Ишемический инсульт (ИИ) — одна из ведущих причин смертности и инвалидизации во всем мире. На сегодняшний день основным методом лечения этого заболевания является ранняя реперфузионная терапия, которая ограничена узким терапевтическим окном, составляющим 4,5 ч для внутривенного тромболизиса [1] и 6 ч для эндоваскулярных методик [2]. Однако даже при своевременном применении этих технологий с последующим использованием антиагрегантов, антикоагулянтов и ранней нейрореабилитации у большинства пациентов сохраняется пожизненный неврологический дефицит в связи с формированием зоны инфаркта мозга. Эффективных методов лечения ИИ в позднем восстановительном периоде не существует. Также не существует ни одного нейропротективного препарата, эффективность которого была бы достоверно подтверждена в многоцентровых рандомизированных клинических исследованиях [3, 4]. В связи с этим остается актуальной разработка новых подходов к терапии И.И. Одним из таких подходов могут стать регенеративные клеточные технологии. В последние годы были получены данные о положительном терапевтическом эффекте трансплантации различных типов стволовых клеток (СК) как на экспериментальных моделях у животных, так и при клинических испытаниях.

Настоящая статья является первой частью обзора литературы, в котором обобщены имеющиеся на сегодняшний день данные об использовании различных типов СК при лечении экспериментального инфаркта мозга, их преимуществах, недостатках, возможных побочных эффектах и способах трансплантации. Вторая часть обзора будет посвящена результатам международных клинических исследований, а также правовым аспектам использования клеточных технологий на территории Российской Федерации.

На данный момент в экспериментальных исследованиях опробован широкий спектр СК, показавших эффективность при клеточной терапии экспериментального инфаркта мозга. Такими клетками являются эмбриональные СК (ЭСК) и полученные из них прогениторные клетки, коммитированные к дифференцировке в нейроны, глию или иные клетки, индуцированные плюрипотентные СК (ИПСК) и их производные, нейральные СК (НСК), мезенхимальные СК (МСК), а также гемопоэтические СК (ГПСК), эндотелиальные прогениторные клетки, прогениторные клетки сосудов и другие типы С.К. Каждый из типов СК имеет специфические особенности, преимущества и недостатки, касающиеся механизма действия, эффективности и побочных эффектов.

ЭСК являются плюрипотентными СК, обладающими неограниченной способностью к самовоспроизведению и дифференцировке in vitro и in vivo в клетки-производные всех трех зародышевых листков (эктодерма, эндодерма и мезодерма), т. е. практически в любые клетки организма. ЭСК получают путем выделения первичной культуры из внутренней клеточной массы бластоцисты на стадии развития эмбриона млекопитающих 5—7 сут до момента его имплантации [5].

Получение и использование ЭСК человека в клинической медицине связано с рядом биоэтических и правовых проблем. Кроме того, в экспериментальных исследованиях были неоднократно показаны образование массивных тератокарцином [6], иммунологическое отторжение, генетические и эпигенетические изменения [7] после трансплантации ЭСК. Однако ЭСК можно дифференцировать методами современной клеточной биологии в тканеспецифичные СК, трансплантация которых в отличие от недифференцированных ЭСК может быть безопасной и эффективной. Было показано [8], что нейральные прогениторные СК (НПСК), полученные из ЭСК, способны вызывать уменьшение неврологического дефицита у крыс с моделью инфаркта мозга без образования тератом и индуцирования канцерогенеза. Также есть данные [9], что около 30% НПСК после их внутримозговой трансплантации способны дифференцироваться в нейроны с подтвержденной биоэлектрической активностью.

Плюрипотентные клетки можно получить не только из эмбрионов, но и путем репрограммирования соматических клеток взрослого организма, минуя тем самым биоэтические и иммунологические препятствия. Такие С.К. получили название ИПСК. Впервые они были получены сравнительно недавно, в 2006 г., японским исследователем S. Yamanaka [10], за что ученый был удостоен в 2012 г. Нобелевской премии по физиологии или медицине. ИПСК первоначально были получены из фибробластов, однако на текущий момент можно также использовать эпителиоциты, кератиноциты, клетки пуповинной крови, мононуклеары периферической крови и МСК [11]. Репрограммирование клеток осуществляется путем трансдукции генами, кодирующими транскрипционные факторы (в первом исследовании S. Yamanaka было 4 фактора: Oct4, Sox2, cMyc и Klf4), при экспрессии которых соматическая клетка приобретает свойства плюрипотентности. Перенос в соматическую клетку генетического материала чаще всего осуществляется при помощи ретровирусного или лентивирусного вектора, который способен встраиваться в геном соматической клетки и доставлять таким образом нужные исследователям гены. Хотя данный метод является простым в применении и достаточно эффективным, он может быть непригоден для клинического применения ИПСК в связи с риском мутагенеза из-за вмешательства в геном и потенциальной онкогенности cMyc и Klf4. В последние годы были предложены альтернативные векторы [12, 13], которые могут доставлять генный материал в соматическую клетку без интеграции в ее ДНК. ИПСК, полученные с помощью таких протоколов, могут быть потенциально использованы в клинических исследованиях на человеке.

