Клинико-генетические ассоциации у пациентов с некардиоэмболическим ишемическим инсультом

Частота развития некардиоэмболических (атеротромботический и неуточненный патогенетические подтипы согласно критериям TOAST) ишемических инсультов (ИИ) остается стабильно высокой как в РФ, так и во всем мире, несмотря на широкое функционирование сети региональных сосудистых центров и внедрение инновационных методов леченияе таких как тромбоэкстракция [1].

Некардиоэмболический ИИ характеризуется высокой гетерогенностью и включает несколько четко очерченных патогенетических подтипов, в отношении которых в настоящее время разработаны достаточно эффективные методы вторичной профилактики с использованием антиагрегантной терапии ацетилсалициловой кислотой (АСК) [2—5]. Очевидно, что проблема профилактики как первичных, так и повторных ИИ остается актуальной. Данные литературы указывают на достаточно большой процент повторных ИИ на фоне приема как антиагрегантной, так и антикоагулянтной терапии.

АСК относится к группе препаратов, которые действуют на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы (ЦОГ), что приводит к подавлению продукции тромбоксана A2 тромбоцитами и снижает их агрегацию [6]. Порядка 57% пациентов демонстрируют резистентность к АСК [7], увеличение риска сосудистых событий коррелирует с высокой реактивностью тромбоцитов [8, 9]. Резистентность к АСК (аспиринорезистентность) является многофакторным явлением, и наследственность вносит значительный вклад в индивидуальные особенности функции тромбоцитов во время терапии аспирином [10].

Таким образом, антиагрегантная терапия является ключевым направлением для вторичной профилактики повторных некардиоэмболических ИИ. Высокая частота повторных ИИ обусловливает актуальность поиска дополнительных клинических и генетических факторов, влияющих на прогноз течения заболевания и определение критериев подбора адекватной антиагрегантной терапии.

Цель исследования — изучение ассоциации генетических маркеров, влияющих на остаточную реактивность тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии АСК, и клинико-лабораторных показателей у пациентов с некардиоэмболическим ИИ для прогнозирования ответа на терапию и клинического исхода.

На базе регионального сосудистого центра (РСЦ) ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова были обследованы 296 пациентов с некардиоэмболическим ИИ.

Критерии включения: верифицированный ИИ; некардиоэмболический патогенетический подтип ИИ согласно критериям TOAST; возраст от 45 лет; возможность принять участие в исследовании; подписание добровольного информированного согласия на участие в исследовании.

Критерии невключения: нейровизуализационные признаки опухоли мозга, артериовенозной мальформации, абсцесса мозга, аневризмы сосудов; хирургическое вмешательство на головном или спинном мозге; предшествующие ИИ или тяжелая черепно-мозговая травма в течение 3 мес; тяжелые заболевания печени; новообразования с повышенным риском кровотечения; кардиоэмболический патогенетический вариант ИИ; операции или инвазивные манипуляции в последние 10 дней; данные о кровотечении или острой травме на момент осмотра.

Все пациенты получали терапию согласно клиническим рекомендациям Минздрава России (2021 г., ID: 171) по лечению ИИ, включая антигипертензивную, антиагрегантную (аспирин 125 мг), гастропротективную, гиполипидемическую терапию.

Определение патогенетического подтипа ИИ осуществлялось согласно критериям TOAST: 98 пациентов с атеротромботическим патогенетическим вариантом ИИ (ИИ в бассейне крупной экстра- или интракраниальной артерии со стенозом ≥50% или окклюзией по данным ангиовизуализации) и 196 — с неуточненным патогенетическим вариантом согласно критериям TOAST (ИИ в бассейне крупной экстра- или интракраниальной артерии со стенозом <50% и без нарушения ритма сердца в анамнезе и других причин).

Клиническая оценка тяжести ИИ проводилась по шкале тяжести инсульта Национальных институтов здоровья США (NIHSS). Оценивали клинические исходы пациентов в течение первых 10 дней после поступления, динамику течения заболевания при сравнении показателя NIHSS на 10-й день и при поступлении на фоне проводимой терапии АСК, функциональные исходы по модифицированной шкале Рэнкина (mRS).

