Сывороточные молекулярные маркеры поражения нервной системы и маркеры пластичности мозга активно изучаются последние 10 лет при различных неврологических состояниях. Особое внимание уделяется цереброваскулярным заболеваниям. С одной стороны, это связано в высокой распространенностью инсульта, с другой — спорным остается вопрос диагностической значимости и клинической ценности биомаркеров крови для прогнозирования неврологического дефицита и рецидива инсульта [1—4].
Нейронспецифическая енолаза (NSE) — основной белок головного мозга, изофермент гликолитического фермента енолазы, содержащийся в цитоплазме нейронов и клеток нейроэндокринного происхождения. При повреждении плазматической мембраны нейронов NSE высвобождается и достигает периферической крови через лимфатическую систему [5, 6]. На экспериментальных моделях окклюзии средней мозговой артерии доказано, что уровень NSE повышается при острой ишемии головного мозга. Это свидетельствует о повреждении гематоэнцефалического барьера и связано с прогрессированием неврологических симптомов [7]. Данные многочисленных исследований, направленных на изучение маркера в качестве предиктора клинических исходов в острый период инсульта, противоречивы и неубедительны [4, 8—12]. Небольшие выборки пациентов, определенный артериальный бассейн, мониторинг концентрации NSE исключительно в остром периоде церебральной ишемии ограничивают полноту сделанных интерпретации выводов. Вместе тем показано, что уровень сывороточной NSE изменяется динамически. Поэтому целесообразно изучить корреляцию уровня белка с клиническими характеристиками инсульта во временном промежутке раннего восстановительного периода.
Наряду с нейрохимическими маркерами повреждения в условиях ишемии имеет место экспрессия мозгового нейротрофического фактора (BDNF) — важнейшего медиатора восстановления и ключевого фактора синаптического ремоделирования. BDNF — белок семейства нейротрофинов, регулирует нейрогенез, участвует в нейронном выживании, стимулирует рост, пролиферацию и пластичность нейронов. BDNF играет решающую роль в моторном обучении. Клинические исследования доказали участие BDNF в патофизиологии инсульта. Концентрация маркера в периферической крови возрастает к 14-му дню ишемии в ответ на повреждение ткани мозга. Низкие уровни BDNF описаны у лиц с риском развития цереброваскулярных заболеваний, связаны с тяжелым неврологическим дефицитом у пациентов в остром периоде ишемического инсульта и плохим функциональным исходом. Синтез BDNF в периинфарктной области коры мозга отвечает за восстановление двигательных функций. Активно изучается роль BDNF в спонтанном, а также связанном с реабилитацией восстановлении [13—17].
Взаимосвязь маркеров повреждения и пластичности мозга в динамике острого и раннего восстановительного периодов у пациентов с церебральной ишемией ранее не изучалась.
Цель исследования — мониторинг уровней NSE и BDNF в периферической крови, анализ клинико-лабораторных корреляций у пациентов с ишемическим инсультом на этапах медицинской реабилитации в раннем восстановительном периоде.
Материал и методы
Исследование выполнено на кафедре неврологии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «СибГМУ» Минздрава России совместно с лабораторией молекулярной генетики и биохимии НИИ психического здоровья Томского НИМЦ в 2019 г. В исследование включены пациенты, поступившие в Региональный сосудистый центр ТОКБ в течение 6 ч после появления первых симптомов острого инсульта в бассейне средней мозговой артерии. Компьютерная томография головы выполнена в день поступления для диагностики инфаркта мозга (I63.5 согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра). Лечение проводилось согласно стандарту специализированной медицинской помощи при инфаркте мозга (приложение к приказу МЗ РФ от 29.12.12 №1740). Информированное согласие получено от пациентов или ближайших родственников до включения в исследование. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «СибГМУ» Минздрава России (протокол №5961 от 18.06.18). Из исследования исключены пациенты с транзиторной ишемической атакой, геморрагическим или повторным инсультом, заболеваниями сердца, почек и печени, опухолями, травмой головы, ВИЧ-инфицированные, а также пациенты, умершие в течение 3 мес от начала инсульта (поскольку функциональный неврологический исход оценивался на 90-е сутки).