К сожалению, трансплантация ИПСК в недифференцированном виде в головной мозг животных с моделью инфаркта мозга вызывает образование тератокарцином, как и в случае введения ЭСК [14]. Стоит отметить, что при этом некоторая часть трансплантированных ИПСК все же может дифференцироваться в нейробласты и даже в зрелые нейроны. Способность ИПСК дифференцироваться в любую соматическую клетку донора in vitro и in vivo является их неоспоримым преимуществом. В ряде экспериментальных работ [15—17] было показано, что внутримозговая трансплантация ИПСК, предифференцированных in vitro в нейрональные прогениторные клетки, вызывала восстановление неврологического дефицита, уменьшение размеров инфаркта мозга, при этом НСК мигрировали в перифокальную зону некроза и часть из них подвергалась дальнейшей дифференцировке в зрелые нейроны и глиальные клетки. Помимо замещения погибших нейронов реципиента, трансплантированные клетки были способны активировать эндогенные регенеративные механизмы: в зоне ишемии увеличивалось присутствие нейрональных и сосудистых прогениторных клеток реципиента, т. е. стимулировался нейро- и неоангиогенез [18]. К недостаткам ИПСК стоит отнести высокую стоимость технологии и длительный (до 1,5 мес) протокол их получения, что создает препятствия для использования данных типов СК в остром периоде ИИ и требует заблаговременного создания банка персонифицированных линий ИПСК.

Во взрослом мозге млекопитающих, в том числе человека, в субвентрикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков и в зубчатой извилине гиппокампа находится пул НСК, которые могут дифференцироваться в прогениторные нейральные и глиальные клетки. Благодаря этому в головном мозге на протяжении всей жизни продолжаются процессы нейро- и глиогенеза [19]. Уровень нейрогенеза может повышаться или снижаться в зависимости от условий окружающей среды, возраста, соматических заболеваний и приема лекарственных препаратов [20]. Известно [21], что при ИИ эндогенные НСК начинают активнее пролиферировать и мигрируют в зону ишемического повреждения. Однако активность этого процесса сильно снижается с возрастом [22], к тому же только малая часть эндогенных НСК дифференцируется в зрелые нейроны. Очевидно, что эндогенных механизмов нейрорегенерации недостаточно, чтобы полностью восстановить утраченную нервную ткань на месте инфаркта мозга. Было показано [23], что трансплантация экзогенных НСК, полученных из фетального мозга, улучшает функциональное восстановление у грызунов с моделью И.И. Часть трансплантированных НСК сохраняет жизнеспособность в головном мозге в течение длительного срока и дифференцируется в направлении нейронов. В ответ на трансплантацию НСК происходит активация эндогенных процессов нейрогенеза, подавляется воспалительная реакция и уменьшаются размеры инфаркта мозга [24, 25]. НСК стимулируют также аксональный транспорт, спрутинг аксонов и образование новых аксональных и дендритных синаптических связей, что может быть одним из объяснений восстановления ряда функций у экспериментальных животных [26]. В исследованиях [27] не было получено данных об онкогенной трансформации НСК или стимуляции канцерогенеза. Таким образом, НСК могут быть кандидатом для клеточной терапии ИИ у человека. Их недостатки связаны со способом получения НСК (из эмбрионального или фетального мозга), что поднимает серьезные этические вопросы.

МСК, имеющие и другие названия (мезенхиальные стромальные клетки, мультипотентные прогениторные клетки), являются мультипотентными СК, которые можно выделить из множества разных органов и тканей: костного мозга, плаценты и пуповины, жировой ткани, пульпы зуба, крови, стромальной ткани паренхиматозных органов и других источников [28, 29]. Одной из самых важных особенностей МСК является их низкая иммуногенность, способность модулировать иммунный ответ и воспаление [30]. Это свойство МСК не только может быть использовано для терапии аутоиммунных заболеваний [31], но и делает возможным как аутогенную, так и аллогенную и даже ксеногенную трансплантацию [32, 33]. Последнее: высокая доступность, сравнительная низкая стоимость получения первичной культуры без биоэтических проблем, легкость и скорость культивирования in vitro являются важными преимуществами МСК перед другими типами СК, особенно в случае терапии ИИ в остром периоде [34]. В экспериментальных и клинических исследованиях [35] не было также выявлено формирования опухолей или онкогенной трансформации трансплантированных клеток.