Исследование свойств тромбоцитарного гемостаза проводилось по стандартной методике по методу Борна и О’Брайена с определением агрегации, размеров агрегатов тромбоцитов на аденозиндифосфат (АДФ), арахидоновую кислоту (на 3-и сутки приема аспирина в дозе 125 мг). Критерием лабораторной аспиринорезистентности считались случаи выявления показателей средней АДФ — индуцированной агрегацией тромбоцитов (АТ) ≥70% на 10 мкмоль/л и средней АТ ≥20% на 0,5 мг/мл в присутствии арахидоновой кислоты (АК). Частичная резистентность к аспирину определялась как соответствие одному, но не обоим вышеуказанным критериям. Пациенты с показателем АДФ-индуцированной агрегацией <70% и <20% в присутствии арахидоновой кислоты считались чувствительными к аспирину.

Были выбраны 18 генетических маркеров в 12 генах (ITGB3, GPIba, TBXA2R, ITGA2, PLA2G7, HMOX1, PTGS1, PTGS2, ADRA2A, ABCB1, PEAR1) и 1 — в межгенной области (9p21.3) (табл. 1, рис. 1 на цв. вклейке), так как полиморфизмы этих генов ассоциированы с показателями индуцированной АТ и тяжестью течения ИИ.

Таблица1. Генетические маркеры

Рис. 1. Схема гидрогелевого биологического микрочипа для анализа генетических маркеров, использованного в исследовании.

а — схема расположения микрочипов; б — исследуемые генотипы; в — флюоресцентные изображения микрочипов; г — исследуемые аллели.

Средний возраст пациентов составил 64,65 [55; 76] года. Медиана балла по шкале NIHSS при поступлении составила 9 [6; 14], на момент выписки — 3 [2; 6], показатель динамики — 5 [3; 8]. mRS при поступлении — 3 [2; 5], при выписке — 2 [1; 3]. Индекс массы тела (ИМТ) — 27,17 [24,6; 30,80].

У всех пациентов к моменту выписки наблюдалась положительная динамика (рис. 2) — баллы по шкале NIHSS при выписке (3 [2; 7]) были достоверно ниже, чем при поступлении (9 [6; 14]) (p<0,0005).

Рис. 2. Показатели баллов по шкале NIHSS при поступлении и при выписке.

Основные параметры пациентов с различными подтипами некардиоэмболического ИИ представлены в табл 2.

Таблица2. Основные лабораторные показатели у пациентов с некардиоэмболическим ИИ

Примечание. КА — коэффициент атерогенности, ЛПВП — липопротеины высокой плотности, ЛПНП — липопротеины низкой плотности.

Исследование получило одобрение локального Этического комитета (№12 от 20.12.2017). Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистическая обработка данных исследования проведена с использованием программного обеспечения Statistica 10, Microsoft Excel. Для качественных переменных были рассчитаны абсолютные (n) и относительные (%) частоты. Определялись такие показатели, как среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (SE). При анализе данных с ненормальным распределением использовались медиана (Me) и интерквартильный размах, включающий 25-й и 75-й квартили [Q₁; Q₃]. Для аналитической обработки количественных показателей применялись непараметрические критерии Уилкоксона и Манна—Уитни, а также коэффициент Спирмена для оценки ранговой корреляции. Статистически значимыми признавались результаты с вероятностью ошибки <5% (p<0,05).

С помощью технологии гидрогелевых биочипов были генотипированы 296 пациентов с некардиоэмболическим ИИ. Исследовались ассоциации 18 SNPs (single nucleotide polymorphism — однонуклеотидный полиморфизм) с клиническими показателями в группе пациентов с атеротромботическим ИИ.

Пациенты с генотипом TT rs1126643 гена ITGA2 имели на 15,7% меньшую степень стеноза сонных артерий по сравнению с пациентами с генотипами CC+CT (49,12 против 64,84, p=0,002) (рис. 3).

Рис. 3. Ассоциация степени стеноза экстракраниальных артерий в инсульт-зависимом бассейне с генотипом по rs1126643 генаITGA2 (p=0,002, p*=0,032).

