Биомаркеры атеротромботического и кардиоэмболического подтипов острого ишемического инсульта

Ишемический инсульт (ИИ), является одной из ведущих причин смертности и инвалидизации в популяции населения среди людей старше 60 лет [1]. Течение, тяжесть, результативность терапии и функциональный исход ИИ во многом определяются его подтипом. Согласно классификациям TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) и SSS — TOAST (Stop Stroke Study — TOAST), выделяют пять патогенетических подтипов ИИ: атеротромботический (АТ, вследствие атеросклероза крупных артерий), кардиоэмболический (КЭ, вследствие кардиогенной эмболии), лакунарный (вследствие окклюзии мелких артерий), ИИ другой установленной и неустановленной этиологии [2]. Наиболее тяжелым течением с выраженным неврологическим дефицитом и формированием обширных очагов поражения характеризуются АТ и КЭ подтипы ИИ.

Благодаря развитию высокоинформативных технологий в настоящее время имеется довольно четкое понимание этиопатогенетических аспектов церебральных ишемических нарушений и клинико-инструментальных критериев различных подтипов ИИ [3]. Наряду с хорошо изученными патобиохимическими, гемореологическими и гемостатическими нарушениями, роль воспалительных и нейроиммунных процессов в развитии и течении церебральной ишемии остается недостаточно раскрытой. В связи с чем изучение механизмов регуляции вазомоторной функции, регулируемой эндотелиальными факторами, и иммуновоспаления, опосредованного провоспалительными цитокинами, является перспективным направлением современной клинической медицины.

Регуляторами эндотелиальной дисфункции в условиях ишемии и гипоксии, согласно современным представлениям, являются стабильные метаболиты оксида азота (NO) и эндотелина-1 (ET-1) [4, 5]. Помимо «традиционных» цитокинов — интерлейкинов (IL) и фактора некроза опухоли (TNF-α), изменение концентраций которых в остром периоде ИИ продемонстрировано в многочисленных исследованиях, в настоящее время активно изучается роль индуцибельных цитокинов — хемокинов кластеров CXC и CC (C — остатки цистеина, X — аминокислотный остаток, разделяющий цистеины) [6]. Цитокинами кластера CC, наиболее тесно связанными с патогенетическими механизмами развития АТ и КЭ подтипов ИИ являются лиганды CR1/CR2-рецепторов — MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL-7, MCP-2/CCL8, MCP-4/CCL13, MIP-1d/CCL15 и MPIF-1/CCL23 [7]. Исследование изменения концентраций цитокинов различных групп, NO и ET-1 может расширить представление об иммуноопосредованных, нитроксидергических и эндотелиальных механизмах патогенеза и верифицировать биомаркеры различных подтипов острого ИИ.

Цель исследования — оценка концентраций CC-хемокинов и стабильных метаболитов NO и ET-1 у пациентов с АТ и КЭ подтипами ИИ в острейшем периоде.

Данное когортное исследование проводилось с мая 2021 г. по ноябрь 2023 г. на базе сосудистого центра ГБУЗ «Больница скорой медицинской помощи». В исследование были включены 60 пациентов с диагнозом «ИИ в каротидном бассейне» с установленным подтипом ИИ согласно критериям TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) на основании клинико-диагностических методов в рамках стандарта оказания медицинской помощи больным с инсультом.

Критерии включения: клинические признаки и симптомы, соответствующие диагнозу «ИИ в каротидной системе»; АТ и КЭ подтипы ИИ согласно TOAST; возраст от 50 до 80 лет.

Критерии невключения: декомпенсация коморбидных состояний; транзиторная ишемическая атака, инсульт в вертебрально-базилярной системе, другие патогенетические подтипы ИИ.

Все пациенты были рандомизированы в две основные группы. В 1-ю группу вошли 30 пациентов с АТ подтипом ИИ, во 2-ю группу — 30 пациентов с КЭ подтипом ИИ. Контрольную группу составили 20 пациентов соответствующей возрастной категории, обратившихся на амбулаторный прием к врачу-терапевту, без указания на инсульт в анамнезе.

У пациентов были верифицированы следующие демографические характеристики и коморбидная патология (табл. 1).

Таблица 1. Основные характеристики пациентов

Примечание. p₁ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 1-й и контрольной групп; p₂ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 2-й и контрольной групп; p₃ — показатель статистического отличия между параметрами 1-й и 2-й групп; * — различия показателей статистически значимы (p<0,0125 с поправкой Бонферрони); ИМТ — индекс массы тела. Данные возраста и ИМТ представлены в виде средних арифметических величин/стандартных отклонений (M±δ).