Клинико-демографические характеристики пациентов, а также лиц группы сравнения, находящихся в группе риска развития цереброваскулярных заболеваний, представлены в табл. 1. Период наблюдения составил 90 дней. Точки наблюдения: День 1 — в течение первых 24 ч; День 14 — в конце I этапа медицинской реабилитации; День 45 — после II этапа реабилитации; День 90 — конец раннего восстановительного периода. После I этапа реабилитации исследуемая популяция разделена на 1-ю группу (n=32), получавшую восстановительное лечение на II этапе реабилитации в Филиале ТНИИКиФ ФГБУ «СибФНКЦ» ФМБА России, и 2-ю группу (n=17) — пациенты, выписанные на амбулаторное наблюдение по месту жительства. Деление обосновано с точки зрения влияния реабилитационных мероприятий, проводимых в ранний восстановительный период, на исход инсульта.
Таблица 1. Клинико-демографическая характеристика популяции
Table 1. Clinical and demographic characteristics of the population
| Демографическая переменная | Группы (n=99) | |
| пациенты с инсультом(n=49) | группа сравнения (n=50) | |
| Возраст, годы | ||
| 40—59 | 15 (28%) | 17 (34%) |
| >60 | 39 (72%) | 33 (66%) |
| средний возраст | 65 (59; 68) | 63 (56; 65) |
| Пол | ||
| муж | 26 (53,1%) | 29 (58%) |
| жен | 23 (46,9%) | 21 (42%) |
| Артериальная гипертония | 49 (100%) | 37 (74%) |
| Длительность АГ, годы | 11 (10; 15) | 6 (5; 9) |
| Ишемическая болезнь сердца | 15 (30,6%) | 11 (22%) |
| Инфаркт миокарда | 7 (14,3%) | 0 |
| Фибрилляция предсердий | 9 (18,4%) | 0 |
| Стентирование и искусственые клапаны сердца | 2 (4,1%) | 0 |
| Ожирение | 34 (69,4%) | 28 (56%) |
| Дислипидемия | 40 (81,6%) | 43 (86%) |
| Сахарный диабет (СД) | 12 (24,5%) | 14 (28%) |
| Длительность СД, годы | 5 (2; 10) | 7 (4; 10) |
| Курение | 18 (36,7%) | 32 (64%) |
| Подтип инсульта в соответствии с критериями TOAST | ||
| Атеросклероз крупных артерий | 10 (20,4%) | |
| Кардиальная эмболия | 9 (18,4%) | |
| Окклюзия мелких кровеносных сосудов | 2 (4,1%) | |
| Инсульт неопределенной этиологии | 28 (57,1%) | |
| Пораженное полушарие головного мозга | ||
| правое | 26 (53,1%) | |
| левое | 23 (46,9%) | |
Неврологический дефицит оценивали полуколичественно по шкале инсульта Национального института здоровья (NIHSS), по шкале Фугл-Мейера (Fugl-Meyer Assessment, FMA). Функциональную инвалидность оценивали по модифицированной шкале Рэнкина (mRS).
Биологическим материалом для исследования явилась сыворотка крови. Содержание NSE определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов CanAg NSE EIA («Fujirebio Diagnostics, Inc.», Швеция). Результаты оценивали на автоматическом микропланшетном спектрофотометре Epoch («BioTek Instruments», США) и анализаторе иммуноферментных реакций УНИПЛАН («Пикон», Россия) при длине волны 450 нм, выражали в мкг/л. Концентрацию BDNF определяли на мультиплексном анализаторе MAGPIX («Luminex», США) с использованием панели HNDG3MAG-36K производства MILLIPLEX MAP («Merck, Darmstadt», Германия). Детектируемая информация обрабатывается программным обеспечением Luminex xPONENT с последующим экспортом данных в программу для обсчета MILLIPLEX Analyst 5.1. Полученные результаты выражали в пг/мл.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 13.0. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05 (p — достигнутый уровень значимости). Категориальные признаки описаны в виде абсолютных и относительных (%) частот встречаемости, количественные и порядковые — в виде медианы и интерквантильного размаха Me (Q1; Q3). Сравнение независимых выборок выполнялось при помощи критерия Манна—Уитни. Оценка взаимосвязи признаков проводилась при помощи непараметрического корреляционного анализа.
