По данным Всемирной организации здравоохранения, инсульт остается второй по частоте причиной смертности во всем мире [1]. Ежегодно приблизительно у 15 млн человек развивается инсульт, около 6 млн из них умирают, а у 5 млн сохраняется выраженный неврологический дефицит [2]. В России распространенность заболевания схожа с общемировыми тенденциями, по данным эпидемиологических исследований, ежегодно регистрируется 450—500 тыс случаев инсульта [3—5]. В последние годы в связи с пандемией COVID-19 показатели заболеваемости и смертности от инсульта существенно увеличились [6].

Геморрагический инсульт (ГИ) по распространенности занимает 2-е место среди других инсультов. ГИ является самой тяжелой формой инсульта, на его долю приходится 15—20% всех инсультов, смертность от внутримозговых кровоизлияний уже в первые 30 сут достигает 35—50%, и только 10% больных остаются независимыми в повседневной жизни к концу 1-го месяца [7]. Субарахноидальные кровоизлияния составляют 25% всех ГИ, а кровоизлияния в мозг — 75%, последние в свою очередь подразделяются на латеральные — снаружи и медиальные — кнутри от внутренней капсулы. Основные причины ГИ — гипертоническая болезнь, атеросклероз сосудов мозга, болезни крови, артерииты, аномалии развития сосудов (аневризмы, мальформации), коагулопатии, опухоли мозга. При ГИ кровь попадает в ткань мозга из-за разрыва сосуда либо просачивается через его стенки. Клинические проявления ГИ зависят от локализации очага, а также обусловлены повышением внутричерепного давления, отеком и сдавлением мозга. Нарастающий отек мозга является основной причиной смерти при ГИ.

При ГИ многие патогенетические механизмы аналогичны тем, которые наблюдаются при ишемическом инсульте (ИИ) [8, 9]. При ГИ контакт крови с тканью мозга ведет к прогрессированию отека-набухания головного мозга, явления ишемии носят диффузный, распространенный, прогрессирующий характер, что и определяет большую летальность при ГИ. Каскад биохимических процессов, приводящий к разрушению клеток, обычно начинается с дефицита восполнения необходимых метаболических субстратов (кислорода и глюкозы), возникают энергетический дефицит, уменьшение продукции АТФ, снижение нейронального мембранного потенциала (первые 3—10 мин после наступления ишемии), которые запускают последующий каскад событий с вовлечением возбуждающих нейромедиаторов (массивный выброс глутамата и аспартата, активация глутаматных рецепторов и развитие глутаматной эксайтотоксичности). Затем происходит открытие кальциевых каналов и шоковое увеличение внутриклеточной концентрации кальция, снижение способности митохондрий продуцировать АТФ, нарушение АТФ-зависимых процессов, увеличение содержания свободных радикалов и инициация перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран, изменение их вязкости, активация кальцийзависимых протеаз и липаз. Образование активных форм кислорода вызывает иммунный ответ в виде асептической нейровоспалительной реакции. Эти процессы приводят к набуханию нервных клеток, разрушению органелл, ломкости внешних мембран и гибели клетки.

Терапевтическая стратегия при ИИ определяется патогенезом заболевания и включает патогенетическую и симптоматическую терапию, воздействующую на различные ключевые звенья ишемического каскада [10—12]. Терапия при ГИ включает коррекцию гемостаза, применение диуретиков, уменьшение отека мозга, коррекцию артериального давления, нейропротекторы. Используют нейротрофические средства, ноотропы, противоэпилептические препараты. Особое место среди терапевтических средств, применяемых при ИИ, хронической ишемии мозга (ХИМ) и ГИ, занимают препараты-нейропротекторы, которые воздействуют на ключевые патогенетические звенья процесса гибели клетки, прежде всего на глутаматную эксайтотоксичность и оксидативный стресс [11—16].

Нейропротективным препаратом с мультимодальным механизмом действия является Мексидол, обладающий широким спектром фармакологических эффектов (нейропротективный, противогипоксический, противоишемический, прокогнитивный, анксиолитический, антиоксидантный, противосудорожный и др.) [17—21]. Мексидол обладает выраженной антиоксидантной активностью, о чем свидетельствует его способность подавлять НАДФН₂-зависимое (ферментативное), железоиндуцируемое и аскорбатзависимое (неферментативное) ПОЛ, повышать активность Se-зависимой глутатионпероксидазы, снижать активность индуцибельной NO-синтазы, связывать супероксидный анион-радикал [20, 21]. Мексидол широко и с успехом применяется при лечении ХИМ, ИИ и ГИ [22—25].