Статистически значимое отличие было выявлено только в отношении ИМТ у пациентов 2-й группы в сравнении с другими группами.

Всем пациентам при поступлении проводилась оценка функционального статуса. Повседневная активность пациента оценивалась с использованием индекса Бартел (Barthel Index, BI). Для оценки независимости пациента применялась модифицированная шкала Рэнкина (The Modified Rankin Scale, mRS). Тяжесть инсульта оценивалась в соответствии со шкалой инсульта Национальных институтов здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS). На момент поступления все пациенты с ИИ имели умеренные показатели тяжести инсульта по шкале NIHSS, ограничения дневной активности по BI и нарушения жизнедеятельности по шкале mRS.

Лабораторная диагностика проводилась в течение 24—48 ч от дебюта заболевания и включала оценку концентраций цитокинов различных групп и стабильных метаболитов NO и ET-1 в сыворотке крови пациентов. Концентрации IL-1b, IL-6, IL-16, интерферона-гамма (IFN-γ), CC-хемокинов (MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL-7, MCP-2/CCL8, MCP-4/CCL13, MIP-1d/CCL15, MPIF-1/CCL23) определяли методом проточной флуориметрии, двухлучевым лазерным автоматическим анализатором (Bio-Plex 200 Systems, «Bio-Rad», США) с использованием коммерческих тест-систем (Bio-Plex Human Panel, 40-Plex Assay, «Bio-Rad», США). Концентрации NO и ET-1 оценивали методом конкурентного иммуноферментного анализа с использованием наборов CEA482Hu Cloud-Clone Corp., Nitric Oxid Assay Kit A013-2-1 Cloud-Clone Corp.

Оценка локализации, латерализации и размера очага ишемии осуществлялась по данным КТ (компьютерный томограф DiscoveriCT 750HD-64-срезовый) и МРТ (магнитно-резонансный томограф Optima, MR450w 1.5Т) с применением протокола сканирования в режимах DWI, T2* (hemo), T2Flair. Для оценки начальных ишемических изменений в бассейне средней мозговой артерии использовалась шкала ASPECTS (Alberta Stroke Programme Early CT score).

Тромболитическая терапия в настоящем исследовании пациентам не проводилась в связи с наличием противопоказаний или поступлением пациента в стационар вне терапевтического окна.

Данное когортное исследование было одобрено независимым Этическим комитетом Центра клинических исследований ФГАОУ ВО «БФУ им. И. Канта» (протокол №2 от 27.04.2021). Информированное согласие было получено от всех субъектов, участвовавших в исследовании.

Для статистической обработки данных применялся стандартный пакет прикладных программ SPSS Statistics V23.0 for Windows, язык программирования Python, библиотеки Pandas и SciPy. Характер распределения количественных показателей оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка. Количественные показатели описывали с помощью средних арифметических величин/стандартных отклонений (M±δ) и медианы/нижнего и верхнего квартилей (Me [Q₁; Q₃]). Сравнительная статистика проводилась с помощью дисперсионного теста ANOVA и непараметрического критерия Уилкоксона. Анализ различий частот в двух независимых группах проводили при помощи точного критерия Фишера с двусторонней доверительной вероятностью, критерия χ² с поправкой Йейтса. Для множественного сравнения переменных с целью отклонения ложноположительных результатов применяли поправку Бонферрони. Уровень статистической значимости (α) был принят равным 0,05 (нулевые гипотезы отвергали при p<α).

Анализ показателей основных клинических шкал выявил следующие статистически значимые различия: более высокие баллы по шкале NIHSS (p=0,049), превалирование размеров очага ИИ (p=0,033) и наличия многоочагового поражения (p=0,038) у пациентов 2-й группы (табл. 2). Статистически значимых отличий по другим признакам между группами выявлено не было (p>0,05).

Таблица 2. Клинико-функциональные характеристики пациентов с церебральным ИИ

Примечание. * — различия показателей статистически значимы (p<0,05). СМА — средняя мозговая артерия; ПМА — передняя мозговая артерия; ПВА — передняя ворсинчатая артерия.

При оценке сывороточных концентраций IL, IFN-γ, ET-1 и NO у пациентов с ИИ в сравнении с группой контроля статистически значимое повышение было отмечено в отношении IFN-γ и IL-16 у пациентов обеих групп, IL-1b и IL-6 у пациентов 2-й группы, ЭТ-1 у пациентов 1-й группы. Сравнительная характеристика между группами пациентов с различными типами ИИ выявила статистически более высокие концентрации ET-1 в 1-й группе пациентов, IL-1b, IL-6 и IL-16 во 2-й группе (рис. 1).