Результаты
Медианы значений по шкалам NIHSSДень1=5 (3; 9) баллов и FMAДень1=179 (151; 194) баллов в острейший период ишемического инсульта характеризовали неврологический дефицит в исследуемой популяции как средней степени тяжести. В табл. 2 возможно проследить достоверный регресс неврологических нарушений в течение периода наблюдения пациентов (p<0,001). Тесная отрицательная корреляционная связь выявлена между снижением суммарного балла по шкале NIHSS и нарастанием суммарного балла по шкале FMA к концу острого периода инсульта (r=–0,808, p<0,001) и на 90-й день инсульта (r=–0,898, p<0,001).
Таблица 2. Сравнение результатов оценки по клиническим шкалам и уровней сывороточных биомаркеров у пациентов с ишемическим инсультом в точках наблюдения
Table 2. Comparison of clinical scales and serum biomarker levels in patients with ischemic stroke at observation points
| n=49 | Точка наблюдения | Группа сравнения | Сравнение | ||||||
| День 1 | День 14 | День 90 | pДень 1—14 | pДень 14—90 | pДень 1—90 | pДень1—Гр.ср | pДень1—Гр.ср | ||
| mRS, баллы | 3 (2; 4) | 2 (2; 3) | 1 (1; 2) | <0,001 | <0,001 | <0,001 | |||
| NIHSS, баллы | 5 (3; 9) | 4 (3; 6) | 2 (2; 3) | <0,001 | <0,001 | <0,001 | |||
| FMA, баллы | 179 (151; 194) | 196 (177; 206) | 210 (195; 220) | <0,001 | <0,001 | <0,001 | |||
| BDNF, пг/мл | 2309 (1563; 3789) | 3608 (2557; 4722) | 1155 (732; 3236) | 4250 (2214; 5152) | <0,001 | 0,002 | 0,085 | 0,006 | 0,637 |
| NSE, мкг/л | 5,6 (4,5; 8,4) | 4,8 (3,5; 5,8) | 2,6 (1,9; 4,3) | 3,9 (3,1; 5,2) | <0,001 | <0,001 | <0,001 | <0,001 | 0,185 |
Примечание. Значимость p<0,05.
Note. Significance p<0.05.
Уровень NSE в сыворотке крови пациентов в 1-е сутки заболевания был значимо выше, чем в группе сравнения (рДень1—Гр.ср<0,001). По результатам ROC-анализа, с учетом максимальной суммарной чувствительности и специфичности параметра для разделенных групп с инсультом (День 1) и без него, определен пороговый уровень (точка отсечения) NSE=3,9 мкг/л. Значения NSE статистически различались в точках наблюдения с тенденцией к максимальному снижению на 90-й день инсульта (рДень1—90<0,001) (табл. 2). Применив выбранную точку отсечения в качестве критерия достижения уровня NSEДень90, близкого к уровню NSE в группе сравнения, популяцию пациентов разделили на две группы: NSEДень90<3,9 мкг/л (n=35) и NSEДень90>3,9 мкг/л (n=14). Детальный анализ динамики маркера показал, что у пациентов с NSEДень90<3,9 мкг/л величина снижения концентрации NSE в периферической крови между 14-м и 90-м днями наблюдения была более выраженной, чем у пациентов с NSEДень90>3,9 мкг/л (ΔNSEДень14—90=–1,9 (–2,7; –1,3) мкг/л и ΔNSEДень14—90= –0,5 (–2,4; –1,1) мкг/л соответственно; p=0,017) (рис. 1). Аналогичные статистические данные получены в отношении величины снижения суммарного балла по шкале NIHSS: ΔNIHSSДень14—90=–2 (–3; –1) балла у пациентов с NSEДень90<3,9 мкг/л и Δ значений по шкале NIHSSДень14—90=–1 (–1; 0) бав сыворотке кровилл у пациентов с NSEДень90>3,9 мкг/л (p=0,028) (рис. 2).
Рис. 1. Величина изменения концентрации NSE c 14-го по 90-й день наблюдения в группах пациентов с уровнем NSE, превышающим и не превышающим пороговый, в периферической крови на 90-е сутки инсульта.
