Анализ ассоциации полиморфизма генов протокадеринов гамма и гена DIAPH1 с ишемическим инсультом у лиц из русской популяции

Инсульты являются одной из ведущих причин смертности и стойкой утраты трудоспособности (инвалидизации) населения во всем мире [1]. Они возникают в результате внезапной окклюзии или разрыва кровеносного сосуда головного мозга. Соответственно различают ишемический (ИИ) и геморрагический (ГИ) инсульт. ИИ составляет около 80% всех случаев инсульта. За исключением небольшого процента моногенных форм, большинство случаев ИИ вызваны совокупным действием факторов окружающей среды и генетических факторов. Последние представлены наследственными вариациями в последовательностях ДНК, например, однонуклеотидными полиморфизмами (SNPs), на долю которых может приходиться до 40% риска развития ИИ [2].

На сегодняшний день идентифицировано несколько десятков генетических локусов, ассоциированных с ИИ [3]. Однако перспективы их использования в клинической практике, в частности, в формате полигенных панелей маркеров для количественной оценки генетической предрасположенности к риску ИИ (т. е. выявления лиц с высоким риском ИИ), пока остаются весьма ограниченными. Это, по-видимому, связано с тем, что суммарная доля описываемой этими генетическими маркерами фенотипической вариабельности инсульта составляет лишь несколько процентов [4]. В то же время результаты использования панелей генетических маркеров продемонстрировали зависимость их эффективности от числа использованных SNPs [4—6], что подчеркивает потенциал для выявления дополнительных маркеров (генов-кандидатов) в будущем.

В недавнем полногеномном ассоциативном исследовании с использованием алгоритмов кластеризации на основе плотности нами были выявлены несколько групп неравновесно сцепленных SNPs (гаплоблоков), ассоциированных с ИИ [7]. Гены, аннотированные в границах одного из них — гены протокадеринов подсемейства гамма (PCDHG), оказались значимо сверхпредставленными в биологических процессах адгезии клеточных мембран и межклеточных взаимодействий. Учитывая тот факт, что появляется все больше данных о роли этих генов в патогенезе сердечнососудистых заболеваний, а также важность проверки найденных ассоциаций в независимых когортах, нами был исследован полиморфизм локусов, составляющих упомянутый выше гаплоблок в группах больных инсультом и контроля, принадлежащих к русской этнической группе. Результаты работы подтвердили значимость ассоциации кластера с инсультом. Кроме того, также были выявлены ассоциации отдельных полиморфизмов и с исходами заболевания.

Цель исследования — изучить полиморфизм 5 однонуклеотидных замен (SNPs) генов протокадеринов гамма (PCDHG) и DIAPH1, ранее идентифицированных как гаплоблок на 5 хромосоме (chr5:140757301—140940025) и ассоциированных с риском ИИ у больных западноевропейского происхождения, в когорте пациентов с ИИ из русской этнической группы.

Исследование проведено в группе больных с ИИ, получавших лечение на клинической базе кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики лечебного факультета ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России в неврологическом отделении ГКБ №31 Москвы. В исследование был включен 331 пациент (166 мужчин и 165 женщин, возраст 71,68±8,69 года) с острым впервые диагностированным ИИ. В контрольную группу вошли 222 здоровых индивида (109 мужчин и 113 женщин, возраст 70,20±9,63 года) русского происхождения из регионов центральной европейской части России, включая Москву и Московскую область.

Критерии включения: наличие острого, впервые возникшего ИИ; самоидентификация себя как лица, принадлежащего к русской этнической группе; возраст 55 лет и старше.

Критерии невключения: наличие в анамнезе транзиторной ишемической атаки, повторного ИИ, геморрагического инсульта, острого инфаркта миокарда (ОИМ), декомпенсированной сердечной недостаточности и других тяжелых сопутствующих состояний, включая аутоиммунные и инфекционные заболевания.

Подтипы ИИ были определены в соответствии с критериями TOAST [8]. Для оценки тяжести инсульта использовали шкалу инсульта Национальных институтов здоровья (NIHSS) [9]. Функциональное восстановление после инсульта оценивали по модифицированной шкале Рэнкина (mRS) [10]. Статус больных оценивали дважды: в 1-й и 14-й дни инсульта.