Рис. 1. Показатели сывороточных концентраций IFN-γ, IL, ET-1 (пг/мл) и NO (ммоль/л) у пациентов с ИИ и контрольной группы.

p₁ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 1-й и контрольной групп; p₂ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 2-й и контрольной групп; p₃ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 1-й и 2-й групп (p<0,0125 с поправкой Бонферрони).

Сравнительная оценка уровня хемокинов подсемейства CC выявила более высокие концентрации MCP-1/CCL2 и MIP-1d/CCL15 у пациентов 1-й группы в сравнении со 2-й и контрольной группами. У пациентов 2-й группы было выявлено значимое повышение концентраций MCP-2/CCL8 и MPIF-1/CCL23 в сравнении с контрольной группой и MCP-4/CCL13 в сравнении 1-й группой (рис. 2).

Рис. 2. Показатели сывороточных концентраций CC-хемокинов (пг/мл) у пациентов с ИИ и контрольной группы.

p₁ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 1-й и контрольной групп; p₂ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 2-й и контрольной групп; p₃ — показатель статистической значимости отличия между параметрами 1-й и 2-й групп (p<0,0125 с поправкой Бонферрони).

В настоящем исследовании было выявлено повышение IFN-γ и IL-16, независимо от подтипа ИИ, что соответствует данным многочисленных исследований, демонстрирующих повышение уровня IFN-γ и IL-16 в острейшую фазу ИИ, связанное с основным провоспалительным действием данных цитокинов в условиях гипоксии и ишемии [8—10]. В настоящее время повышение уровня IFN-γ и IL-16 рассматривается как предиктор прогрессирования эндотелиальной дисфункции, обусловленной атеросклеротическим поражением, и предиктор неблагоприятного исхода у больных с фибрилляцией предсердий, что объясняет равнозначное повышение данных цитокинов у пациентов с различными подтипами ИИ [11, 12].

У пациентов с АТ подтипом ИИ наибольшая экспрессия была отмечена в отношении концентраций ET-1, MCP-1/CCL2 и MIP-1d/CCL15. Рядом исследователей последних лет выявлены повышенная продукция и долговременный вазоконстрикторный эффект ET-1 в условиях церебральной ишемии в ответ на ряд патологических процессов, включающих гиперхолестеринемию, дестабилизацию атеросклеротической бляшки, артериальную гипертензию, гипоксию и гиперкоагуляцию, которые непосредственно связаны с нарушением секреторной активности эндотелия сосудов [13]. MIP-1d/CCL15, представляющий хемотаксический фактор, участвует в привлечении лейкоцитов в артериальную стенку, увеличивает протромботическую активность и способствует дестабилизации бляшек при прогрессировании субклинического атеросклероза, в том числе посредством модулирования матриксной металлопротеиназы MMP-9, экспрессируемой активированными макрофагами и пенистыми клетками [14, 15]. Также MIP-1d/CCL15 участвует в активации молекул клеточной адгезии (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1, ICAM-1) в клетках эндотелия, что ведет к развитию эндотелиальной дисфункции и повышает риск увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [16].

Биологическая функция хемокина MCP-1/CCL2 реализуется путем связывания с родственным ему рецептором CCR2 с дальнейшей экспрессией IL-1 и TNF-α, хемотаксисом моноцитов в очаг ишемии, активацией внутриклеточных протеинкиназ PI3K (Phosphoinositide 3-Kinase) и MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), что потенцирует нейровоспаление и дисфункцию ГЭБ [17]. Повышение концентрации MCP-1/CCL2 у пациентов с АТ подтипом ИИ сопоставимо с результатами исследований, демонстрирующих непосредственную роль MCP-1/CCL2 и рецептора CCR2 в регуляции рекрутирования моноцитов, макрофагов и T-лимфоцитов к внутреннему эндотелиальному слою сосуда с последующим развитием местного воспаления с повышением уязвимости и нестабильности атеросклеротических бляшек [18].