Ген ITGA2 кодирует интегрин альфа-2 (гликопротеин GPIa), который в комплексе с белком GPIIa (ген ITGB1) является одним из рецепторов коллагена на клеточной мембране тромбоцитов, а также ряда клеток, включая фибробласты и мегакариоциты. Замена цитозина (C) на тимин (T) в позиции 807 (C807T) приводит к повышенной экспрессии рецепторов GPIa/IIa на поверхности клетки и ассоциируется с увеличением скорости адгезии тромбоцитов, что может являться фактором риска развития инфаркта миокарда и ИИ [11]. В то же время в нашем исследовании аллель T ассоциирован с менее выраженной степенью стеноза сонных артерий, что позволяет рассматривать этот маркер в качестве протективного в отношении атеросклероза крупных артерий. Ранее было показано, что аллель 807T гена ITGA2 ассоциирован с менее выраженным атеросклеротическим поражением каротидных артерий у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа [12, 13]. В других работах отмечена ассоциация степени стеноза коронарных артерий и других полиморфизмов гена ITGA2 [14].

Пациенты с генотипом TT rs2071746 гена HMOX1 имеют на 11,1% более высокую степень стенозирования крупных артерий по сравнению с пациентами, имеющими генотипы AA и AT (72,7 против 61,6, p=0,0035, p*=0,032, рецессивная модель) (рис. 4). Таким образом, носительство аллеля A rs2071746 можно рассматривать как протективный фактор в развитии атеросклероза крупных артерий.

Рис. 4. Ассоциация степени стеноза экстракраниальных артерий в инсульт-зависимом бассейне с генотипом по rs2071746 гена HMOX1 (p=0,0035, p*=0,056).

Ген HMOX1 кодирует белок гемооксигеназу-1, который опосредует первую стадию катаболизма гема, расщепляя его с образованием биливердина. Гемооксигеназа-1 является ферментом системы антиоксидантной защиты и участвует в регуляции оксидативного стресса. Ранее была выявлена связь экспрессии гена HMOX1 с выраженностью стеноза сонных артерий [15]. Также показано, что полиморфизм HMOX1 rs2071746 влияет на клинический исход у пациентов с ИИ с атеросклерозом. Исследование включало 961 пациента. Первичной конечной точкой была совокупность сосудистой смерти, нефатального ИИ и инфаркта миокарда. После среднего периода наблюдения 15,13+7,42 мес у 89 (9,26%) пациентов наступила первичная конечная точка. Кумулятивная частота первичной конечной точки была значительно ниже у носителей генотипа A (AT±AA) по сравнению с генотипом TT (7,9% против 12,2%, отношение шансов (ОШ)=0,648, 95% доверительный интервал (ДИ): 0,425—0,988, p=0,044). После корректировки на возраст, пол и другие факторы сердечно-сосудистого риска было показано, что носительство аллеля A гена HMOX1 rs2071746 является независимым протективным фактором в развитии ИИ при наличии атеросклероза [16].

В нашем исследовании среди пациентов с атеротромботическим ИИ уровень ТГ был выше у пациентов с генотипом TT rs4523 гена TBXA2R по сравнению с генотипами CC+CT (2,34 ммоль/л против 1,6 ммоль/л, p=0,047) (сомнительный результат).

У пациентов с генотипами GG+AG rs689466 гена PTGS2 уровень триглицеридов был выше по сравнению с пациентами с генотипом AA (2,26 ммоль/л против 1,51 ммоль/л, p=0,012, p*=0,192). Ген PTGS2 кодирует фермент ЦОГ-2 (COX-2), принимающую активное участие в воспалении. Предполагается, что в патогенезе атеросклероза определенную роль играют гены, вовлеченные в воспалительные процессы, в том числе связанные с отложением окисленных липидов в стенках артерий [17]. Ранее было показано в отношении rs689466 гена PTGS2, что носители генотипа AA имели более высокий риск развития атеросклероза крупных артерий по сравнению с носителями аллеля G (GG+GA), эта разница оставалась значимой при многофакторном анализе с поправкой на возраст, пол и традиционные факторы риска (ОШ=1,404, 95% ДИ=1,019—1,934, p=0,038) [18].