ДНК выделяли из клеток периферической крови с использованием коммерческих наборов для выделения ДНК. Дискриминацию аллельных вариантов SNPs проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени по технологии TaqMan. Праймеры и зонды для определения аллелей были подобраны с помощью программы BeaconDesigner v. 7.91 (PREMIER Biosoft International, США) и синтезированы компанией «ДНК-Синтез» (Россия) (табл. 1). ПЦР проводили в водном растворе объемом 25 мкл, содержащем 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера («Синтол», Россия), 2,5 мМ MgCl2 («Силекс», Россия), 250 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ThermoFisher Scientific Baltics, Литва), по 10 пМ праймеров и 5 пМ FAM- и VIC-специфических зондов TaqMan («ДНК-Синтез», Россия), 1,25 ед. ДНК-полимеразы SynTaq («Синтол», Россия) и 50 нг геномной ДНК. Амплификацию и измерение интенсивности флюоресценции проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems, США). ПЦР проводили при следующих условиях: исходная денатурация ДНК и активация SynTaq ДНК-полимеразы при 95 °C — 10 мин; денатурация при 95ºC — 15 с и отжиг-элонгация при 56—57 ºC — 45 с (40 циклов).

Таблица 1. Исследованные однонуклеотидные полиморфизмы

Примечание. *Ta — температура отжига праймеров.

Все испытуемые давали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ. Для оценки связи полиморфизмов с риском инсульта сравнивали распределение аллельных и генотипических вариантов в группах больных и контроля. Для исследования ассоциаций полиморфизмов с исходами ИИ пациенты были разделены на группы функционального и нефункционального восстановления в зависимости от баллов mRS [11]: 1) баллы mRS 0—1 по сравнению с баллами 2—6; 2) баллы mRS 0—2 по сравнению с баллами 3—6; 3) баллы mRS 0—3 по сравнению с баллами 4—6. В дополнение к этим анализам пациенты с оценкой mRS=3 были выделены в отдельную группу и сравнивались с пациентами с баллами mRS 0—2 и 4—6. Все эти разделения основывались на оценках mRS, полученных на 14-й день. Параллельно оценивались изменения mRS от 1-го к 14-му дню как разница в баллах, присвоенных пациенту по результатам осмотра на 1-й и 14-й дни: ∆mRS=mRS1 — mRS14. Значения ∆ интерпретировали как положительную динамику протекания заболевания у пациентов (∆mRS>0), отрицательную (∆mRS>0) или стабильную (∆mRS=0). Распределение аллелей (гаплотипов) и генотипов в группах сравнивали с помощью теста χ2 или критерия Фишера. Для уточнения вклада отдельных генотипов дополнительно применялись доминантная и рецессивная генетические модели наследования, а также модель сверхдоминирования. Значимость ассоциаций была установлена на уровне p<0,01, которая рассчитывалась как номинальное значение (p<0,05), деленное на общее количество исследованных SNPs (n=5). Статистический анализ проводили с использованием программ и пакетов Statistica v.8.0 (StatSoft, Inc.,USA), Plink v.1.07 [12] и Haploview v.4.2 [13].

В ходе работы было генотипировано 5 SNPs. Частоты их аллелей, генотипов, а также 5-сайтовых гаплотипов в исследованных группах представлены в табл. 2 и 3. Распределения частот генотипов в контрольной группе не отклонялись от значений, ожидаемых по закону Харди—Вайнберга.

Таблица 2. Частоты 5-сайтовых гаплотипов в группах больных ИИ и здоровых лиц

Примечание. * — Уровень значимости ассоциации гаплоблока (совокупности всех гаплотипов) с инсультом. NA — not available (не применимо).

Таблица 3. Частоты аллелей и генотипов в исследованных группах больных и контроля

Примечание. * — Числа в скобках — количества генотипов/аллелей соответствующего типа.

Встречаемость гаплотипов в группе больных статистически значимо отличалась от встречаемости гаплотипов в контрольной выборке (p=0,019), что подтвердило ассоциацию интересующего гаплоблока с ИИ, установленную нами ранее в западноевропейской когорте [7]. Анализ частот встречаемости гаплотипов показал, что эта ассоциация, видимо, обусловлена гаплотипом TTTTA (p=0,0039). Этот же гаплотип был значимым и в исходно проанализированной западноевропейской когорте (p=0,0018). Однако в последней он не был единственным элементом, определявшим значимость ассоциации блока: гаплотип TTCCA демонстрировал даже еще более высокий уровень связи с ИИ (p=1,2·10^–7). Сравнение частот встречаемости аллелей отдельных локусов выявило ассоциацию ИИ с полиморфизмом rs397327 (p=0,0062). Однако на уровне генотипов она не достигала уровня статистической значимости (p=0,0282) (табл. 3). Схожая ситуация была зафиксирована и в европейской когорте.