Результаты недавнего международного многоцентрового рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования свидетельствуют о высокой клинической эффективности длительной последовательной терапии препаратами Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 у пациентов с ХИМ и о безопасности этой терапии, сопоставимой с плацебо, в связи с чем Мексидол рекомендован для применения в практике для лечения пациентов с ХИМ в качестве средства патогенетической терапии когнитивных, эмоциональных, вегетативных и двигательных нарушений [25]. Мексидол включен в Федеральный стандарт специализированной медицинской помощи при инфаркте мозга [26] и Клинические рекомендации «Ишемический инсульт и транзиторная ишемическая атака у взрослых» 2021 г. [27]. Эффекты и механизм действия Мексидола при ГИ изучены в меньшей степени, чем при ХИМ и ИИ. В частности, в экспериментальном исследовании на модели ГИ (интрацеребральной посттравматической гематомы) у крыс выявлено позитивное влияние Мексидола на неврологический статус и память в первые 7 сут после ГИ [28].

Цель исследования — выявление роли оксидативного стресса в развитии нарушений, возникающих при ГИ, изучение эффектов Мексидола при его курсовом применении в остром и восстановительном периодах ГИ с оценкой выживаемости животных, неврологического и когнитивного дефицита, судорожного синдрома и анализ связи лечебных эффектов препарата при ГИ с его антиоксидантным действием.

Материал и методы

Исследование выполнено на половозрелых аутбредных крысах-самцах массой 260—280 г, которые были получены из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животные содержались в условиях лабораторного вивария при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму в соответствии с ГОСТ 33216-2014 и 33215-2014. Организация и проведение экспериментальных работ осуществлялись в соответствии с нормативами международных рекомендаций (Директива 2010/63 EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22.09.2010). Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» (протокол №1 комиссии по биомедицинской этике от 21.01.2021).

Животные были разделены на четыре группы (по 10— 12 в группе): 1-я — интактные крысы; 2-я — ложнооперированные животные (ЛОЖ), которым проводилась только трепанация черепа; 3-я — животные с ГИ; 4-я — животные с ГИ, которым вводили Мексидол. Динамику развития нарушений, вызванных гематомой, и оценку влияния Мексидола на поведение и состояние крыс проводили в течение 14 сут после операции, с регистрацией показателей поведения на 1, 7 и 14-е сутки после операции. Регистрировались частота гибели животных, неврологический дефицит, судорожные приступы и нарушение когнитивных функций. Параллельно с регистрацией динамики нарушений состояния и поведения крыс при ГИ у отдельных групп, которые также включали интактных и ЛОЖ, крыс после ГИ и крыс с ГИ, получавших Мексидол, проводился количественный анализ показателей оксидативного стресса с оценкой содержания продуктов, вступающих в реакцию с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Мексидол вводили в острый период ГИ (внутрибрюшинно, в дозе 150 мг/кг, через 4 ч после моделирования ГИ в 1-е сутки, затем ежедневно еще 2 сут) и в восстановительный период ГИ (внутрь, в дозе 75 мг/кг, 1 раз в сутки, 11 сут). Курс лечения составил 14 сут. Контрольным животным по той же схеме вводили дистиллированную воду.

Создание модели ГИ (интрацеребральная гематома) [29, 30]. У крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/м), проводили трепанацию черепа и затем при помощи специального устройства (мандрен-нож) в стереотаксической рамке осуществляли деструкцию мозговой ткани в области capsula interna по атласу G. Paxinos (координаты H=4 мм, L=3,0 мм, A=1,5 мм от брегмы), с введением через 2—3 мин в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02—0,03 мл). Таким способом моделируется локальный аутогеморрагический инсульт в области capsula interna (диаметр 2 мм, глубина 3 мм) без существенных повреждений других образований мозга. ЛОЖ под наркозом проводили только скальпирование и трепанацию черепа без деструкции мозговой ткани.

Неврологический дефицит у животных оценивали по модифицированной шкале Stroke-index McGrow (mSI) [31]. Через 1, 7 и 14 сут после ГИ регистрировали количество (%) крыс с легкой симптоматикой (вялость движений, слабость конечностей, тремор, одно- и двусторонний полуптоз/птоз) и с тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (манежные движения, парезы 1—4 конечностей, параличи нижних конечностей, боковое положение).