У пациентов с КЭ подтипом ИИ выявлено повышение IL-1b, IL-6, MPIF-1/CCL23 и MCP-4/CCL13. Учитывая более тяжелое течение ИИ у пациентов данной когорты, экспрессия данных цитокинов, прежде всего, непосредственно связана с основными звеньями ишемического патохимического каскада. Роль IL-1β и IL-6 в патогенезе ИИ, реализующаяся за счет механизмов прямой и опосредованной активации ряда нейротоксических веществ, механизмов эксайтотоксичности, метаболизма арахидоновой кислоты и JNK (c-Jun N-terminal Kinases)-зависимого пути апоптотического каскада, в настоящее время продемонстрирована в ряде отечественных и зарубежных исследований [19, 20]. Достаточно хорошо изученный провоспалительный эффект IL-1β и IL-6 позволяет рассматривать экспрессию данных IL в качестве маркеров тяжести дисфункции ГЭБ, прогрессирования вазогенного отека мозга и гибели нейронов в условиях ишемии [21]. Другим возможным объяснением значимого повышения уровня IL-6 и IL-1β у пациентов с КЭ подтипом ИИ является непосредственная связь концентраций данных IL с ФП, являющейся основной причиной развития КЭ инсульта. В клинических и экспериментальных исследованиях представлены данные, отражающие более высокий уровень IL-6 и IL-1β у пациентов с постоянной, персистирующей и пароксизмальной формами ФП в сравнении с пациентами без нарушений сердечного ритма [22]. Экспрессия IL-6 и IL-1β, влияя на процессы электрического ремоделирования предсердий, может значительно увеличить риск ФП и связанных с ней осложнений, что позволяет рассматривать повышенные уровни данных IL в качестве индикаторов стратификации риска развития тромбоэмболических событий, острого коронарного синдрома и смертности у пациентов с ФП [23, 24].

Другим перспективным маркером тяжести ИИ в настоящее время является MPIF-1/CCL23, непосредственная роль которого в воспалительной реакции за счет активации и рекрутирования иммунных клеток в очаг ишемии и связь с показателями функционального исхода острого периода ИИ продемонстрированы данными работ последних лет и согласуются с результатами настоящего исследования [25, 26]. Некоторые авторы связывают высокие уровни CCL23 с развитием ИИ у пациентов с ФП и смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний [27]. Дискутабельным остается вопрос о преимущественном повышении уровня хемоаттрактанта моноцитов MCP-4/CCL13 у пациентов с КЭ подтипом ИИ. В отличие от хорошо изученных эффектов CCL2, в настоящее время имеется ограниченное количество работ, посвященных оценке взаимосвязи уровня других MCP-цитокинов с развитием и течением сердечно-сосудистых заболеваний. Являясь лигандами CCR2-рецептора, все MCP-хемокины, включая CCL13, участвуют в миграции классических моноцитов, которые, по современным представлениям, являются основной субпопуляцией клеток, рекрутируемой в мозг во время ИИ [28]. Косвенно высокий уровень MCP-4/CCL13 у пациентов с КЭ подтипом ИИ можно связать с выявленным высоким ИМТ, что совпадает с данными, демонстрирующими экспрессию CCL13 в эпикардиальной жировой ткани у пациентов с метаболическим фенотипом ожирения, нарушение механизмов регуляции которой в настоящее время рассматривается как один из патогенетических механизмов развития сердечно-сосудистых заболеваний [29].

Основным ограничением явилась малая выборка пациентов, что было обусловлено лимитированными возможностями лабораторной диагностики.

Полученные результаты дифференцированной экспрессии цитокинов различных групп, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, воспалением, формированием и нестабильностью атеросклеротической бляшки, прогрессированием и декомпенсацией ФП, представляются перспективными с точки зрения поиска новых биологических маркеров атеросклеротического поражения и кардиальной дисфункции, лежащих в основе развития ИИ. Результаты исследования позволяют рассматривать уровни хемокинов MCP-1/CCL2 и MIP-1d/CCL15 в совокупности с концентрацией ET-1 в качестве важного регулятора процесса атерогенеза, индикаторов течения АТ подтипа ИИ и возможного прогнозирования функционального исхода пациентов с гемодинамически значимым атеросклеротическим поражением. Цитокины IL-1b, IL-6, MPIF-1/CCL23 и MCP-4/CCL13, ассоциированные с КЭ подтипом, представляют ценность как перспективные маркеры осложнений ФП и в перспективе могут быть добавлены к шкале риска тромбоэмболических осложнений (CHA2DS2 –VASc), что может повысить оценку риска исходов ФП. Цитокины MPIF-1/CCL23, IL-6, IL-16, IL-1b и IFN-γ можно рассматривать как перспективные биомаркеры тяжести и течения ИИ. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения многоцентровых исследований с большим размером выборки для определения потенциальной ценности хемокинов CCR1/CCR2 и стабильных метаболитов в качестве биомаркеров тяжести и течения различных подтипов ИИ.

Исследование было проведено в рамках Государственного задания FZWM-2024-0013.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.