Поскольку генетика ИИ остается недостаточно изученной, то нами также было проведено исследование ассоциации рассматриваемых SNPs с исходами (тяжестью) заболевания: функциональным статусом больных после инсульта. Ни в одном из сравнений, основанных на делении пациентов на группы функционального и нефункционального восстановления в зависимости от баллов mRS, не было выявлено статистически значимых различий в распределении генотипов. В то же время таковые были установлены при анализе динамики изменения функционального статуса пациентов с 1-х на 14-е сутки (∆mRS): rs251021 (p=0,0057) и rs397327 (p=0,0093; доминантная модель) (табл. 4). Дополнительные попарные сравнения показали, что эти различия обусловлены спецификой распределения аллелей в группе пациентов с положительной динамикой изменения статуса, в частности, с преобладанием у них генотипов TT по каждому из полиморфизмов.

Таблица 4. Частоты генотипов в группах больных с различной динамикой функционального восстановления после инсульта

Протокадерины — это молекулы клеточной адгезии, преимущественно экспрессирующиеся в ЦНС. Они представлены более 70 генами и подразделяются на кластеризованные (гены протокадеринов альфа (PCDHA), бета (PCDHB) и гамма (PCDHG) и некластеризованные (PCDH) протокадерины. Являясь критически важными для функционирования ЦНС, различные гены протокадеринов, прежде всего, были ассоциированы с нарушениями нейропсихического развития [14, 15]. Благодаря взаимодействию протокадеринов с Wnt-сигнальным путем было также предположено, что они могут влиять на развитие болезни Альцгеймера и выживание нейронов при очаговом ишемическом повреждении [16]. Однако роль PCDHs в ИИ остается малоизученной.

Только один ген — PCDH7 — был ассоциирован с заболеваемостью инсультом [17]. Дополнительные данные были получены в исследованиях функций миокарда при ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда, на фоне которых наблюдались не только изменения экспрессии PCDHs, включая PCDHGs, но и их корреляция с объемом инфаркта, желудочковой дисфункцией и пользой от кардиохирургического вмешательства [18—20]. Эти результаты продемонстрировали связь генов PCDHs с сердечной дисфункцией и предположили, что уровень их экспрессии может быть диагностическим маркером прогрессирования дисфункции.

Основываясь на результатах нашего исследования, в котором блок из 5 SNPs, перекрывающийся с кластером генов PCDHGs, был ассоциирован с риском инсульта, мы предположили, что комплексная дисфункция процессов, связанных с клеточной адгезией в сердечно-сосудистой системе, предшествует событию ИИ. Проявлением же этой дисфункции могут быть атеросклеротические поражения сосудов [21]. Связь последних с протокадеринами была продемонстрирована в недавних экспериментах по моделированию атеросклероза у мышей [22], в которых блокирование функциональной активности протокадеринов гамма эндотелия либо путем их генетического нокаута, либо ингибированием антителами защищало животных от атеросклероза. Артерии мышей с атеросклерозом характеризовались повышенным содержанием Pcdhg. Аналогичная ситуация была и с секционными образцами артерий людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями, эндотелий которых содержал в 3 раза больше PCDHGs, чем артерии здоровых людей того же возраста. При этом наиболее высокие уровни PCDHGs были зафиксированы в областях расположения атеросклеротических бляшек: в 4 раза больше, чем в областях тех же артерий, но без явных бляшек [22].

Ген DIAPH1 кодирует белок, стимулирующий сборку актиновых нитей цитоскелета. Было показано, что DIAPH1 опосредует ремоделирование сосудов, интегрируя компоненты системы окислительного стресса и пути передачи сигнала в гладкомышечных клетках [23]. Координируя динамику перестройки цитоскелета, DIAPH1 индуцирует формирование в мегакариоцитах предшественников тромбоцитов [24], которые играют важную роль в процессах свертываемости крови и тромбообразования. Эксперименты на животных также продемонстрировали значимость DIAPH1 и при ишемическом повреждении миокарда, на фоне которого наблюдалось значительное увеличение экспрессии гена в кардиомиоцитах. В то же время его делеция (выключение) приводила к уменьшению размера инфаркта и улучшению сократительной функции миокарда после ишемии/реперфузии [25]. Положительный эффект блокировки активности DIAPH1 наблюдался и в моделях, имитирующих повреждение эндотелия артерий, выражавшийся в ограничении в них патологического разрастания неоинтимы [23]. Насколько подобные изменения в экспрессии или функции DIAPH1 будут значимыми для возникновения/патогенеза ИИ, пока известно очень мало.