Тест с вращающимся стержнем (ТВС, аппарат Rota Rod для крыс, «UgoBasile», Италия) использовали для оценки нарушения координации движений (моторный дефицит). Установка состоит из вращающегося горизонтального стержня (диаметр 4 см), который разделен на секции дисками (50 см в диаметре) на 5 секторов для индивидуального размещения крыс. Стержень вращается с постоянной скоростью 10 об/мин. На вращающийся горизонтальный стержень помещали крыс и регистрировали количество падений со стержня в течение 120 с.

Оценка условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) использовалась для определения когнитивных функций [29]. Для обучения УРПИ животных помещали в установку Passive avoidance («Lafauette Instrument Co», США), которая состоит из маленькой платформы, расположенной на расстоянии 1 м от пола, освещенной специальной лампой, и темной камеры с электродным полом. Крыс помещали на освещенную платформу перед входом в темную камеру установки хвостом к входному отверстию и регистрировали латентное время захода в темную камеру (ЛП рефлекса). Затем в темной камере крыса через пол получала однократное неизбегаемое болевое раздражение электрошоком (0,45 мА) продолжительностью 10 с (обучение), после чего выбегала из темной камеры опять на освещенную платформу и оставалась там (пассивное избегание болевого раздражения). Тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 1, 7 и 14 сут после обучения с регистрацией ЛП первого захода крысы в темную опасную камеру и количества животных, не зашедших в темный отсек камеры.

Метод определения продуктов ПОЛ — ТБК-активных продуктов (малоновый диальдегид (МДА)) в плазме крови и гомогенатах коры головного мозга крыс, одним из которых является МДА, концентрация которого повышается при оксидативном стрессе, основан на взаимодействии с ТБК. К 20 мкл предварительно размороженной плазмы крови добавляли 20 мкл 0,485М соли Мора и инкубировали при 37 °C в течение 30 мин. Затем к образцам добавляли 1060 мкл 0,9% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты («Serva», Германия) в 50% уксусной кислоте и инкубировали при 80 °C в течение 60 мин. После охлаждения измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре DU-50 («Beckman Coulter», США) при 532 нм с длиной пути 10 мм. Расчет количества комплекса с ТБК проводили на основании значения коэффициента молярной экстинкции ε=1,56·105 М-1·см^-1. Все измерения проводили в 2 параллелях. Концентрацию общих липидов в гомогенате мозга определяли с фосфованилиновым реактивом [32] после экстракции смесью метанол—хлороформ (1:2, по объему) по стандартной методике [33].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Краскела—Уоллиса для выявления межгрупповых различий; критериев Ньюмена—Кейлса и Данна для апостериорных сравнений средних. Кроме того, при анализе достоверности результатов использовали t-критерий Стьюдента и точный критерий Фишера.

Результаты

Изучение динамики выживания крыс показало, что к 14-м суткам наблюдения выжило 90% ложнооперированных животных, а в группе крыс с ГИ — только 40%. Мексидол при курсовом введении существенно увеличивал выживаемость животных после ГИ. На фоне 14-дневного введения Мексидола выжило 70% крыс.

При оценке выраженности неврологического дефицита у животных по шкале mSI установлено, что в группе ЛОЖ процент животных с легкими неврологическими нарушениями (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз) в течение всего времени наблюдения (1—14 сут) составил 20—40, а тяжелые неврологические нарушения у ЛОЖ не наблюдались (табл. 1). У крыс с ГИ, наоборот, у 50—60% отмечались тяжелые неврологические нарушения (манежные движения, парезы, параличи конечностей), а у 40—50% — также судорожные фокальные подергивания. Мексидол значительно снижал количество крыс как с легкими, так и особенно выраженно с тяжелыми неврологическими нарушениями, а также устранял фокальные судорожные приступы, возникающие после ГИ.

Таблица 1. Влияние применения Мексидола на выраженность неврологического дефицита и судорожные приступы у крыс после ГИ, шкала mSI, %

Примечание. ^# — отличия достоверны по сравнению с ЛОЖ, p≤0,05 (точный критерий Фишера); * — отличия достоверны по сравнению с животными с ГИ, p≤0,05 (точный критерий Фишера).