Fig. 1. The amount of change the NSE concentration from 14th to 90th days of observation in patients groups with serum NSE levels exceeding and not exceeding the threshold on 90th day of stroke.
Рис. 2. Величина изменения суммарного балла по шкале NIHSS c 14-го по 90-й день наблюдения в группах пациентов с уровнем NSE, превышающим и не превышающим пороговый, в периферической крови на 90-е сутки инсульта.
Fig. 2. The amount of change the total NIHSS score from 14th to 90th days of observation in patients groups with serum NSE levels exceeding and not exceeding the threshold on the 90th day of stroke.
Уровень BDNF в 1-е сутки заболевания оказался существенно ниже, чем в группе сравнения (pДень1—Гр.ср=0,006) и достоверно возрастал к 14-му дню болезни (pДень1—14<0,001; pДень14—Гр.ср=0,637). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена для NSEДень14 и BDNFДень14 равен –0,349, что отражает отрицательную корреляционную связь, свидетельствующую о противоположной направленности уровней маркера повреждения и маркера пластичности мозга, статистически значимую на уровне p=0,049. Кроме того, у пациентов с NSEДень90<3,9 мкг/л концентрация BDNFДень14=4350,0 (3227,5; 5191,0) пг/мл достоверно превышала таковую у пациентов с NSEДень90>3,9 мкг/л; BDNFДень14=2778,0 (2056,5; 3337,0) пг/мл (p=0,006).
Все пациенты в популяции имели благоприятный функциональный исход по данным оценки по шкале mRS к концу раннего восстановительного периода инсульта (см. табл. 2). Отчетливая положительная корреляционная связь прослеживалась между увеличением концентрации сывороточного BDNFДень14 и снижением баллов по шкале mRSДень90 (r=0,499, p=0,035). Положительно коррелировали между собой в точках наблюдения шкалы NIHSS и mRS, демонстрируя связь неврологического улучшения и функциональной независимости пациентов с течением времени: NIHSSДень14 и mRSДень14 (r=0,644, p<0,001); NIHSSДень14 и mRSДень90 (r=0,716, p<0,001); NIHSSДень90 и mRSДень90 (r=0,754, p<0,001). Тесные отрицательные корреляции выявлены между FMA и mRS в динамике наблюдений: FMAДень14 и mRSДень14 (r=–0,569, p<0,001); FMAДень14 и mRSДень90 (r=–0,604, p<0,001); FMAДень90 и mRSДень90 (r=0,729, p<0,001).
Пациенты, разделенные после I этапа реабилитации на 1-ю и 2-ю группы, клинически и лабораторно не обнаруживали статистически значимых отличий. Анализ динамики биомаркеров в группам показал достоверно более высокий уровень сывороточного BDNFДень90 у пациентов после II этапа моторной реабилитации по сравнению с пациентами, находящимися на амбулаторном наблюдении (pДень90—Гр.1—2=0,017). Концентрация BDNF снижалась к концу раннего восстановительного периода у всех пациентов, но в 1-й группе статистически не отличалась от 14-го дня (pДень14—90—Гр.1=0,170), а во 2-й группе оказалась достоверно ниже (pДень14—90—Гр.2=0,002) (табл. 3).
