдывает его включение в настоящее исследование.

В исследование были включены 90 больных шизофренией и шизоаффективным психозом, 48 женщин и 42 мужчины, средний возраст которых был 29,7±11,3 года, возраст к началу заболевания - 23,5±6,9 года. Все больные находились на лечении в клинических отделениях Научного центра психического здоровья РАМН.

В соответствии с диагностическими критериями МКБ-10 диагноз шизофрении (F20) был поставлен 71 больному, диагноз шизоаффективное расстройство (F25) - 19 больным. Выраженность позитивных, негативных и общих психопатологических симптомов оценивали с помощью шкалы PANSS.

Все больные на момент обследования принимали различные психотропные препараты. От каждого больного было получено информированное согласие на участие во всех видах обследований.

Регистрация слуховых вызванных потенциалов (СВП) проводилась в стандартной парадигме oddball с вероятностью предъявления целевого стимула (тон, частота 2 кГц, интенсивность 60 дБ) - 0,2 и нецелевого (тон, частота 1 кГц, интенсивность 60 дБ) - 0,8. Общее число целевых стимулов составляло 30, они подавались бинаурально, с частотой 1 раз в 2 с, межстимульный интервал варьировал в диапазоне 20%. СВП регистрировали на системе картирования Brain Atlas (Bio-logic, США). Эпоха анализа составляла 512 мс, включая 60 мс престимульный интервал. Выделялись волны N100, Р200, N200, P300 в 12 отведениях ЭЭГ. Регистрация СВП у больных шизофренией была описана ранее [2].

Психометрическое исследование предусматривало оценку личностной тревожности по опроснику Спилбергера-Ханина. По уровню выраженности тревоги (выше или ниже средних значений, составляющих для московской популяции 42 балла) больные были разделены на 2 группы.

Нейропсихологическое тестирование включало в себя оценку концентрации внимания. Тест предусматривал серийное отсчитывание от 200 по 2 и по 5 до 100. Показатель - количество верно выполненных операций в минуту. Тест на оценку концентрации внимания был проведен у 77 больных.

Молекулярно-генетическое исследование включало в себя отбор венозной крови больных, выделение ДНК и генотипирование с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения полиморфизма Val66Met использовали олигонуклеотидные праймеры со следующей последовательностью: 5'-GAGGCTTGACATCATTGGCT-3'(прямой) и 5'-CGTGTACAAGTCTGCGTCCT-3' (обратный). Реакционная смесь для проведения ПЦР (15 мкл) содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,05 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкмол каждого из праймеров, 10х буфер для Taq-полимеразы. Денатурацию проводили в течение 2 мин при 94 oC, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 15 с; 60 oC - 15 с; 72 oC - 15 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 4 мин. Полученную в результате ПЦР последовательность ДНК длиной 113 пар оснований (п.о.) инкубировали с рестриктазой PcpCI (производитель «Сибэнзим») при 37 °С. Результаты рестрикционного анализа ПЦР-продуктов оценивали разделением полученных фрагментов в 8% поли­акриламидном геле в течение 1 ч. Размер фрагмента, полученного в результате амплификации, составлял 113 п.о. Аллелю А (Met) соответствовал фрагмент длиной 113 п.о., а аллелю G (Val) - фрагменты 78 и 35 п.о.

В связи с низкой частотой гомозигот по аллелю Met (в исследуемой группе был обнаружен только один носитель этого варианта), в дальнейшем сравнивали 2 группы больных: носителей одной или двух копий аллеля Met и носителей генотипа ValVal.

При статистической обработке данных использовали обобщенную линейную модель многомерного ковариационного анализа. При исследовании параметров вызванных потенциалов зависимыми переменными служили амплитуды или латентности каждой из волн во всех отведениях. Межиндивидуальными факторами были генотип (два варианта - ValVal или Met, т.е. генотипы, содержащие 1 или 2 копии этого аллеля) и уровень личностной тревожности (два варианта - высокий или низкий), внутрииндивидуальным фактором - отведение. В качестве ковариат в модель вводили пол, возраст больного и выраженность клинических симптомов по субшкалам PANSS. В модели была предусмотрена оценка взаимодействия независимых факторов. Поскольку в модель вводили внутрииндивидуальные факторы, использовали соответствующую поправку (the Greenhouse-Geisser correction), учитывающую сферичность данных. При обнаружении значимого эффекта какого-либо из факторов осуществляли серию одномерных анализов для каждого из отведений. В случае обнаружения ассоциации проводили апостериорный анализ для определения связи между значимым фактором и параметрами волны. При анализе результатов выполнения теста на внимание в модель включали в качестве зависимой переменной число правильных ответов, а межиндивидуальные факторы и ковариаты были те же, что и в вышеописанной модели для анализа данных нейрофизиологического исследования.

Эффект взаимодействия уровня тревожности и генотипа BDNF выявлен на уровне тенденции (р=0,07) для композитного индекса, включающего амплитуды волны N100 СВП на нецелевой стимул. Значимый эффект генотипа как независимого фактора обнаружен для композитного индекса, включающего амплитуды волны Р300 (р=0,02). Возраст также оказывал значимый эффект на этот показатель (р=0,02). Вклад фактора отведение был значим, что соответствует данным о зависимости амплитуды волны от локализации электрода (р=0,001). Данные, демонстрирующие вклад факторов, используемых в модели, приведены в табл. 1.