Терапевтические эффекты МСК были широко исследованы в экспериментальных работах [33, 34, 36—38] на животных моделях ишемии головного мозга. Было показано, что трансплантация МСК уменьшает моторный дефицит и улучшает выполнение поведенческих тестов. Некоторые авторы также выявляли уменьшение размеров зоны инфаркта мозга.

Однако, несмотря на большое количество исследований, на сегодняшний день нет единого мнения относительно механизмов терапевтического действия МСК. Этот тип СК имеет низкий потенциал к трансдифференцировке в нейральном направлении [39], поэтому прямой замещающий эффект маловероятен. В то же время существует множество данных [40—43], свидетельствующих, что МСК при внутримозговом введении и системной трансплантации выделяют различные биоактивные вещества, которые стимулируют ангиогенез, синаптогенез, подавляют воспаление и процесс апоптоза, обладают нейропротективным действием. В некоторых работах [37, 44—47] получены результаты, свидетельствующие о стимуляции пролиферации эндогенных СК в СВЗ после трансплантации МСК. Этот эффект может быть обусловлен преимущественной миграцией МСК в нейрогенные зоны мозга и непосредственным взаимодействием с нейральными прогениторами реципиента, но может быть опосредован и воздействием секретируемых пересаженными МСК факторами [37]. Для понимания механизма действия трансплантированных клеток необходима разработка максимально надежных и чувствительных методов изучения их миграции и хоуминга как при жизни, так и на гистологических срезах, что в настоящее время достижимо с помощью магнитно-резонансной томографии и конфокальной микроскопии [48].

Терапевтическая активность МСК в экспериментах с использованием животных моделей ишемии мозга может быть различными способами усилена. Например, эффекты МСК могут быть усилены их сокультивированием с корковыми нейронами перед трансплантацией [49]. Недавно было проведено исследование [50], изучающее возможность совместного применения МСК и тканевого ингибитора активатора плазминогена на экспериментальной модели инфаркта мозга, которое не только показало безопасность, но выявило уменьшение вероятности внутримозговых кровоизлияний вследствие предотвращения дисфункции эндотелия сосудов. В связи с имеющимися данными, подтверждающими безопасность и эффективность МСК в лечении экспериментального инфаркта мозга, во многих странах начаты их клинические испытания. Хотя практически во всех экспериментах была доказана безопасность МСК, эффективность данной клеточной терапии при лечении больных еще предстоит доказать [28].

Еще одним типом СК, показавшим свою эффективность в терапии инфаркта мозга в эксперименте, являются ГПСК. Они являются плюрипотентными СК, дающими начало всем лимфоидным и миелоидным клеткам крови. У взрослых индивидов пул ГПСК располагается в костном мозге, и небольшое их количество циркулирует в периферической крови; ГПСК в высоких концентрациях присутствуют в пуповинной крови [51]. При остром ИИ у человека происходит активация пролиферации ГПСК в костном мозге [52], а их концентрация в крови коррелирует со степенью функционального восстановления [53]. В экспериментальных исследованиях [54] были продемонстрированы нейропротективные свойства ГПСК и их способность подавлять воспалительные реакции. ГПСК чаще вводятся внутривенно или внутриартериально.

Данные о возможности нейрональной дифференцировки ГПСК пока противоречивы [28].

Проводились исследования [55, 56], посвященные влиянию трансплантации эндотелиальных прогениторных клеток и прогениторных клеток сосудов при экспериментальной ишемии головного мозга. Эндотелиальные прогениторные клетки после трансплантации мигрировали к очагу инфаркта мозга, усиливали процессы ангио- и нейрогенеза, увеличивали объемный мозговой кровоток, улучшали функциональное восстановление животных [55]. Прогениторные клетки сосудов при трансплантации могут способствовать регенерации и ремоделированию сосудистых сетей в зоне ишемии. Часть вводимых внутривенно или внутримышечно клеток удавалось обнаружить интегрированными в сосуды реципиента [56].