Оценку нарушения координации движений в ТВС у животных с ГИ проводили через 1, 7 и 14 сут после моделирования ГИ. У крыс с ГИ выраженный моторный дефицит (нарушение координации движений), выявляемый по увеличению количества падений со стержня, наблюдался уже через 1 сут после ГИ, усиливался через 7 сут и уменьшался через 14 сут (табл. 2). Мексидол не оказывал влияния на моторный дефицит, вызванный ГИ при регистрации эффектов через 24 ч после моделирования ГИ, но при курсовом применении ослаблял проявления моторного дефицита, достоверно уменьшая количество падений животных с вращающегося стержня, которые наблюдались через 7 и 14 сут после ГИ.

Таблица 2. Влияние Мексидола на координацию движений крыс с ГИ в ТВС

Примечание. ^# — отличия достоверны по сравнению с ЛОЖ, p≤0,05 (t-критерий Стьюдента); * — отличия достоверны по сравнению с животными с ГИ, p≤0,05 (t-критерий Стьюдента).

Таким образом, Мексидол при курсовом применении обладает способностью значительно ослаблять проявления неврологического дефицита у животных с ГИ, что выражается в достоверном уменьшении количества животных с тяжелыми неврологическими нарушениями (манежные движения, парезы 1—4 конечностей, параличи задних конечностей), уменьшении выраженности моторного дефицита и восстановлении координации движений в ТВС через 1, 7 и 14 сут после моделирования ГИ.

При изучении когнитивных функций было установлено, что при воспроизведении рефлекса через 24 ч после обучения 100% интактных крыс и 80% ЛОЖ помнили об ударе током, полученном в темной камере (сеанс обучения), и не заходили в эту опасную зону, несмотря на неудобство нахождения на освещенной платформе. Через 14 сут после обучения УРПИ 50% интактных и ЛОЖ помнили о полученном ударе тока и не заходили в опасную камеру (табл. 3). У крыс с ГИ при выполнении УРПИ через 1 сут после обучения наблюдалось снижение ЛП рефлекса захода в опасную камеру и уменьшение количества обучившихся животных до 50% по сравнению с ЛОЖ, а к 14-м суткам почти все животные с ГИ забывали ситуацию и с коротким ЛП заходили в темную камеру; УРПИ сохранялся только у 10% крыс. Полученные данные свидетельствуют о выраженных нарушениях обучения и памяти у крыс с ГИ.

Таблица 3. Влияние Мексидола на выполнение УРПИ после ГИ

Примечание. ^# — отличия достоверны по сравнению с ЛОЖ, p≤0,05 (t-критерий Стьюдента и точный критерий Фишера); * — отличия достоверны по сравнению с животными с ГИ, p≤0,05 (t-критерий Стьюдента и точный критерий Фишера).

В группе крыс с ГИ, получивших Мексидол, через 24 ч после обучения УРПИ наблюдалось улучшение воспроизведения рефлекса, который был сохранен у 60% крыс (см. табл. 3). Почти все животные воспроизводили УРПИ на протяжении всего времени наблюдения, что выражалось в увеличении ЛП рефлекса и количества животных, не зашедших в темную камеру. При регистрации воспроизведения УРПИ на 7-е и 14-е сутки после обучения после курсового применения Мексидола отмечалось статистически достоверное увеличение количества обучившихся крыс по сравнению с показателями контрольных животных с ГИ и увеличение латентного периода выполнения УРПИ. Таким образом, Мексидол при курсовом применении устраняет когнитивные нарушения после ГИ, что выражается в способности препарата восстанавливать нарушенное после ГИ обучение и воспроизведение УРПИ.

Установлено, что у контрольных интактных крыс через 1 и 7 сут концентрация ТБК-активных продуктов в крови животных и МДА в гомогенатах коры головного мозга крыс существенно не отличались (табл. 4). У крыс с ГИ как через 1 сут, так и через 7 сут после моделирования ГИ наблюдалось статистически достоверное повышение концентрации ТБК-активных продуктов в плазме крови и МДА в гомогенатах коры головного мозга, что свидетельствовало о развитии оксидативного стресса. Применение Мексидола вызывало нормализацию концентрации ТБК-активных продуктов в крови животных и МДА в гомогенатах коры головного мозга крыс через 1 и 7 сут ГИ. Таким образом, установлено, что у животных через 1 и 7 сут после ГИ наблюдается выраженный оксидативный стресс, который характеризуется повышением концентрации ТБК-активных продуктов в плазме крови и МДА в гомогенатах коры головного мозга крыс.