Таблица 3. Клинико-лабораторные ассоциации в точках наблюдения на этапах реабилитации
Table 3. Clinical and laboratory associations in the observation points on the stages of rehabilitation
| Переменная в точках наблюдения | 1-я группа (n=32) | 2-я группа (n=17) | Сравнение групп |
| mRSДень1 | 3 (2; 4) | 3 (3; 4) | p=0,350 |
| mRSДень14 | 3 (2; 3) | 2 (2; 3) | p=0,149 |
| mRSДень45 | 2 (2; 3) | ||
| mRSДень90 | 1 (1; 2) | 2 (1; 3) | p=0,020 |
| pДень 1—14=0,001 pДень 14—45=0,002 pДень 45—90<0,001 pДень 1—90<0,001 pДень 14—90<0,001 | pДень 1—14=0,001 pДень 14—90=0,083 pДень 1—90<0,001 | ||
| NIHSSДень1 | 5 (4; 8) | 6 (3; 11) | p=0,265 |
| NIHSSДень14 | 4 (3; 6) | 3 (2; 6) | p=0,932 |
| NIHSSДень45 | 3 (2; 5) | ||
| NIHSSДень90 | 2 (1; 3) | 3 (2; 6) | p=0,012 |
| pДень 1—14<0,001 pДень 14—45=0,002 pДень 45—90<0,001 pДень 1—90<0,001 pДень 14—90<0,001 | pДень 1—14=0,001 pДень 14—90=0,014 pДень 1—90<0,001 | ||
| FMAДень1 | 179 (155; 194) | 170 (134; 194) | p=0,431 |
| FMAДень14 | 194 (178; 204) | 205 (170; 208) | p=0,383 |
| FMAДень45 | 200 (189; 212) | ||
| FMAДень90 | 215 (207; 222) | 205 (155; 212) | p=0,005 |
| pДень 1—14<0,001 pДень 14—45<0,001 pДень 45—90<0,001 pДень 1—90<0,001 pДень 14—90<0,001 | pДень 1—14<0,001 pДень 14—90=0,575 pДень 1—90<0,001 | ||
| BDNFДень1, пг/мл | 2585 (1327; 3820) | 2128 (1604; 3757) | p=0,939 |
| BDNFДень14, пг/мл | 3538 (2152; 4958) | 3608 (2627; 4686) | p=0,970 |
| BDNFДень45, пг/мл | 2119 (1364; 3644) | ||
| BDNFДень90, пг/мл | 1960 (785; 4843) | 1131 (679; 1771) | p=0,017 |
| pДень 1—14=0,001 pДень 14—45=0,013 pДень 45—90=0,528 pДень 1—90=0,913 pДень 14—90=0,170 | pДень 1—14=0,001 pДень 14—90=0,002 pДень 1—90=0,011 | ||
| NSEДень1, мкг/л | 5,3 (4,3; 7,1) | 8,4 (5,0; 9,6) | p=0,062 |
| NSEДень14, мкг/л | 4,3 (3,0; 5,6) | 5,6 (4,2; 6,7) | p=0,056 |
| NSEДень45, мкг/л | 3,5 (2,4; 4,7) | ||
| NSEДень90, мкг/л | 2,5 (1,9; 3,5) | 2,7 (2,0; 4,7) | p=0,529 |
| pДень 1—14<0,001 pДень 14—45<0,001 pДень 45—90=0,025 pДень 1—90<0,001 pДень 14—90<0,001 | pДень 1—14=0,001 pДень 14—90=0,001 pДень 1—90<0,001 |
Примечание. Значимость p<0,05.
Note. Significance p<0.05.
Значения по шкалам NIHSS (pДень14—45—Гр.1=0,002; pДень45—90—Гр.1<0,001) и FMA (pДень14—45—Гр.1<0,001; pДень45—90—Гр.1<0,001) демонстрируют очевидный регресс симптомов на фоне проведения II этапа реабилитации, а также более выраженное клиническое и функциональное улучшение у пациентов в 1-й группе при оценке на 90-й день (pДень14—90—Гр.1—2<0,05) (см. табл. 3). Величина снижения по шкале функциональной инвалидности существенно отличается в 1-й и 2-й группах между 1-м и 90-м днями наблюдений (ΔmRSДень1—90—Гр.1= –1,5 (–2,0; –1,0) баллов и ΔmRSДень1—90—Гр.2= –1,0 (–1,0; –1,0) балла; p=0,037), а также между 14-м и 90-м днями наблюдения (ΔmRSДень1—90—Гр.1=–1,0 (–2,0; –1,0) балла и ΔmRSДень14—90—Гр.2=–0,0 (–0,0; –0,0) балла соответственно; p<0,001).
Обсуждение
Некроз является преобладающей формой гибели нейронов при снижении мозгового кровотока ниже 10—15 мл/100 г вещества ткани мозга в 1 мин, морфологически характеризующейся набуханием клеток, необратимой потерей энергозависимых клеточных ионных градиентов и цитотоксическим отеком [6]. Достоверно высокие уровни сывороточной NSE, обнаруженные у пациентов в острой фазе ишемического инсульта (по сравнению с группой лиц, сопоставимых по факторам риска цереброваскулярных заболеваний, полу и возрасту), могут быть обусловлены нарушением клеточного цитоскелета и нейрохимической экспрессией из поврежденной ткани мозга в данном случае.