Не выявлено значимого эффекта взаимодействия генотипа и уровня тревожности на эффективность выполнения теста, оценивающего внимание. В то же время каждый из этих факторов оказывал независимое влияние: влияние генотипа было значимым (р=0,01), а эффект уровня тревожности наблюдался на уровне тенденции (р=0,09). Возраст и выраженность клинических симптомов не влияли на эффективность выполнения теста. У носителей аллеля Met среднее число правильных ответов было меньше, чем у носителей генотипа ValVal. Самая высокая эффективность выполнения теста отмечена у носителей генотипа ValVal в группе с низким уровнем тревожности (табл. 4).

В целом, полученные результаты указывают на то, что полиморфизм Val66Met гена BDNF связан с эффективностью выполнения задач на внимание при шизофрении. При этом ассоциацию между полиморфизмом гена BDNF и выполнением задачи удалось выявить с использованием различных методов оценки (по регистрации электрической активности головного мозга и с использованием нейро­психологического тестирования). Носители аллеля Met выполняли нейропсихологический тест, оценивающий концентрацию внимания, хуже, чем носители генотипа ValVal. Аналогичные результаты неоднократно отмечены и в других исследованиях, которые проводили как у психически здоровых, так и у больных шизофренией [13, 20]. Также нами обнаружена связь между полиморфизмом гена и параметрами СВП, которые рассматривают в качестве маркеров когнитивных нарушений при шизофрении. Считается, что у больных по сравнению с психически здоровыми имеет место увеличение латентного периода и уменьшение амплитуды ранних и поздних волн. Согласно полученным в настоящей работе результатам, у больных с вариантом «риска» (аллель Met) амплитуда волны Р300 была ниже, чем у носителей генотипа ValVal. Это наблюдение согласуется с результатами выполнения когнитивных тестов, поскольку амплитуда этой волны пропорционально связана с ресурсами внимания, выделенными для выполнения задачи. Нужно отметить, что связь между полиморфизмом Val66Met и параметрами волны Р300 обнаружена ранее у психически здоровых. В работе [17] показано, что в группе носителей аллеля Met латентность этой волны была больше, чем у носителей генотипа ValVal.

В рамках полученных результатов наибольший интерес представляет обнаружение модулирующего влияния эмоциональных особенностей больного, в частности уровня личностной тревожности, на ассоциацию между «аллелем риска» BDNF и амплитудой волны N100 на незначимый стимул. То есть эффект тревожности проявлялся у носителей «аллеля риска» на ранних стадиях выполнения задачи, в частности при обработке незначимых стимулов. Полученные данные можно объяснить в свете имеющихся представлений о том, что амплитуда волны N100 связана с состояниями, обусловливающими высокую активацию коры головного мозга, к которым можно отнести и тревожность. Как показал ряд экспериментальных парадигм, более высокий уровень возбуждения и состояние стресса связаны с большей амплитудой волны N100 [7, 12, 16]. Предположительно, на этой стадии обработки информации испытуемый в наибольшей мере испытывает чувства неопределенности и волнения. В то же время амплитуда волны N100 зависит от мотивационной значимости стимула и коррелирует с количеством приложенных когнитивных усилий [6]. Учитывая это, выявленный эффект тревожности на связь между геном BDNF и амплитудой N100, возможно, отражает тот факт, что лица с высоким уровнем тревожности прилагают больше усилий для того, чтобы решить задачу правильно, при этом эффект «аллеля риска» в виде снижения амплитуды нивелируется. В группе с низким уровнем тревожности на первый план выступают генетические различия. Нужно также отметить, что в упоминавшейся работе [6] выявлена связь между генетическим вариантом переносчика серотонина и амплитудой волны N100 на значимый стимул (параметры волны N100 на незначимый стимул в статье не рассматривались), при этом не обнаружено опосредующего влияния эмоциональных особенностей (невротизма) на амплитуду волны. Аналогично, в настоящей работе мы не обнаружили связи полиморфизма гена BDNF и тревожности с параметрами волны N100 на значимый стимул. Поэтому представляется вероятным, что влияние тревожности проявляется только при обработке незначимых стимулов. В связи с этим полученные результаты можно рассмотреть в рамках теории управления вниманием M. Eysenck и соавт. [8], согласно которой при тревоге увеличивается роль внимания, ведомого стимулами, что может вести к усиленной обработке физических характеристик нецелевых стимулов и, соответственно, к повышению усредненной амплитуды N100.

Таким образом, на основании проведенного исследования можно заключить, что эффективность выполнения когнитивной задачи на внимание у больных шизофренией в первую очередь определяется генетическими особенностями. Тревожность может оказывать опосредующий эффект на эту ассоциацию, но только на тех стадиях выполнения когнитивной задачи, которые связаны с активацией зон мозга.

Работа выполнена при частичной поддержке грантом №12-06-00961а Российского гуманитарного научного фонда.