Так как нарушение функции тромбоцитов является одним из важных факторов риска развития ИИ и оказывает влияние на эффективность антиагрегантной терапии, мы исследовали ассоциации между генетическими маркерами и лабораторными показателями АТ у пациентов с атеротромботическим ИИ [19, 20] (см. табл. 3). Ранее было показано, что у здоровых доноров возраст оказывает влияние на агрегационные свойства тромбоцитов как в случае спонтанной агрегации (СА), так и в присутствии индукторов. В нашей работе исследована способность тромбоцитов к агрегации на фоне антиагрегантной терапии АСК с учетом возраста пациентов.

Таблица3. Ассоциации полиморфизмов гена PTGS1 (rs1330344) с показателями АТ, индуцированной АК

Примечание. Здесь и в табл. 4 и 5: * — статистически значимо, AIC — Критерий информационного акайке, BIC — Критерий Байеса.

У пациентов с генотипом CC rs1330344 гена PTGS1 уровень АТ в присутствии арахидоновой кислоты (АА) был на 25,76% выше по сравнению с генотипами TT+TC (51,2 против 24,67, p=0,036, p*=0,576). Данный полиморфизм расположен в регуляторной области (T-1676C), и эта замена может приводить к повышению активности ЦОГ-1 и способствовать снижению или отсутствию ответа на аспирин. Ранее нами было показано, что аллель C и генотип CC (rs1330344) гена PTGS1 связаны с развитием лабораторной аспиринорезистентности и более высоким уровнем агрегации, индуцированной АК в общей выборке пациентов с ИИ. Аналогичное наблюдение было сделано в исследовании X. Li и соавт. [19]. Генотип CC ассоциирован с неблагоприятными функциональными исходами у пациентов с ИИ на фоне терапии аспирином.

Исследование АТ с использованием индуктора коллагена является одним из методов оценки функции тромбоцитов, который используется для диагностики нарушений системы гемостаза и контроля эффективности лечения.

Коллаген образует эластичный каркас сосуда и находится в субэндотелиальном слое сосудистой стенки. Пока коллаген прикрыт эндотелиальными клетками, он не оказывает влияния на свертывающую систему крови. При повреждении сосуда и нарушении целостности эндотелия коллаген вступает в непосредственный контакт с клетками и компонентами плазмы крови, запуская сложные, взаимосвязанные процессы активации гемостаза. Связываясь с рецепторами GPIa/IIb, GPVI и через фактор Виллебранда с рецепторами GPIb-V-IX, коллаген обеспечивает адгезию тромбоцитов и их активацию. В ответ на активацию тромбоциты меняют свою форму, у них появляются псевдоподии. Происходит запуск простагландин-тромбоксановой системы, из внутренних гранул тромбоцитов высвобождаются содержащиеся в них собственные эндогенные индукторы (фактор Виллебранда, бета-тромбоглобулин, тромбоспандин, фибронектин, фибриноген, 4-й тромбоцитарный фактор, V, XIII факторы свертывания, бета-тромбоглобулин и др.). Эти вещества обладают прокоагулянтными и, что важно, сильными проагрегантными свойствами. На поверхности активированных тромбоцитов расположены GPIIb/IIIa-рецепторы, с помощью которых тромбоцит связывает на своей поверхности до 40 000 молекул фибриногена. Формирующиеся «фибриновые мостики» соединяют тромбоциты между собой — это основной механизм АТ. GPIIb/IIIa-рецепторы связываются не только с фибриногеном, но и с фактором Виллебранда, что важно для эффективной АТ в условиях высокой скорости кровотока. Так, адгезия к субэндотелиальным, содержащим коллаген, структурам и действие коллагена на тромбоциты ведут к их рецепторной активации, выбросу индукторов из гранул хранения и в итоге к развитию интенсивной агрегации. Индуцированная коллагеном АТ — важный и обязательный этап свертывания крови, необходимый для формирования тромба и остановки кровотечения. При избыточной агрегации в первую очередь нарушается проходимость капилляров и мелких сосудов. Это может привести к ухудшению кровоснабжения головного мозга и развитию ИИ.