Таблица 4. Влияние применения Мексидола на концентрации ТБК-активных продуктов в крови и МДА в гомогенатах коры мозга крыс через 1 и 7 сут ГИ

Примечание. # — отличия достоверны по сравнению с ЛОЖ, p≤0,05 (t-критерий Стьюдента и точный критерий Фишера); * — отличия достоверны по сравнению с животными с ГИ, p≤0,05 (критерий Ньюмена—Кейлса).

Обсуждение

Совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует о том, что Мексидол при курсовом применении в острый и восстановительный периоды ГИ в различные сроки (1, 7 и 14-е сутки) после моделирования ГИ достоверно повышает выживаемость животных, уменьшает проявления неврологических дефицитов по шкале mSI (манежные движения, парезы 1—4 конечностей, параличи нижних конечностей, боковое положение), устраняет отдельные моторные судорожные проявления, восстанавливает нарушение координации движений (тест вращающегося стержня) и улучшает нарушенные вследствие ГИ процессы обучения и памяти. Наряду с этим Мексидол нормализует концентрации ТБК-активных продуктов в крови и гомогенатах коры головного мозга крыс с ГИ, что свидетельствует о его способности воздействовать на оксидативный стресс как одно из патогенетических звеньев в развитии нарушений при ГИ.

В настоящее время инсульт мозга рассматривается как следствие сложных и длительных процессов, при которых в связи с высокой потребностью тканей мозга в кислороде и глюкозе нарушение перфузии ведет к истощению субстратов, снижению продукции энергии клетками, нарушению ионных градиентов и снижению мембранного потенциала. При лечении ИИ и ХИМ применяют многофункциональные препараты с мультимодальным механизмом действия, которые на разных уровнях воздействуют на ключевые этапы каскада гипоксии/ишемии и, прежде всего, на эксайтотоксичность, оксидативный стресс и нейровоспаление. Полученные в настоящем исследовании данные подтверждают наличие у Мексидола антиоксидантных свойств — способность подавлять НАДФН₂-зависимое (ферментативное) железоиндуцируемое и аскорбатзависимое (неферментативное) ПОЛ, повышать активность Se-зависимой глутатионпероксидазы, снижать активность индуцибельной NO-синтазы и связывать супероксидный анион-радикал [20, 21, 34].

Выраженный позитивный эффект Мексидола при гипоксии и ишемии мозга, выявляемый как в эксперименте, так и в клинике, определяется его мультимодальным механизмом действия, способностью воздействия на ключевые звенья патогенеза при ГИ и ИИ, а также при ХИМ. Наряду с антиоксидантным действием Мексидол обладает мембранотропным, энергостабилизирующим действием: улучшает митохондриальное дыхание и энергетический статус клетки, восстанавливает процессы в цикле Кребса, повышая интенсивность окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ [35, 36], уменьшает глутаматную эксайтотоксичность [37].

Заключение

Установлено, что Мексидол при курсовом применении (150 мг/кг внутрибрюшинно 3 дня и затем 75 мг/кг внутрь с 4-х по 14-е сутки) у крыс в острый и восстановительный периоды ГИ в различные сроки (1, 7 и 14-е сутки) после моделирования ГИ достоверно повышает выживаемость животных, уменьшает проявления неврологического дефицита, устраняет судорожные приступы, восстанавливает координацию движений и улучшает нарушенные ГИ процессы обучения и памяти. Установлено, что через 1 и 7 сут после ГИ в плазме крови и гомогенатах коры головного мозга крыс наблюдается повышение концентрации ТБК-активных продуктов, что свидетельствует о развитии оксидативного стресса. Мексидол при курсовом применении вызывает нормализацию концентрации ТБК-активных продуктов в крови животных и гомогенатах коры головного мозга крыс как через 1, так и через 7 сут после моделирования ГИ. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении оксидативного стресса как патогенетического звена в развитие неврологического дефицита и когнитивных нарушений при ГИ и способности Мексидола устранять эти нарушения. Все это обосновывает значимость применения Мексидола у больных с ГИ, паренхиматозным кровоизлиянием и определяет особенности его терапевтических эффектов.

Работа выполнена по теме Гос. задания №122020100281-9.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.