В последние несколько лет появились исследования, свидетельствующие об усилении терапевтической эффективности клеточной терапии при сочетанном введении СК разного типа. Было показано [57], что внутримозговое введение НПСК, полученных из ЭСК, в сочетании с введением прогениторных клеток сосудов крысам с моделью инфаркта мозга эффективнее улучшает функциональное восстановление животных, уменьшает размеры инфаркта мозга и стимулирует неоангиогенез, чем трансплантация только НПСК. Интересные данные были также получены при последовательной внутримозговой трансплантации МСК и НСК: МСК вводились через 1 сут, а НСК через 7 сут после моделирования острой ишемии. Такая трансплантация оказалась более эффективной, чем введение каждого типа СК по отдельности [58]. Предположительно этот феномен связан с различными механизмами действия этих типов СК и с синергией их терапевтических эффектов. Также в экспериментальных и клинических исследованиях часто сообщают о положительном клиническом эффекте после трансплантации мононуклеарных СК из костного мозга, которые представляют собой гетерогенную смесь ГПСК, МСК, прогениторных и дифференцированных клеток крови [59].

Помимо свойств самих СК, на эффективность терапии влияет и способ их трансплантации при И.И. Разработаны несколько путей введения, каждый из которых имеет свои особенности, преимущества и осложнения. Следует отметить, что наиболее оптимальный способ трансплантации до сих пор не установлен [60]. Внутримозговое стереотаксическое введение позволяет доставить клетки непосредственно в область повреждения. При таком типе введения можно доставить СК максимально адресно. Однако стоит учитывать, что в области повреждения создается неблагоприятное микроокружение, в том числе и для трансплантированных клеток. Чем ближе к поврежденной области находятся трансплантированные клетки, тем меньшее их количество выживает при введении [61].

Одной из особенностей СК является их способность мигрировать в область травмы (патотропизм). В основе этого явления лежит способность клеток двигаться по градиенту хемоаттрактантов, таких как фактор стромальных клеток-1α и другие хемокины, которые накапливаются в области повреждения [62]. Это делает возможным трансплантацию клеток по периферии очага некроза или даже в противоположное полушарие. К недостаткам внутримозговой трансплантации стоит отнести ее высокую инвазивность, дополнительную травматизацию мозга и связанные с этим побочные эффекты после нейрохирургической манипуляции и глубокого общего наркоза [63, 64]. Последнее может сильно ограничить возможность применения этого метода в остром периоде инсульта. Внутрижелудочковое и эндолюмбальное введение являются менее инвазивными, однако при инфузии в ликворные пространства возможна адгезия клеток к эпендимной выстилке желудочков мозга или центрального канала спинного мозга с развитием окклюзионной гидроцефалии [35]. Неинвазивным способом введения является интраназальная трансплантация. Показано [65], что доставленные таким путем клетки могут проникать в небольшом количестве через гематоэнцефалический барьер и мигрировать в зону повреждения, хотя механизмы такой миграции изучены недостаточно. При введении МСК интраназально не сообщалось о побочных эффектах. Наиболее перспективным для клинического применения является системное внутриартериальное и внутривенное введение. При таком типе введения СК потенциально могут оказывать также системное действие на периферии, а не только в пределах ЦНС [66]. Периферическое действие может вносить свой вклад в эффективность противоинсультной клеточной терапии. Внутривенное введение является более безопасным и общедоступным, однако большая часть клеток задерживается в паренхиматозных органах (легкие, печень, селезенка и даже почки), что уменьшает доставку трансплантата в мозг и функциональное восстановление по сравнению с внутриартериальным введением. Внутриартериальная трансплантация СК продемонстрировала наилучшую терапевтическую эффективность, обеспечивая адресную доставку СК в мозговые сосуды, минуя периферические органы [67]. Однако ряд авторов [68, 69] сообщили о риске развития эмболических инсультов при таком способе введения С.К. Тем не менее другие исследователи [48, 70—72] считают, что эмболических осложнений можно избежать при подборе оптимальной дозы, скорости и условий введения С.К. Доза и скорость введения являются важными параметрами для всех способов введения С.К. Эти параметры подбираются экспериментально, индивидуально для каждого типа клеток и массы тела реципиента.

Таким образом, на экспериментальных моделях инфаркта мозга было неоднократно показано, что трансплантация МСК, ГПСК, НСК (полученных из фетального мозга, ЭСК или ИПСК) оказывает положительный терапевтический эффект: улучшаются выживаемость животных и их функциональное восстановление, уменьшается размер инфаркта мозга. При этом серьезных побочных эффектов после трансплантации данных типов СК зафиксировано не было. Результаты экспериментальных исследований позволили неврологам и клеточным биологам во всем мире активно начать клинические исследования терапии СК при ИИ у больных.

Во второй части обзора будут представлены результаты соответствующих международных исследований и рассмотрены правовые основы и перспективы развития клеточных технологий в Российской Федерации.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг., тема 0518−2018−0005 Государственного задания, тема НИР АААА-А17−1170- 1271−00330−0.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: dadnam89@gmail.com