В нашем исследовании у пациентов с генотипом TT rs1051931 гена PLA2G7 уровень коллаген-индуцированной агрегации был на 22,38% выше по сравнению с генотипами CC и CT (38,42 против 16,01, p=0,021, p=0,336) (табл. 4).

Таблица4. Ассоциации полиморфизмов гена PLA2G7 (rs1051931) с показателями АТ, индуцированной коллагеном

Ген PLA2G7 кодирует фермент липопротеин-ассоциированную фосфолипазу A2 (Lp-PLA2). Фермент вырабатывается при воспалении, гидролизует окисленные фосфолипиды в ЛПНП, в крови транспортируется в основном в составе ЛПНП.

Наиболее интересным SNP является замена Ala379Val (rs1051931), который был связан с циркулирующей Lp-PLA2 и атеросклеротическими процессами (табл. 5). Была показана ассоциация с более высокой активностью Lp-PLA2 у гомозигот минорного аллеля (TT) [21, 22].

Таблица5. Ассоциации полиморфизмов гена PEAR1 (rs12041331) с показателями АТ, индуцированной ристомицином

У пациентов с генотипами GA+AA rs12041331 гена PEAR1 уровень АТ в присутствии ристомицина был на 14,97% выше по сравнению с пациентами с генотипом GG (72,49 против 57,19, p=0,0094, p*=0,141). Ген PEAR1 кодирует эндотелиальный рецептор АТ1. Ранее было показано, что интронный вариант rs12041331 ассоциирован с повышенным уровнем экспрессии белка и, соответственно, с более высокой степенью АТ [23]. В другой работе аллель A rs12041331 ассоциировался с ишемическими событиями (ОШ: 1,40; 95% ДИ: 1,04—1,88; p=0,03). Таким образом, PEAR1 rs12041331 значимо ассоциирован с ишемическими событиями у пациентов с заболеваниями коронарных артерий [24].

У пациентов с неуточненным ИИ полиморфизм гена ITGB3 rs5918 ассоциирован с уровнем агрегации тромбоцитов, индуцированной адреналином, полиморфизм rs4523 TBXA2R влияет на агрегацию в присутствии АДФ, полиморфизм гена ADRA2A rs4311994 ассоциирован со показателями агрегации в присутствии арахидоновой кислоты, а полиморфизм гена ITGA2 rs1062535 — с показателями агрегации тромбоцитов, индуцированной ристомицином и СА. Также на уровень спонтанной агрегации влияют полиморфизмы rs1051931 PLA2G7, 9p21.3 rs10120688, ABCB1 rs1045642. Полиморфизм гена ITGA2 rs1062535 ассоциирован с динамикой по NIHSS.

У пациентов с ИИ, принимающих аспирин в качестве антиагрегантной терапии, были выявлены особенности (полиморфизмы генов ITGB3, GPIba, TBXA2R, ITGA2, PLA2G7, HMOX1, PTGS1, PTGS2, ADRA2A, ABCB1, PEAR1), ассоциированные с показателями индуцированной АТ (АДФ и АК), которые являются маркерами лабораторной аспиринорезистентности и индивидуальными генетическими маркерами во время терапии аспирином.

Раннее выявление генетических факторов риска сосудистых заболеваний головного мозга (полиморфизмы генов системы тромбоцитарного гемостаза) является ключевым направлением для прогнозирования течения заболевания, индивидуального подбора терапии, первичной и вторичной профилактики ИИ. Исследование позволило выявить комплекс признаков (ассоциации клинико-генетических факторов риска: показатели АТ на адреналин, ристомицин, арахидоновую кислоту, СА, тяжесть состояния по шкале NIHSS, возраст, уровень ЛПНП, патогенетический вариант ИИ, полиморфизмы генов системы гемостаза), который может являться неблагоприятным фактором риска развития повторного ИИ, что требует разработки индивидуального подхода к процессу лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.