В работе Z. Ren и соавт. [26] отмечено существенное снижение экспрессии DIAPH1 в мононуклеарных клетках периферической крови больных ИИ по сравнению с контролем. Однако данное наблюдение стоит трактовать осторожно, так как в качестве контроля были взяты больные с гипертензией, которая сама по себе может быть фактором, влияющим на экспрессию гена посредством рецептора конечных продуктов гликирования RAGE. Также ими была исследована связь нескольких SNPs в гене DIAPH1 с ИИ и установлена ассоциация SNP rs7703688 с риском развития заболевания. Кроме того, в подгруппе больных с лакунарным подтипом ИИ выявлена связь генотипов локуса rs251019 с уровнем экспрессии гена, максимум которой наблюдался у обладателей генотипа СС [26]. Анализ неравновесия по сцеплению показал, что ни один из этих полиморфизмов не сцеплен ни с одним из исследованных нами полиморфизмов и, поэтому, найденные нами ассоциации могут рассматриваться как независимые.

Прежде чем перейти к рассмотрению функциональной значимости отдельных аллельных вариантов (генотипов) DIAPH1, необходимо отметить, что DIAPH1 во многих случаях действует в паре с RAGE, для которого он выступает эффекторным доменом и посредством которого реализуются специфичные для RAGE сигналы [27]. Конечные продукты гликирования (AGE) представляют собой соединения, образующиеся в ходе неферментативных реакций между восстанавливающими сахарами и белками, липидами или нуклеиновыми кислотами [28]. AGE образуются в организме в результате нормального метаболизма или поступают с пищей, однако их количество может значительно увеличиваться на фоне развития различных патологических состояний/заболеваний (диабет, метаболический синдром, сосудистые осложнения и сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные заболевания, рак и др.), приводя к увеличению числа RAGE и сигналов, индуцирующих окислительные и воспалительные процессы в клетках и тканях [28, 29].

Анализ данных проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) показал, что SNPs rs251021 и rs397327 являются локусами (eQTLs) [30], которые могут влиять на экспрессию гена DIAPH1 как в тканях мозга, так и в сосудах, причем минимумы экспрессии выявлены в клетках тканей с генотипами TT. В нашем исследовании такие генотипы встречались чаще у больных с положительной динамикой восстановления после инсульта, чем у тех, состояние которых ухудшалось или оставалось неизменным. Можно предположить, что у таких пациентов не только снижались уровни AGE и других лигандов RAGE, но и имелась меньшая интенсивность патологического сигналинга, реализуемого через связку RAGE-DIAPH1. Кроме того, генотипы rs397327 TT чаще встречались и у индивидов контрольной группы, чем у больных ИИ.

В нашей работе не было найдено ассоциаций между индивидуальными полиморфизмами генов PCDHG и риском и исходами инсульта. В то же время такая ассоциация была выявлена на уровне гаплотипов — мультиаллельных маркеров, в частности, гаплотипа TTTTA. Оба PCDHG полиморфизма — rs17603019 и rs11575963 — представлены в нем T-аллелями, которые согласно данным базы GTEx обладают меньшим потенциалом влияния на экспрессию генов PCDHG, чем альтернативные C-аллели. Гаплотип TTTTA встречался чаще у представителей контрольной группы, что согласуется с его меньшей атерогенностью. Этот же гаплотип включает и низкофункциональные аллели гена DIAPH1. Такое сочетание, видимо, отражает взаимовлияние полиморфизмов на активность каждого из генов: когда полиморфизмы генов PCDHG являются eQTLs для гена DIAPH1, а полиморфизмы гена DIAPH1 — eQTLs для генов PCDHG [30].

Гаплоблок из 5 сцепленных SNPs, перекрывающийся с генами кластера PCDHG и DIAPH1, выявленный нами ранее в качестве ассоциированного с риском возникновения ИИ у представителей западноевропейской популяции, подтвердил свой статус и в русской когорте. Дополнительно установлена ассоциация индивидуальных SNPs гаплоблока с функциональным статусом пациентов. Оба наблюдения расширяют существующее представление об участии протокадеринов в патогенезе ИИ. Гены кластера PCDHG и DIAPH1 могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов не только применительно к риску развития заболевания, но и могут выступать маркерами качества жизни и функционального восстановления больных после инсульта.

Работа проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт» (генотипирование), а также гранта Российского научного фонда №23-14-00131 (биоинформатический анализ).

The study was conducted as part of the State Assignment of the NRC «Kurchatov Institute» (genotyping), as well as a grant from the Russian Science Foundation No. 23-14-00131 (bioinformatics analysis).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.