Результаты проведенного исследования подтверждают, что уровень NSE в периферической крови отражает степень повреждения ткани мозга при церебральной ишемии. Об этом свидетельствуют полученные достоверные разностные сравнения в динамике раннего восстановительного периода между регрессом неврологического дефицита по шкале NIHSS и снижением концентрации NSE. Статистически подтверждена тенденция к неуклонному уменьшению значений NSE, клиническому и функциональному улучшению у пациентов в исследуемой популяции между 1-м и 90-м днями инсульта.
Наиболее интересным кажется тот факт, что уровень BDNF в популяции пациентов (исходно более низкий, чем в группе сравнения, а значит свидетельствующий о неблагоприятном прогнозе относительно восстановления утраченных функций) не только значимо увеличивается к 14-му дню, но и отрицательно коррелирует с уровнем NSEДень14. Результаты возможно интерпретировать как снижение деструктивных процессов в очаге ишемии в конце острого периода инсульта, которые, вероятно, связаны с резким повышением уровня BDNF в ответ на повреждение ткани мозга. Таким образом, данные, полученные на 14-й день инсульта, позволили говорить о благоприятном прогнозе заболевания, который подтвердился в динамике наблюдений сильной корреляционной взаимосвязью между концентрацией BDNFДень14 и уменьшением функциональной инвалидности по шкале mRS через 90 дней после нарушения мозгового кровообращения.
BDNF отвечает за реорганизацию нейронных сетей, процессы нейропластичности в периинфарктной области коры головного мозга и восстановление после инсульта, с одной стороны. С другой — следует помнить о том, что именно активно-зависимое высвобождение BDNF на фоне моторной реабилитации с многократным повторением простых и сложных двигательных актов играет ключевую роль в синаптической пластичности [13]. В 1-й группе значения BDNF статистически не отличаются от группы сравнения даже в конце раннего восстановительного периода. Это обусловлено стимуляцией первичной моторной коры по принципу двигательного научения во время проведения II этапа реабилитации. В то же время во 2-й группе уровень биомаркера на 90-й день заболевания оказался достоверно ниже, чем в группе сравнения и предыдущих точках наблюдения. Роль BDNF в восстановлении на фоне медицинской реабилитации достоверно подтверждается в проведенном исследовании результатами обследования по соответствующим шкалам, данные которого демонстрируют достоверно большее клиническое и функциональное улучшение на 90-й день наблюдения в 1-й группе, получавшей реабилитационные мероприятия на II этапе, по сравнению с пациентами, находившимися под амбулаторным наблюдением.
Следует учитывать, что исследование выполнено на небольшой когорте пациентов, с различными подтипами инсульта по критериям TOAST в бассейне исключительно средней мозговой артерии. Перечисленные факторы ограничивают возможность экстраполяции наблюдаемых ассоциаций и корреляций на общую популяцию инсульта.
Выводы
BDNF участвует в многочисленных физиологических механизмах, начиная от нейронного выживания до нейропластичности, и является важнейшим медиатором восстановления после инсульта как спонтанного, так и реабилитационного.
Кинетика высвобождения NSE при ишемическом инсульте связана с тяжестью неврологических симптомов и отражает степень повреждения ткани мозга. Динамика NSE в точках наблюдения говорит о том, что данный маркер может быть полезен в качестве дополнительного параметра мониторинга на этапах медицинской реабилитации, отражающего состояние плазматической мембраны нервных клеток и гематоэнцефалического барьера.
Совокупная оценка концентраций NSE и BDNF в сыворотке крови пациентов с острым ишемическим инсультом может быть использована в качестве потенциального инструмента в руках клиницистов для выбора эффективной тактики реабилитационных подходов и прогнозирования функциональных исходов инсульта.
Соглашение №18-15-00082 173.
Статья подготовлена в рамках выполнения гранта РНФ «Разработка научных основ роботизированной нейромиореабилитации».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.